Em formação

Clonando um gene codificador em um vetor de não expressão

Clonando um gene codificador em um vetor de não expressão


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Faz algum sentido clonar um gene CODING em um vetor NÃO-expressão? fazer isso nos dará apenas várias cópias do gene, enquanto poderíamos executar PCR em vez disso (digamos que conhecemos a sequência do gene)


Em princípio, você pode amplificar qualquer gene com PCR e então cloná-lo em um vetor de sua escolha. No entanto, muitas vezes não é tão fácil. A maioria das coisas pode ser feita com vetores de expressão, mas às vezes é mais fácil clonar uma sequência primeiro e depois subclone-la.

Algumas sequências são difíceis de amplificar, especialmente quando ficam longas ou muito longas. Amplificar 2,5 kb pode ser complicado, digerir e subclonar tal peça pode ser mais fácil. Além disso, os rendimentos de PCR podem ser baixos, enquanto você obtém muito DNA de um miniprep.

Você pode querer introduzir sites de reconhecimento de enzimas de restrição adicionais (um pode ser feito facilmente via PCR, mas mais uma vez é complicado), linker ou tags adicionais, que não estão presentes em todos os vetores de expressão. Então é mais fácil simplesmente fazer uma primeira etapa de clonagem no vetor de não expressão e, em seguida, inserir a inserção completa no vetor de expressão.


Processo de clonagem de genes

A clonagem de genes é o processo de fazer cópias múltiplas e idênticas de um determinado pedaço de DNA. Usando essa técnica, podemos isolar e clonar uma única cópia de um gene ou segmento de DNA em um número indefinido de cópias, todas idênticas.

A clonagem de genes ou clonagem molecular é um termo genérico que abrange uma série de protocolos experimentais que levam à transferência de informações genéticas de um organismo para outro.

Etapas da clonagem de genes:

A seguir estão as etapas de clonagem de genes:

2. Corte de DNA em locais específicos

3. Amplificação do gene de interesse

4. Inserção de DNA recombinante na célula hospedeira

5. Seleção de recombinantes

Fig: Etapas da clonagem de genes

Isolamento de material genético (DNA)

Para a clonagem molecular, tanto o DNA de origem que contém a sequência alvo quanto o vetor de clonagem devem ser consistentemente cortados em fragmentos discretos e reproduzíveis. Vários métodos, como cisalhamento mecânico, digestão de restrição, síntese de c dna, síntese química, etc., são úteis no isolamento dos fragmentos de DNA.

Corte de DNA em locais específicos

O vetor e o fragmento de DNA alvo podem ser digeridos separadamente com a mesma enzima de restrição. O vetor digerido e o fragmento de DNA alvo são então incubados juntos na presença da enzima DNA ligase. A incubação resulta na ligação de dois tipos de DNA por ligações fosfodiéster entre eles. Assim, as estruturas desoxirribose-fosfato da molécula do vetor e o fragmento de DNA alvo se ligam covalentemente, formando uma molécula de DNA recombinante.

Outra possibilidade neste experimento é a junção das extremidades pegajosas da própria molécula do vetor, formando uma molécula de DNA vetorial circular que está sem a molécula de DNA estranha. O tratamento do vetor digerido com fosfatase alcalina ou o uso de diferentes enzimas de restrição supera a possibilidade acima.

Amplificação do gene de interesse usando PCR

Este é o processo de multiplicação seletiva de uma região específica da molécula de DNA. A amplificação é obtida por um método especial denominado reação em cadeia da polimerase. O princípio subjacente à técnica é aquecer a molécula de DNA de fita dupla a uma temperatura alta para que as duas fitas de DNA se separem em moléculas de DNA de fita simples. Essas moléculas de DNA de fita simples requerem primers feitos de 10-18 oligonucleotídeos para a hibridização de cada fita da dupla hélice. Também requer a enzima DNA polimerase. É uma enzima termoestável também denominada como Taq polimerase. O ciclo de amplificação por PCR envolve três etapas principais - desnaturação, anelamento e extensão. No final do processo, resulta na produção de 2n número de moléculas de DNA para n número de ciclos completados.

Inserção de DNA recombinante na célula hospedeira:

O próximo passo em um experimento de DNA recombinante requer a absorção do DNA clonado por E. coli. Depois de preparar o r-DNA de um vetor, ele entra em um hospedeiro adequado para a expressão de DNA estranho. O processo de introdução de DNA purificado na célula bacteriana é denominado transformação.

Para E. coli, um dos métodos de transformação requer que as células sejam tratadas com alta temperatura e cloreto de cálcio. As cepas de E. coli possuem enzimas de restrição, portanto, degradam o DNA estranho. Para escapar da degradação, as células em crescimento exponencial são pré-tratadas com cloreto de cálcio a baixa temperatura. O DNA do vetor entra nas células bacterianas.

Seleção de Recombinantes

Após a inserção do DNA recombinante na célula hospedeira, o próximo passo é a seleção ou identificação dos recombinantes. Os métodos usados ​​para fazer isso consideram a expressão na não expressão de certos caracteres, especialmente o gene de resistência a antibióticos (por exemplo, gene de resistência à ampicilina) no vetor plasmídeo. O marcador selecionável geralmente fornece resistência contra substrato que, quando adicionado ao meio de cultura, inibe o crescimento de células ou tecidos normais em cultura, conseqüentemente, apenas os tecidos transformados irão crescer.

O método mais simples de identificação é cultivar células hospedeiras transformadas (com gene de resistência à ampicilina) em meio contendo ampicilina. Isso permitiria que as células contendo este plasmídeo transformado crescessem e formassem colônias. Existem outros métodos para detecção de recombinantes baseados no fato de que o fragmento de DNA clonado perturba a sequência codificadora do gene. Isso é denominado como inativação por inserção.

Inativação de inserção do gene marcador

Neste método, a inativação de um gene marcador do vetor pela adição do DNA estranho é útil para distinguir os recombinantes dos não recombinantes.

Vamos considerar um plasmídeo contendo genes resistentes a dois antibióticos diferentes, ou seja, ampicilina e tetraciclina. O vetor pBR322 simples ou normal possui dois genes marcadores de resistência a antibióticos (isto é, ampicilina e tetraciclina).

A inserção do fragmento de DNA alvo no gene de resistência à ampicilina resulta na inativação desse gene. Assim, as células hospedeiras com esse plasmídeo recombinante serão sensíveis à ampicilina, mas resistentes à tetraciclina. Estas células hospedeiras morrerão quando crescidas em meio contendo ampicilina, mas crescerão em meio contendo tetraciclina. Os vetores autoligados (isto é, não recombinantes) cresceriam em meio contendo ampicilina e tetraciclina sendo resistentes a eles.

Método de triagem visual:

Outro exemplo semelhante que envolve a inativação por inserção é o do gene lac z de E. coli. Também é denominado como seleção branco azul. Este é o método mais rápido de rastreio para seleção que se baseia na ação de um produto gênico (isto é, enzima) em uma substância cromogênica (na hidrólise produz o produto de cor azul) para distinguir entre os recombinantes e os não recombinantes.

Este método pode ser bem explicado com a ajuda do vetor pUC. Este vetor contém um gene marcador denominado como gene marcador lac z que codifica uma enzima denominada beta-galactosidase. A enzima atua sobre uma substância incolor X-gal e a hidrolisa em um produto de cor azul. A adição de DNA estranho ao gene lac z leva à sua inativação. Assim, resulta na formação de um vetor recombinante.

Os não recombinantes com vetor simples formarão colônias azuis no meio nutriente devido à atividade do gene lac z funcional, onde os recombinantes formarão colônias brancas conforme a ação do gene lac z é perdida no vetor recombinante.

Fig: Processo de clonagem de genes (seleção / triagem de recombinantes)

Morfologia da placa

É um método importante de rastreio de fagos recombinantes. O bacteriófago lambda contém um gene CI que codifica uma proteína CI (uma proteína repressora). Esta proteína repressora de CI é responsável por estabelecer o ciclo de vida lisogênico no hospedeiro E. coli células.


PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

Estratégia Geral de Clonagem -

Um método amplamente utilizado para gerar genes recombinantes envolve amplificar o gene de interesse por PCR e, em seguida, ligar o produto de PCR ao vetor plasmídeo desejado. Para facilitar este processo, os iniciadores de PCR podem ser desenhados para incorporar locais de restrição apropriados nas extremidades do DNA alvo para digestão e ligação subsequentes no vetor de escolha. A adição de sítios de restrição por PCR durante a amplificação de uma sequência genética permite a inserção de virtualmente qualquer gene alvo em qualquer vetor [12].

Esta estratégia de clonagem foi usada para criar um M. sexta GFP-His6-serpin cDNA construto inserido no vetor de expressão pGFPuv (Clontech, Palo Alto, CA) (Fig. 1UMA) Especificamente, um M. sexta-clone de cDNA mutagenizado de serpin1B funcional (A343K) previamente projetado com um His6 tag no terminal N da proteína foi usada como um modelo na síntese de PCR (Fig. 1B) [9]. Os iniciadores de PCR foram concebidos para adicionar um sítio EcoR1 3 '(fita codificante) e um sítio SacI 5' (fita codificante) ao His6sequência -serpin (Fig. 2UMA) Tanto o dele6O produto de PCR -serpin e o vetor de expressão pGFPuv foram digeridos por SacI e EcoRI. O dele6O produto de PCR -serpin foi então inserido na extremidade 3 'da sequência de codificação de GFP usando o local de multi-clonagem 5' do vetor (Fig. 1C) A proteína quimérica final carrega GFP na extremidade N-terminal, um His6 etiqueta de afinidade flanqueada por resíduos de glicina flexível no meio da construção e o cDNA da serpina na extremidade C-terminal (Fig. 1D).

Gerenciamento de Sequência -

Um programa de computador foi usado ao longo do curso para documentar e manipular sequências de DNA, incluindo a geração de mapas de restrição e a tradução de sequências de DNA em sequências de proteínas. Enquanto muitos programas de gerenciamento de seqüência estão disponíveis, o programa shareware DNA Strider 1.1 (Macintosh) foi utilizado [13]. Em muitos casos, sequências completas de plasmídeos podem ser baixadas de sites comerciais e manipuladas por esses programas. O uso de tal programa de gerenciamento de sequência de DNA, embora não seja obrigatório, familiariza os alunos com a manipulação de DNA e gerenciamento de banco de dados. Os programas de gerenciamento de sequência são extremamente úteis no desenvolvimento de estratégias iniciais de clonagem.

Organização da Série de Laboratório-

Nossos alunos trabalharam individualmente, com cada um realizando seu próprio conjunto de reações ao longo do semestre. No entanto, eles se envolveram em uma grande colaboração e apoio, compartilhando materiais, discutindo opções experimentais, coordenando o uso de gel de agarose, etc. Um membro do corpo docente estava presente durante todo o período de laboratório, fornecendo orientação e intervenção apropriada. O período de laboratório foi um bloco de 3 horas, uma tarde por semana. Em várias ocasiões, os alunos foram solicitados a realizar breves preparações (por exemplo. inocular culturas) na tarde antes de nossa sessão de laboratório. Um cronograma proposto de exercícios de laboratório ao longo do semestre é mostrado na Tabela I.

Semana um

Transformação-

Um M. sexta serpin cDNA serpin1B (A343K) foi previamente clonado no plasmídeo de expressão pQME-60, que adicionou DNA que codifica um His6 etiqueta de epítopo para a extremidade N-terminal da proteína para criar o plasmídeo serpin1B (A343K) [9]. Em princípio, qualquer plasmídeo, isolamento de DNA genômico ou biblioteca de cDNA poderia servir como molde para PCR no início deste experimento. Nossos alunos realizaram transformações separadas do plasmídeo serpin1B (A343K) e pGFPuv em Escherichia coli- células competentes. Durante todas as manipulações genéticas, um estábulo E. coli cepa de clonagem sem a recA gene de recombinação, tal como XL-1 Blue (Stratagene, La Jolla, CA) ou DH5α (Invitrogen, San Diego, CA), foi usado. Células competentes de grau de subclonagem produzindo -1 x 106 transformantes por micrograma de DNA foram obtidas de fontes comerciais. O protocolo de transformação recomendado pelo fabricante de células competente levou menos de 2 h, e as células resultantes foram plaqueadas em placas contendo ampicilina. Essas placas foram mantidas a 37 ° C durante a noite (12-16 h) para permitir o crescimento de colônias bacterianas suficiente. No dia seguinte à transformação, os alunos voltaram ao laboratório e removeram as placas da incubadora, anotaram os resultados e armazenaram as placas a 4 ° C pelo período intermediário. Os alunos foram instruídos a calcular o número de colônias por micrograma de DNA para suas reações.

Um controle negativo (sem DNA de plasmídeo) e um controle positivo (DNA de plasmídeo de uma fonte comercial, por exemplo. pUC18) foram incluídos para a transformação. Nossos alunos usaram solução de Luria-Bertani (LB) / ágar autoclavada quente pré-preparada e placas vertidas no início do período de laboratório. Uma quantidade adequada de estoque 1000 × de solução de ampicilina (0,1 g de ampicilina / ml de solução de etanol / água a 50%, armazenada a -20 ° C) foi adicionada ao ágar líquido antes de vazar.

Semana Dois

Preparação de plasmídeo -

Na tarde anterior ao segundo período de laboratório, os alunos começaram pequenas (2 ml) culturas de caldo de ampicilina LB de uma única colônia em suas placas de transformação. A cultura foi incubada a 37 ° C com agitação (225 rpm) durante a noite. Os alunos realizaram esta inoculação em ∼15 min, alternativamente, o corpo docente ou o assistente de ensino podem iniciar essas culturas. A incubação das culturas não deve exceder 24 horas para garantir que os plasmídeos sejam produzidos em células saudáveis.

Durante a sessão de laboratório, o DNA de plasmídeo adequado para PCR foi gerado a partir dessa cultura usando um kit de isolamento de DNA miniprep (disponível na Qiagen a um custo de cerca de US $ 1 por preparação de plasmídeo). O procedimento de miniprep deve levar o aluno em média ∼1 he produzir 50 μl de plasmídeo purificado a uma concentração de ∼200 ng / μl.

Resumos de restrição -

A fim de confirmar que a preparação do plasmídeo foi bem-sucedida, foi realizada uma digestão de restrição de diagnóstico. Os alunos receberam um mapa do plasmídeo e foram solicitados a projetar uma digestão de restrição que desse um padrão de fragmento característico do plasmídeo correto. Por exemplo, digerir o vetor pGFPuv com a enzima SacI ou EcoRI deve render um único fragmento de DNA linearizado de 3,3 kb conforme visualizado em um gel de agarose. Essas enzimas e protocolos de digestão foram obtidos de fontes comerciais (por exemplo. New England Biolabs, Promega). Geralmente, 200 ng de DNA de plasmídeo purificado foram digeridos em um volume total de 10 μl. A digestão pode ser facilmente ampliada para digerir grandes quantidades de DNA. O volume de enzima necessária foi calculado usando a atividade de cada preparação de enzima conforme indicado pelo fabricante. Uma incubação de 30 minutos é geralmente suficiente para que uma quantidade apropriada de enzima corte especificamente a maior parte do DNA. Se desejado, digestões mais complexas podem ser realizadas utilizando mais de uma enzima simultaneamente. Se essa opção for escolhida, os alunos devem selecionar um tampão de digestão e condições de reação que sejam compatíveis com todas as enzimas. Os fragmentos de DNA digeridos foram armazenados a -20 ° C até a semana seguinte.

Semana Três

Visualização do fragmento de DNA por eletroforese através de um gel de agarose -

Os géis E de agarose (Invitrogen) fornecem um método seguro e rápido para visualizar os fragmentos de DNA. Os géis não requerem tampão de eletroforese e funcionam em menos de 45 min. O gel de agarose contendo o fluoróforo brometo de etídio é selado entre duas placas de plástico, minimizando assim a exposição do aluno a este carcinógeno. Além disso, nenhum buffer de carregamento de DNA é necessário, agilizando o processo de carregamento. Alternativamente, um gel de agarose padrão que é derramado pelos alunos e corado de forma apropriada para visualizar o DNA pode ser usado. Após a eletroforese, os fragmentos de DNA foram visualizados usando uma fonte de luz ultravioleta. Um exemplo de 1,2% de E-gel em um transiluminador é mostrado na Fig. 3. Aproximadamente 200 ng de DNA foram carregados em cada pista (equivalente a cerca de 1 μl de preparação de DNA). Esta quantidade de DNA deu uma banda facilmente aparente. Quantidades maiores de DNA podem ser necessárias para ver várias bandas ou fragmentos de DNA menores (menos de 1,0 kb de comprimento). O DNA linearizado foi comparado com uma escada de DNA (Sigma ou New England Biolabs) para verificar se um fragmento do comprimento correto foi obtido. O DNA de plasmídeo não cortado produz um padrão de bandas de DNA múltiplas que não correspondem diretamente ao comprimento verdadeiro do plasmídeo devido ao superenrolamento diferencial do DNA do plasmídeo circular, este foi um controle útil para determinar se os DNAs experimentais foram totalmente cortados.

Semanas Três e Quatro

Projeto de primer -

A fim de amplificar o His6-serpin cDNA sequência do plasmídeo serpin1B (A343K), iniciadores de PCR personalizados foram projetados. Com a ajuda dos instrutores, os alunos desenvolveram e solicitaram primers de PCR que introduziam locais de restrição nas extremidades do cDNA. Os primers consistiam em duas regiões distintas: as extremidades 3 'dos ​​primers são complementares ao cDNA e serviram como molde para a extensão da polimerase. As extremidades 5 'dos ​​iniciadores não são complementares ao cDNA da serpina e permitiram a introdução de sequências de DNA específicas no final do produto de PCR (ver Fig. 2UMA).

O primer "frontal" foi projetado para introduzir um novo local SacI no produto de amplificação de cDNA da serpina de PCR, que permite a ligação ao local SacI no vetor pGFPuv (ver Fig. 2B) A extremidade 3 'do primer consistia em uma região complementar à extremidade 5' da fita de codificação do His6-serpin cDNA. o Tm desta interação do primer com o molde de DNA deve ser ∼60 ° C ou superior. Uma regra geral é que um par G-C complementar contribui para o Tm por cerca de 4 ° C, enquanto um par A-T contribui para o Tm em cerca de 2 ° C. A região não complementar 5 'do iniciador incluiu a codificação de DNA para um resíduo de glicina a montante do His6 tag para permitir que o domínio GFP se oriente independentemente do His6 tag e a proteína serpina. A adição da glicina também eliminou o códon de parada endógeno da GFP, permitindo a tradução da sequência de serpina GFP de comprimento total. Finalmente, a extremidade 5 'do primer foi projetada para reconstruir os últimos códons do gene GFP, adicionar um sítio SacI e uma saliência de DNA para permitir a clivagem do sítio SacI no gene His6-serpin PCR produto. As enzimas de restrição freqüentemente requerem uma saliência de DNA para clivar eficientemente o sítio de restrição [14].Mais informações sobre saliências de DNA apropriadas para enzimas de restrição individuais estão disponíveis em New England Biolabs (Beverly, MA www.neb.com).

O primer de PCR "traseiro", projetado para se ligar à extremidade 5 'da sequência de fita não codificadora de cDNA da serpina, introduz um sítio EcoR1 para o cDNA da serpina (ver Fig. 2C) A extremidade 3 'deste primer consistia em uma sequência complementar ao cDNA da serpina. Esta seção complementar terminou no códon de parada do cDNA da serpina. A porção não complementar deste primer (extremidade 5 ') adicionou um códon de parada adicional para assegurar o término da tradução e continha o sítio de restrição EcoRI introduzido. Finalmente, a extremidade 3 'do primer "traseiro" continha uma saliência de DNA multibase além do sítio de restrição EcoRI.

Na última década, o custo dos primers de oligonucleotídeo de DNA diminuiu drasticamente e agora os primers podem ser encomendados online de empresas como a Integrated DNA Technologies ou Life Technologies e chegar em menos de 3 dias a um custo de aproximadamente

Reconhecimentos

Agradecemos a Ishan Dillon, Lacey Verkamp, ​​Monica Silver, Kate Ware, Abigail Gay, Kjersti Knox, Lauren Phillips e Zachary Seymour por seu entusiasmo, diligência e perseverança durante o semestre. A generosa doação do His6-serpin cDNA de Mike Kanost e Haobo Jiang é muito apreciado. Além disso, agradecemos a Melissa Foster, William Harvey, o Howard Hughes Medical Institute (HHMI) e os Departamentos de Química e Biologia do Earlham College, pelo fornecimento de materiais e equipamentos usados ​​no decorrer da sequência laboratorial. J. A. B. gostaria de agradecer ao HHMI e aos membros do Earlham College por tornar possível uma experiência de ensino de pós-doutorado agradável.

.50 / base de DNA para uma preparação de 100 nmol. Portanto, os primers foram projetados e solicitados online em um período de laboratório. Eles chegaram antes da próxima reunião semanal. Os primers liofilizados foram ressuspensos por vórtice a uma concentração de 100 μ M em água de grau de biologia molecular e, posteriormente, aliquotados e armazenados a -20 ° C.

Semana 5

Amplificação por PCR da sequência alvo -

A amplificação da sequência alvo por PCR foi realizada utilizando a enzima termofílica Pfu Turbo (Stratagene), que tem uma fidelidade maior do que muitas outras enzimas PCR tradicionais (por exemplo. Polimerase Taq), reduzindo a frequência de erros no produto de amplificação. Um protocolo detalhado para PCR utilizando Pfu turbo pode ser obtido na Stratagene. Para executar a reação, 100 ng de DNA de plasmídeo, 100 ng de cada iniciador, 5 μl de 10 × Pfu mistura de tampão, dNTPs a uma concentração de 500 n M cada, água desionizada a 50 μl e 1 μl de enzima (2,5 U) foram misturados em um tubo de PCR de parede fina. Um único ciclo consistia em uma fase de desnaturação a 95 ° C por 2 min, uma fase de recozimento a 67 ° C por 30 s e, finalmente, uma fase de extensão a 72 ° C por 3 min. Esta sequência foi repetida por 25 ciclos. As seguintes considerações devem ser levadas em consideração ao projetar um ciclo de PCR. O tempo de extensão da polimerase deve ser de pelo menos 2 min / kb do produto de PCR. A temperatura de recozimento deve ser 5 ° C mais baixa do que o primer mais baixo Tm. Se um termociclador for usado sem uma tampa aquecida, 30 μl de óleo mineral devem ser colocados no topo de cada reação para evitar a evaporação da mistura de reação. Como o tempo de execução da PCR pode levar de 3 a 4 horas, as reações podem ser iniciadas durante o período de laboratório e o termociclador pode ser programado para manter as reações a 4 ° C ou 10 ° C durante a noite. Os produtos de PCR podem então ser armazenados por longos períodos a −20 ° C.

Semana 6

Digestão de restrição do produto de PCR e vetor genético -

A presença de um produto de PCR de tamanho apropriado (1,2 kb) foi verificada por E-gel (ver Fig. 3). A concentração do produto de PCR pode variar muito, portanto, uma quantidade relativamente grande (5 μl) e pequena (1 μl) da PCR deve ser carregada no gel. A inserção de PCR desejada deve ser o principal produto visível no gel.

Na preparação para a inserção direcional do fragmento de PCR no vetor pGFPuv, o produto de PCR e o vetor foram cortados com SacI e EcoR1. Esta digestão produz extremidades de fita simples “pegajosas” complementares que facilitam a ligação da inserção no vetor linearizado. As digestões de restrição usando duas enzimas diferentes podem ser realizadas simultaneamente se ambas as enzimas estiverem ativas no mesmo tampão. Os resultados das digestões de restrição do vetor e do produto de PCR foram analisados ​​em um E-gel para garantir que eles deram fragmentos de DNA com os comprimentos esperados. Uma vez que os locais de restrição estão próximos do final da inserção amplificada, a mobilidade deste produto de PCR não se altera de forma apreciável após a digestão. Da mesma forma, o vetor digerido se assemelhava muito ao vetor cortado isoladamente, uma vez que apenas um pequeno pedaço de DNA (menos de 100 bases) foi excisado do vetor. Esta etapa foi usada para garantir que nenhum vetor não cortado permanecesse e que não houvesse digestão não intencional no vetor e no produto de PCR. Após a digestão, o DNA foi armazenado a -20 ° C. As extremidades “pegajosas” do DNA de fita simples são especialmente sensíveis à degradação, portanto, reagentes livres de nuclease foram usados ​​durante todas as manipulações e foi tomado cuidado para evitar a contaminação das reações. Finalmente, uma preparação de vetor digerido apenas com EcoR1 também foi produzida desta maneira para uso como um controle positivo na reação de ligação subsequente.

Semana 7

Purificação de coluna de rotação de grandes fragmentos de DNA -

Grandes fragmentos de DNA produzidos por digestão de restrição do produto de PCR na semana anterior foram purificados por um protocolo de coluna de rotação para remover contaminantes. Fragmentos grandes de DNA foram recuperados rapidamente (em menos de 30 min) em alta pureza usando colunas de purificação de rotação de PCR Qiaquick de acordo com o protocolo do fornecedor (Qiagen, Valencia, CA). Esta etapa foi usada para remover enzimas, pequenos fragmentos de DNA (menos de 100 bases) e componentes indesejáveis ​​do tampão. Em muitos esquemas de clonagem, o uso de uma coluna de purificação de DNA pode fornecer uma alternativa rápida às técnicas de purificação em gel.

Tratamento do vetor com fosfatase intestinal alcalina de bezerro -

Após a digestão de restrição, o vetor foi tratado com fosfatase alcalina intestinal de bezerro (CIAP Promega, Madison, WI) para prevenir a auto-ligação na etapa subsequente. O CIAP remove 5 ′ fosfatos do DNA. Os plasmídeos circulares se transformam e replicam com muito mais eficiência do que o DNA linearizado. Embora a digestão do vetor com duas enzimas diferentes deva evitar a ligação do vetor sozinho, o uso de CIAP evita a ligação de qualquer vetor cortado individualmente, reduzindo o número de falsos positivos nas reações de ligação subsequentes. Um excesso de CIAP foi usado em uma reação de 30 min para tratar o vetor linearizado suficiente. O vetor foi então imediatamente purificado usando uma coluna de rotação de PCR (Qiagen) para remover a enzima CIAP. O vetor purificado foi armazenado a -20 ° C até a semana seguinte. Uma alíquota do vetor digerido não tratado com CIAP foi reservada para uso como uma reação de controle na etapa de ligação. O vetor EcoRI cortado isoladamente também foi tratado com CIAP como controle.

Semana 8

Reação de ligação e transformação -

Inserção de PCR digerida purificada e vetor (tratado com CIAP) foram ligados para formar o novo plasmídeo recombinante pMAJILK contendo o GFPuv-His6sequência -serpin (ver Fig. 1). Utilizando um kit de ligação rápida recentemente introduzido (New England Biolabs), o tempo de incubação da ligação foi de 5 minutos à temperatura ambiente. Isso permitiu que a reação de ligação e a transformação fossem concluídas em um único período de laboratório. Uma razão molar de ∼2: 1 inserção para vetor foi usada na reação. Devem ser utilizados pelo menos 200 ng de vetor linearizado. Inicialmente, apenas metade do produto da ligação era usado na transformação, caso a transformação não tivesse sucesso. O inserto e o vetor não utilizados foram armazenados a −80 ° C para futuras tentativas de ligação.

As transformações dos produtos de ligação foram feitas usando preparações de células competentes de alta eficiência com eficiências de transformação de pelo menos IO6 transformantes por micrograma de DNA de plasmídeo viável. As reações de transformação foram semeadas em placas de ágar LB contendo o antibiótico apropriado. Múltiplas placas de ágar devem ser usadas para plaquear todo o volume da reação de ligação. Para verificar a eficácia da ligação, uma amostra do vetor de expressão cortado apenas com EcoR1 (sem CIAP) foi tratada com ligase e comparada com uma amostra não tratada. Para verificar a reação CIAP, uma amostra do vetor de corte EcoRI tratado com CIAP também foi incluída. Como controle negativo, uma amostra contendo o vetor tratado com CIAP e a inserção, mas não exposta à ligase, também foi transformada. Finalmente, as reações de transformação de controle positivo e negativo, conforme descrito anteriormente, foram empregadas para verificar a eficácia do procedimento de transformação.

Semana 9

Análise de restrição dos produtos genéticos -

Após o plaqueamento da reação de transformação, um pequeno número de colônias foi tipicamente observado (menos de 50). Um número limitado de colônias (~ 5) foi cultivado em culturas separadas de 2 mL contendo antibiótico e foi realizado um isolamento de DNA de plasmídeo de cada cultura. Conforme descrito anteriormente, essas culturas foram inoculadas no dia anterior à reunião do laboratório. Uma digestão de restrição de diagnóstico usando EcoRI e SacI foi realizada para avaliar se os plasmídeos isolados continham a inserção recombinante. As digestões foram armazenadas a -20 ° C até a semana seguinte.

Semana 10

Gel de agarose do diagnóstico de restrição digest -

As digestões de restrição de diagnóstico foram visualizadas em um E-gel (ver Fig. 3). A digestão de plasmídeos sem a inserção recombinante produziu apenas o vetor linearizado. A digestão dos plasmídeos recombinantes desejados a partir de colônias recombinantes resultou na observação de uma inserção liberada (1,2 kb) contendo o His6gene -serpin, bem como o vetor linearizado. Utilizando este procedimento, nossos alunos observaram consistentemente a inserção em -50% das preparações de plasmídeo. Embora a observação de um inserto nessas digestões de restrição diagnóstica indique fortemente a conclusão bem-sucedida do processo de subclonagem, os plasmídeos com inserções devem ser investigados posteriormente por sequenciamento.

Projeto e pedido de primers de sequenciamento -

Os primers para sequenciamento tinham 22-25 bases de comprimento e eram completamente complementares ao gene de interesse. A seleção do local no gene para o desenho dos primers foi baseada em vários fatores. Primeiro, o espaçamento dos primers era de aproximadamente a cada 400 bases para permitir o sequenciamento completo e preciso de toda a sequência de interesse. Em segundo lugar, a temperatura de fusão era de 55-60 ° C, com um conteúdo de GC de 45-60% de acordo com os requisitos da instalação de sequenciamento. Terceiro, os primers foram verificados para auto-escorvamento e loops usando o software da Integrated DNA Technologies (www.IDTDNA.com). Por fim, os primers foram localizados ∼50 bases a montante (3 ′) do início da seqüência a ser lida. Para alguns plasmídeos comumente usados, estão disponíveis iniciadores de sequenciamento preparados comercialmente.

Semana 11

Seqüenciamento dos plasmídeos que contêm a inserção de DNA -

Um teste crucial de um experimento de clonagem bem-sucedido é o sequenciamento da inserção do gene junto com as seções de flanco do vetor. Embora os sequenciadores automatizados sejam geralmente muito caros para pequenas faculdades de artes liberais, as sequências de DNA podem ser obtidas de forma fácil e econômica por meio de fornecedores externos. Esses fornecedores normalmente exigem que sejam enviados plasmídeo purificado e iniciador de sequenciamento. Este processo normalmente requer menos de 10–12 μl de amostra de plasmídeo purificada por coluna de spin com uma concentração de 150–200 ng / μl. Uma reação de sequenciamento típica rende cerca de 700 bases de sequências legíveis e custa US $ 9–13 por reação, dependendo da empresa. Usamos Genegateway (www.genegateway.com), que custou US $ 9 por reação e teve um tempo de resposta muito curto (menos de 3 dias).

Semana 12

Interpretação dos resultados de sequenciamento de plasmídeo -

A sequência foi transmitida do Genegateway por e-mail em um arquivo compactado que, quando expandido, forneceu o cromatograma da sequência original e um arquivo de sequência. Um exemplo de cromatograma é mostrado na Fig. 4. Neste método de sequenciamento automatizado, cada base terminal é marcada com um corante fluorescente diferente [15]. À medida que os diferentes fragmentos de DNA migram através de uma matriz e passam por um detector, as intensidades fluorescentes relativas observadas são usadas para determinar a identidade da base de DNA terminal. A leitura de sequência automatizada pode ser alinhada com a sequência de vetor / gene esperada usando um programa como o ClustalW. Existem muitos sites ClustalW na web, como pir.georgetown.edu/pirwww/search/multaln.html. Discrepâncias entre as sequências de DNA esperadas e obtidas devem ser investigadas mais detalhadamente. Como pode haver erros na leitura automática de bases, é altamente recomendável que os alunos editem o cromatograma onde ocorrerem discrepâncias para garantir que a sequência lida corresponda corretamente ao cromatograma. Atenção especial deve ser dada às regiões dos primers porque o erro na síntese do primer pode resultar em mutações inesperadas, e isso ocorreu em um de nossos clones selecionados.


Termos chave

  • reação em cadeia da polimerase: Uma técnica em biologia molecular para a criação de várias cópias de DNA de uma amostra usada em impressões digitais genéticas, etc.
  • clonagem molecular: um conjunto de métodos experimentais em biologia molecular que são usados ​​para montar moléculas de DNA recombinante e para direcionar sua replicação dentro de organismos hospedeiros.
  • enzima de restrição: Endonuclease que catalisa a clivagem de fita dupla de DNA contendo uma sequência específica.

A tecnologia de DNA recombinante, também conhecida como clonagem molecular, é semelhante à reação em cadeia da polimerase (PCR), pois permite a replicação de uma sequência específica de DNA. A diferença fundamental entre os dois métodos é que a clonagem molecular envolve a replicação do DNA em um microrganismo vivo, enquanto a PCR replica o DNA em um em vitro solução, livre de células vivas.

Em experimentos de clonagem molecular padrão, a clonagem de qualquer fragmento de DNA envolve essencialmente sete etapas:

  1. Escolha do organismo hospedeiro e vetor de clonagem
  2. Preparação do DNA do vetor
  3. Preparação de DNA a ser clonado
  4. Criação de DNA recombinante
  5. Introdução de DNA recombinante no organismo hospedeiro
  6. Seleção de organismos contendo DNA recombinante
  7. Triagem de clones com inserções de DNA desejadas e propriedades biológicas

Embora um grande número de organismos hospedeiros e vetores de clonagem molecular estejam em uso, a grande maioria dos experimentos de clonagem molecular começa com uma cepa de laboratório da bactéria E. coli (Escherichia coli) e um vetor de clonagem de plasmídeo. E. coli e os vetores plasmídicos são de uso comum porque são tecnicamente sofisticados, versáteis, amplamente disponíveis e oferecem rápido crescimento de organismos recombinantes com equipamento mínimo. O vetor de clonagem é tratado com uma endonuclease de restrição para clivar o DNA no local onde o DNA estranho será inserido. A enzima de restrição é escolhida para gerar uma configuração no local de clivagem que seja compatível com aquela nas extremidades do DNA estranho.

Normalmente, isso é feito pela clivagem do DNA do vetor e do DNA estranho com a mesma enzima de restrição, por exemplo EcoRI. A maioria dos vetores modernos contém uma variedade de locais de clivagem convenientes que são únicos dentro da molécula do vetor (de modo que o vetor só pode ser clivado em um único local) e está localizado dentro de um gene (frequentemente beta-galactosidase), cuja inativação pode ser usada para distinguir recombinante de organismos não recombinantes em uma etapa posterior do processo. Para melhorar a proporção de organismos recombinantes para não recombinantes, o vetor clivado pode ser tratado com uma enzima (fosfatase alcalina) que desfosforila as extremidades do vetor. As moléculas de vetor com extremidades desfosforiladas são incapazes de se replicar e a replicação só pode ser restaurada se o DNA estranho for integrado no local de clivagem.

Para a clonagem do DNA genômico, o DNA a ser clonado é extraído do organismo de interesse. Os métodos de reação em cadeia da polimerase (PCR) são frequentemente usados ​​para a amplificação de sequências específicas de DNA ou RNA (RT-PCR) antes da clonagem molecular. O DNA purificado é então tratado com uma enzima de restrição para gerar fragmentos com extremidades capazes de serem ligadas às do vetor. Se necessário, segmentos curtos de fita dupla de DNA (ligantes) contendo locais de restrição desejados podem ser adicionados para criar estruturas terminais que são compatíveis com o vetor. A criação de DNA recombinante é, em muitos aspectos, a etapa mais simples do processo de clonagem molecular. O DNA preparado a partir do vetor e da fonte estranha são simplesmente misturados em concentrações apropriadas e expostos a uma enzima (DNA ligase) que liga covalentemente as extremidades. Essa reação de união é freqüentemente denominada ligadura. A mistura de DNA resultante contendo extremidades unidas aleatoriamente está então pronta para introdução no organismo hospedeiro. A mistura de DNA, previamente manipulada em vitro, é movido de volta para uma célula viva, conhecida como organismo hospedeiro. Os métodos usados ​​para obter DNA nas células são variados, e o nome aplicado a esta etapa no processo de clonagem molecular frequentemente dependerá do método experimental que é escolhido (por exemplo, transformação, transdução, transfecção, eletroporação).

Quando os microrganismos são capazes de absorver e replicar DNA de seu ambiente local, o processo é denominado transformação, e as células que estão em um estado fisiológico de tal forma que podem absorver DNA são consideradas competentes. Quando células bacterianas são usadas como organismos hospedeiros, o marcador selecionável é geralmente um gene que confere resistência a um antibiótico que, de outra forma, mataria as células, normalmente a ampicilina. As células que abrigam o vetor sobreviverão quando expostas ao antibiótico, enquanto as que não conseguiram captar as sequências do vetor morrerão. Os vetores de clonagem bacteriana modernos (por exemplo, pUC19) usam o sistema de triagem azul-branco para distinguir colônias (clones) de células transgênicas daquelas que contêm o vetor parental.

Nesses vetores, o DNA estranho é inserido em uma sequência que codifica uma parte essencial da beta-galactosidase, enzima cuja atividade resulta na formação de uma colônia de cor azul no meio de cultura utilizado para este trabalho.A inserção do DNA estranho na sequência de codificação da beta-galactosidase desativa a função da enzima, de modo que as colônias contendo plasmídeos recombinantes permanecem incolores (branco). Portanto, os clones recombinantes são facilmente identificados.

Figura: Tela azul branca: A tela azul-branca é uma técnica de triagem que permite a detecção de ligações bem-sucedidas na clonagem de genes baseada em vetores. O DNA de interesse é ligado a um vetor. O vetor é então transformado em célula competente (bactéria). As células competentes são cultivadas na presença de X-gal. Se a ligação for bem-sucedida, a colônia bacteriana será branca, caso contrário, a colônia será azul. Esta técnica permite a detecção rápida e fácil de uma ligadura bem-sucedida.


Um vetor de clonagem é uma pequena molécula de DNA que carrega um fragmento de DNA estranho na célula hospedeira, enquanto o vetor de expressão é um tipo de vetor que facilita a introdução, expressão de genes e produção de proteínas. Portanto, esta é a principal diferença entre o vetor de clonagem e o vetor de expressão. Além disso, outra diferença significativa entre o vetor de clonagem e o vetor de expressão é que um vetor de clonagem introduz um fragmento de DNA estranho em um hospedeiro, enquanto os vetores de expressão expressam o gene introduzido pela produção da proteína relevante.

Além disso, o vetor de clonagem consiste em uma origem de replicação, locais de restrição e um marcador selecionável. Enquanto, o vetor de expressão contém intensificadores, região promotora, códon de terminação, sequência de iniciação da transcrição, uma origem de replicação, locais de restrição e um marcador selecionável. Portanto, esta também é uma diferença entre o vetor de clonagem e o vetor de expressão. Além disso, plasmídeos, bacteriófagos, cromossomos artificiais bacterianos, cosmídeos, cromossomos artificiais de mamíferos, cromossomos artificiais de levedura, etc, são exemplos de vetores de clonagem. Enquanto isso, os vetores de expressão são principalmente plasmídeos.


Clonando um gene codificador em um vetor de não expressão - Biologia

As partes do BioBrick são sequências de DNA que seguem um padrão específico de montagem de enzimas de restrição. Existem padrões específicos para compilar e manter um registro dessas peças do BioBrick, bem como métodos de montagem usados ​​para construir essas peças em dispositivos e sistemas para produzir uma proteína desejada em microrganismos modelo. BioBricks podem ser pensados ​​como blocos de construção ou legos que podem ser montados de diferentes maneiras para montar circuitos biológicos sintéticos maiores que, juntos, têm uma função única. Esses circuitos biológicos podem então ser incorporados em células vivas, como E.Coli, para construir novos sistemas biológicos e realizar funções definidas. Exemplos de partes de BioBrick incluem sequências de codificação, promotores, locais de ligação ribossômica e terminadores.
O padrão BioBricks é um padrão empírico universal para definir as sequências de ácidos nucléicos das partes e descreve como eles podem ser combinados com sequências de outras partes dentro de vetores de clonagem. Isso permite a padronização das peças do BioBrick. Os diferentes padrões usados ​​para definir as peças BioBrick são descritos na página "Padrões de montagem para BioBricks". A montagem do BioBrick refere-se aos métodos e procedimentos usados ​​para compilar as sequências das peças, que são descritos com mais detalhes na página "Técnicas de montagem para BioBricks".
BioBricks são incrivelmente úteis para muitas indústrias diferentes que utilizam estratégias de clonagem para produzir produtos como drogas terapêuticas ou enzimas usadas em alimentos. Essas indústrias incluem produtos farmacêuticos, processamento de alimentos, biocombustíveis e muitos outros. Muitas dessas indústrias estão aproveitando as ferramentas da biologia sintética, como os BioBricks, para criar organismos para produzir muitos de seus produtos. A biologia sintética pode ser definida como A) a montagem de novas partes, dispositivos e sistemas biológicos ou B) a reconfiguração de sistemas biológicos naturais existentes para fins úteis. Os bioBricks estão tornando mais fácil projetar e montar as vias biológicas necessárias para que os organismos modificados realizem novas tarefas.

Este vídeo fornece uma introdução à biologia sintética

Um banco de dados de peças BioBrick pode ser encontrado no registro de peças biológicas padrão, o que torna mais fácil para os pesquisadores compartilhar peças e colaborar. Uma parte biológica é definida como uma sequência específica de ácidos nucleicos que codifica uma característica biológica definível. O registro contém mais de 20.000 peças de BioBrick que foram catalogadas e categorizadas com base em sua função biológica. Cada entrada do catálogo descreve a função, desempenho e design da peça. Cada peça BioBrick também vem com um código de identificação exclusivo. O registro foi criado por pesquisadores do MIT, Harvard e UCSF. A cada ano, os participantes da competição iGEM e laboratórios acadêmicos contribuem para o registro, portanto, o registro está crescendo consideravelmente ao longo do tempo.

O registro das partes biológicas padrão pode ser encontrado aqui!

Uma inovação chave do padrão de montagem BioBrick é que um engenheiro pode juntar quaisquer duas peças BioBrick e a forma combinada subsequente também é uma peça BioBrick que pode ser unida a qualquer outra peça BioBrick. A padronização dos BioBricks permite a produção distribuída de uma coleção de peças biológicas. Engenheiros em diferentes partes do mundo podem projetar peças que estejam em conformidade com a montagem de padronização e essas duas peças poderão ser unidas, pois seguem o mesmo padrão. Além disso, os engenheiros realizam o mesmo processo exato quando combinam duas partes do BioBrick, de modo que o processo de montagem está aberto à otimização e automação, em contraste com as abordagens de clonagem molecular mais tradicionais para combinar sequências genéticas. O registro não só pode ser usado por qualquer pesquisador ou engenheiro no planeta para identificar quais peças biológicas seriam mais propícias para facilitar um determinado processo de fabricação, mas esses cientistas também podem contribuir com suas próprias descobertas para o registro após validação por aqueles que mantêm o base de dados. Isso serve para afirmar os BioBricks como uma ferramenta muito versátil e diversificada em um estado contínuo de se tornar mais abrangente, tornando-se um dos recursos mais úteis disponíveis para biólogos sintéticos em todo o mundo.


Shoemaker, S., Schweickart, V., Ladner, M., Gelfand, D., Kwok, S., Myambo, K. e Innis, M. 1983. Molecular cloning of exo-cellobiohydrolase I Derivado de Trichoderma reesei estirpe L27. Biotecnologia 1: 691–696.

Chen, M.C., Gritzali, M. e Stafford, W.D. 1987. Sequência de nucleotídeos e estrutura primária deduzida de celobiohidrolase II de Trichoderma reesei. Biotecnologia 5: 274–278.

Teeri, T.T., Lehtovaara, P., Kauppinen, S., Salovuori, I. e Knowles, J. 1987. Homologous domains in Trichoderma reesei enzimas celulolíticas: sequência gênica e expressão da celobiohidrolase II. Gene 51: 43–52.

Penttila, M., Lehtovaara, P., Nevalainen, H., Bhikhabhai, R. e Knowles, J.K.C. 1986. Homologia entre genes de celulase de Trichoderma reesei: sequência nucleotídica completa do gene da endogluconase I. Gene 45: 253–263.

Saloheimo, M., Lehtovaara, P., Penttila, M., Teeri, T.T., Stahlberg, J., Pettersson, G., Claeyssens, M., Tomme, P. e Knowles, J.K.C. 1988. EGIII, uma nova endoglucanase De Trichoderma reesei: a caracterização do gene e da enzima. Gene 63: 11–21.

Enari, T.M., Niku-Paavola, M.L., Harju, L., Lappalainen, A. e Nummi, M. 1981. Purification of Trichoderma reesei e Aspergillus niger β-glucosidase. J. Appl. Biochem. 3: 157–163.

Umile, C. e Kubicek, C.P. 1986. A constitutiva, membrana plasmática ligada β-glucosidase em Trichoderma reesei. FEMS Microbiol. Letts. 34: 291–295.

Jackson, M.A. e Talburt, D.E. 1988. Purificação e caracterização parcial de uma β-glucosidase extracelular de Trichoderma reesei usando corrida catódica, eletroforese em gel de poliacrilamida. Biotechnol. Bioeng. 32: 903–909.

Hofer, F., Weissinger, E., Mischak, H., Messner, R., Meixner-Monori, B., Blaas, D., Visser, J. e Kubicek, C.P. 1989. Um anticorpo monoclonal contra a β-glucosidase extracelular alcalina de Trichoderma reesei: reatividade com outro Trichoderma β-glucosidases. Biochim. Biophys. Acta. 992: 298–306.

Messner, R. e Kubicek, C.P. 1990. Evidência para uma única β-glucosidase específica nas paredes celulares de Trichoderma reesei QM9414. Enzyme Microb. Technol. 12: 685–690.

Inglin, M., Feinberg, B.A. e Loewenberg, J.R. 1980. Purificação parcial e caracterização de uma nova β-glucosidase intracllular of Trichoderma reesei. Biochem. J. 185: 515–519.

Kubicek, C.P. 1981. Release of carboxymethyl-celulase and β-glucosidase from cell walls of Trichoderma reesei. EUR. J. Appl. Biotechnol. 13: 226–231.

Messner, R., Hagspiel, K. e Kubicek, C.P. 1990. Isolamento de um polissacarídeo de ligação e ativação de β-glucosidase a partir de paredes celulares de Trichoderma reesei. Arco. Microbiol. 154: 150–155.

Sternberg, D., Vijayakumar, P. e Reese, E.T. 1977. β-glucosidase: produção microbiana e efeito na hidrólise enzimática da celulose. Lata. J. Microbiol. 23: 139–147.

Kadam, S.K. e Demain, A.L. 1989. A adição de β-glucosidase clonada aumenta a degradação da celulose cristalina pelo Clostridium thermocellum complexo de celulase. Biochem. Biophys. Res. Com. 161: 706–711.

Kowamori, M., Ado, Y. e Takasawa, S. 1986. Preparação e aplicação de Trichoderma reesei mutantes com β-glucosidase aumentada. Agr. Biol. Chem. 50: 2477–2482.

Mandels, M., Parrish, F.W. e Reese, E.T. 1962. Sophorose como indutor de celulase em Trichoderma viride. J. Bacteriol. 83: 400–408.

Perlman, E. e Halvorson, H. 1983. Um local putativo de reconhecimento de peptidase de sinal e sequência em peptídeos de sinal eucarióticos e procarióticos. J. Mol. Bio. 167: 391–409.

Von Heijne, G. 1984. Como as sequências de sinal mantêm a especificidade de clivagem. J. Mol. Biol. 173: 243–251.

Von Heijne, G. 1986. Um novo método para prever locais de clivagem de sequência de sinal. Nucleic Acids Res. 14: 4683–4690.

Gavel, Y. e Heijne Von, G. 1990. Diferenças de sequência entre locais aceitadores de Asn-X-Thr / Ser glicosilados e não glicosilados: implicações para a engenharia de proteínas. Engenharia de Proteínas 3: 433–442.

Gurr, S.J., Unkles, S.E. e Kinghorn, J.R. 1987. The structure and organization of nuclear genes of filamentous fungi, p. 93–139. No: Estrutura do gene em micróbios eucarióticos. Kinghorn, J. R. (Ed.). IRL Press, Boca Raton, FL.

Smith, J.L., Bayliss, F.T. e Ward, M. 1991. Sequence of the cloned pyr4 gene de Trichoderma reesei e seu uso como um marcador selecionável homólogo para transformação. Cur. Genet. 19: 27–33.

Chirico, W.J. e Brown, R.D. Jr. 1987. Purificação e caracterização de uma β-glucosidase de Trichoderma reesei. EUR. J. Biochem. 165: 333–341.

Bause, E. e Legler, G. 1980. Isolamento e estrutura de um glicopeptídeo tríptico do sítio ativo de β-glucosidase A3 de Aspergillus wentii. Biochim. Biophys. Acta. 626: 459–465.

Paice, M.G. e Jurasek, L. 1979. Structural and mechanistic comparisons of some β-l, 4-glycoside hydrolases. Adv. Chem. Ser. 181: 361–374.

Clarke, A.J. 1990. Modificação química de uma β-glucosidase de Schizophyllum commune: evidências de grupos carboxila essenciais. Biochim. Biophys. Acta. 1040: 145–152.

Boel, E., Hjort, I., Svensson, B., Norris, K.E. e Fiil, N.P. 1984. Glucoamylases G1 e G2 de Aspergillus niger são sintetizados a partir de dois mRNAs diferentes, mas intimamente relacionados. EMBO. J. 3: 1097–1102.

Boel, E., Hansen, M.T., Hjort, I., Hoegh, I. e Fiil, N.P. 1984. Dois tipos diferentes de sequências intervenientes no gene da glucoamilase de Aspergillus niger. EMBO. J. 3: 1581–1585.

Finklestein, D.B., Rambosek, J., Crawford, M.S., Soliday, C.L., McAda, P.C. e Leach, J. 1989. Protein secretion in Aspergillus niger, p. 259–300. No: Genética e Biologia Molecular de Microorganismos Industriais Queener, S. W. e Hegeman, G. (Eds). Publicações ASM, Washington, D.C.

Sheir-Neiss, G. e Montenecourt, B.S. 1984. Characterization of the secreted cellulases of Trichoderma reesei mutantes de tipo selvagem durante fermentações controladas. Appl. Microbiol. Biotechnol. 20: 46–53.

Gritzali, M. 1977. Biossíntese e identificação de enzimas do sistema de celulase de Trichoderma reesei. Tese de mestrado. Virginia Polytechnic Institute and State University.

Mandels, M. e Weber, J. 1969. Production of cellulases. Adv. Chem. Ser. 95: 391–413.

Messing, H., Crea, R. e Seeburg, P.H. 1981. Um sistema para sequenciamento de DNA de espingarda. Nucleic Acids Res. 9: 309–321.

Yanisch-Perron, C., Vieira, J. e Messing, J. 1985. Vectores de clonagem de genes de fago M 13 melhorados e estirpes hospedeiras: Sequências de nucleótidos dos vectores M 13mpl8 e pUC19. Gene 33: 103–119.

Korman, D.R., Bayliss, F.T., Barnett, C.C., Carmona, C.L., Kodama, K.H., Royer, T.J., Thompson, S.A., Ward, M., Wilson, L.J. e Berka, R.M. 1990. Clonagem, caracterização e expressão de dois genes de alfa-amilase de Aspergillus niger var. Awamori. Curr. Genet. 17: 203–221.

Timberlake, W.E. e Barnard, E.C. 1981. Organização de um agrupamento de genes expressos especificamente nos esporos assexuados de A. nidulans. Célula 26: 29–37.

Sambrook, J., Fritsch, E.F. e Maniatis, T. 1989. Clonagem Molecular. A Laboratory Manual, Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.

Thomas, P.S. 1980. Hybridization of desnatured RNA and small DNA fragments transfer to nitrocellulose. Proc. Nat. Acad. Sci. EUA 77: 5201–5205.

Sanger, F., Nicklen, S. e Coulson, A.R. 1977. DNA sequencing with chain terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 74: 5463–5467.

Ohmiya, K., Takano, M. e Shimizu, S. 1990. Sequência de DNA de uma β-glucosidase de Ruminoccocus albus. Nucleic Acids Res. 18: 671.

Raynal, A., Gerbaud, C., Francingues, M.C. e Guerineau, M. 1987. Sequence and transcription of the β-glucosidase gene of Kluyveromyces fragalis clonado em Saccharomyces cerevisiae. Curr. Genet. 12: 175–184.

Kohchi, C. e Toh-e, A. 1985. Nucleotide sequence of Candida pelliculosa gene da β-glucosidase. Nucleic Acids Res. 13: 6273–6282.

Machida, M., Ohtsuki, I., Fukui, S. e Yamashita, I. 1988. Nucleotide sequence of Saccharomycopsis fibuligera genes para β-glucosidases extracelulares expressos em Saccharomyces cerevisiae. Aplicativo. Env. Micro. 54: 3147–3155.


7 etapas principais envolvidas na clonagem de genes

Os pontos a seguir destacam as sete etapas principais envolvidas na clonagem de genes. Algumas das etapas são: 1. Isolamento de fragmentos de DNA (gene de interesse) a serem clonados 2. Inserção de DNA isolado em um vetor adequado para formar o DNA recombi e shynant 3. Introdução do DNA recombinante em um organismo adequado conhecido como hospedeiro e outras etapas também.

Etapa # 1 da clonagem de genes.

Isolamento de fragmentos de DNA (Gene of Inter & shyest) a serem clonados:

Antes de realizarmos a operação de clonagem e inibição de genes, precisamos de duas coisas básicas em seu estado purificado - o gene de nosso interesse (GI) e o vetor. Um GI é um fragmento de gene cujo produto e produto (uma proteína, enzima ou um hormônio) nos interessam. Por exemplo, o gene que codifica o hormônio insulina.

Da mesma forma, o vetor é uma molécula transportadora que pode transportar nosso GI para um hospedeiro, replicando-se ali junto com o GI fazendo suas múltiplas cópias. Nesse estado, o GI também pode ser expresso na célula hospedeira, produzindo o produto do gene de que precisamos.

Etapa # 2 da clonagem de genes.

Inserção de DNA isolado em um vetor adequado para formar o DNA recombinante:

Assim que os ingredientes estiverem prontos, podemos iniciar a operação. Nosso próximo passo será cortar os vetores e também o GI, usando um tipo especial de enzima, chamada endonuclease de restrição. Uma endonuclease de restrição é uma enzima que corta o DNA de fita dupla ou de fita simples em sequências de nucleotídeos de reconhecimento específicas conhecidas como sítios de restrição para a região interna (portanto, endonuclease).

Eles também são considerados tesouras moleculares, pois abrem as fitas de DNA. Após esta etapa de corte, passamos para a colagem. Aqui, o GI é obtido e colado no vetor de corte. Este procedimento também precisa de uma enzima, chamada DNA ligase. Eles também são considerados como cola molecular.

O resultado e a molécula de DNA tímida é um híbrido de duas moléculas de DNA & # 8211 nosso GI e o vetor. Na ter & timinologia da genética, essa mistura de fitas diferentes de DNA é chamada de recombinação (que ocorre naturalmente na prófase 1 da meiose 1). Portanto, essa nova molécula de DNA híbrido também é chamada de molécula de DNA recombinante e essa tecnologia é chamada de tecnologia de DNA recom & shybinant (RDT).

Etapa # 3 da clonagem de genes.

Introdução do DNA recombinante em um organismo adequado conhecido como hospedeiro:

Quando nossa molécula de DNA recombinante está pronta, precisamos introduzi-la em um sistema vivo conhecido como hospedeiro.

Isso é feito por um ou ambos os seguintes motivos:

(a) Para replicar o DNA recombinante mol & shyecule a fim de obter as múltiplas cópias de nosso GI.

(b) Para permitir que nosso IG se expresse e produza a proteína de que precisamos.

A introdução do DNA recombinante na célula hospedeira é feita de várias maneiras e depende estritamente do tamanho da molécula de DNA e da natureza do GI. Alguns dos métodos seguidos para realizar esta etapa em & shycludes eletroporação, microinjeção, lipofecção, etc.

Quando realizamos este pro & tímido, algumas das células hospedeiras irão absorver o DNA re & tímido e outras não. As células hospedeiras que absorveram o DNA recombinante são chamadas de células transformadas e o processo de transformação é chamado de transformação.

Etapa 4 da clonagem de genes.

Seleção das células hospedeiras transformadas e identificação do clone que contém o gene de interesse:

O processo de transformação gera uma população mista de células hospedeiras transformadas e não transformadas. Como estamos interessados ​​apenas em células hospedeiras transformadas, torna-se necessário filtrá-las. É exatamente isso que se faz no processo de seleção. Existem muitas estratégias de seleção ex & shyisting, algumas das quais incluem a ajuda de genes repórter, técnica de hibridização de colônia, etc.

Etapa # 5 da clonagem de genes.

Multiplicação / expressão do gene introduzido no hospedeiro:

Depois de purificar nossas células hospedeiras transformadas pelo processo de triagem, agora é nosso trabalho fornecer-lhes parâmetros ideais para crescer e se multiplicar. Neste passo, as células hospedeiras transformadas são introduzidas em meios de cultura frescos que lhes fornecem uma nutrição rica seguida por uma incubação no forno à temperatura e temperatura adequadas.

Nesse estágio, as células hospedeiras se dividem e se subdividem junto com a replicação do DNA recom & shybinant transportado por elas. Agora, neste ponto, temos duas opções.

Quando o objetivo do processo de clonagem e inibição é gerar uma biblioteca de genes, nosso alvo será a obtenção de numerosas cópias de GI. Portanto, com este plano em nossa mente, iremos simplesmente buscar a replicação do DNA recombi e shynant e não além disso.

Se o objetivo do experimento de clonagem é obter o produto de GI, então daremos um passo à frente, onde forneceremos condições favoráveis ​​às células hospedeiras nas quais o GI presente no vetor pode expressar nosso produto de interesse (PI) .

Etapa # 6 da clonagem de genes.

Isolamento das Cópias do Gene Multiplicado / Proteína Expressa pelo Gene Intro & Shyduced:

Nesta etapa, isolamos nosso GI multiplicado que está presente ligado ao vetor ou a pro & shyteína codificada por ele. Isso pode ser comparado corretamente com o processo de colheita, onde coletamos a colheita do campo. Existem muitos processos de isolamento, cuja seleção varia de caso para caso.

Etapa # 7 da clonagem de genes.

Purificação da Cópia / Proteína do Gene Isolada:

Após a coleta da cópia isolada do gene ou da proteína, agora é nosso trabalho purificá-los.


Fatores críticos que afetam o sucesso da clonagem, expressão e produção em massa de enzimas por recombinante E. coli

E. coli é o hospedeiro mais freqüentemente usado para a produção de enzimas e outras proteínas por tecnologia de DNA recombinante. E. coli é preferível por sua relativa simplicidade, cultivo barato e rápido de alta densidade, genética bem conhecida e grande número de ferramentas moleculares compatíveis disponíveis. Apesar de todas essas vantagens, a expressão e a produção de enzimas recombinantes nem sempre são bem-sucedidas e frequentemente resultam em proteínas insolúveis e não funcionais. Existem muitos fatores que afetam o sucesso da clonagem, expressão e produção em massa de enzimas por recombinação E. coli. Neste artigo, esses fatores críticos e abordagens para superar esses obstáculos são resumidos com foco na expressão controlada da proteína / enzima alvo em uma forma não modificada em nível industrial.

1. Introdução

Nos últimos anos, a tecnologia do DNA recombinante permitiu aos cientistas produzir um grande número de proteínas diversas, em microrganismos, que antes não estavam disponíveis, eram relativamente caras ou difíceis de obter em quantidade [1]. Embora a expressão de genes estranhos tenha sido relatada em uma variedade de microrganismos e linhas celulares, a maior parte deste trabalho utiliza E. coli para a clonagem e expressão de genes estranhos [2]. A produção de enzimas envolve a clonagem do gene apropriado em um vetor de expressão sob o controle de um promotor induzível [3].

2. Produção de enzimas em E. coli

A expressão de proteínas recombinantes em células nas quais elas não ocorrem naturalmente é denominada produção de proteína heteróloga. Os sistemas de expressão bacteriana são comumente usados ​​para a produção de produtos de genes heterólogos de origem eucariótica e procariótica [4]. A expressão de proteínas heterólogas em E. coli, que é o sistema bacteriano, é mais amplamente e rotineiramente usado. Uma série de proteínas terapeuticamente importantes são agora produzidas como heterólogas em E. coli. A primeira proteína heteróloga a ser empregada clinicamente foi a insulina humana produzida em E. coli, aprovado pela primeira vez em 1982, no Reino Unido, Alemanha Ocidental, Holanda e EUA [5] (Tabela 1).

3. Considerações gerais de seleção E. coli como hospedeiro de expressão de proteína heterogênea

E. coli é amplamente utilizado como o hospedeiro para a expressão de proteínas heterogêneas para as seguintes vantagens: (1) facilidade de crescimento e manipulação usando equipamento de laboratório simples (2) disponibilidade de dezenas de vetores e cepas hospedeiras que foram desenvolvidas para maximizar a expressão (3) uma riqueza de conhecimento sobre a genética e fisiologia de E. coli (4) a expressão pode muitas vezes ser alcançada muito rapidamente começando com um clone de cDNA eucariótico, expressando a proteína em E. coli, e purificar em quantidades de miligramas em menos de 2 semanas (5), a tecnologia de fermentação adequada bem estabelecida (6) pode gerar suprimentos potencialmente ilimitados de proteína recombinante (7) economicamente atraente [6].

4. Limitações de uso E. coli como hospedeiro de expressão de proteína heterogênea

Eles são (1) incapacidade de E. coli como procariota para realizar a modificação pós-tradução que é típica para eucariótica (2) capacidade limitada de realizar extensa formação de ligação dissulfeto (3) algumas proteínas são feitas na forma insolúvel, uma consequência do dobramento incorreto da proteína, agregação e acumulação intracelular como corpos de inclusão (4) às vezes, a expressão suficiente pode não ser observada devido à degradação da proteína ou tradução insuficiente (o mRNA pode permanecer na estrutura secundária e a tradução dificultada) (5) a sequência de códons para um aminoácido específico em eucariótico é diferente de procariótico, pois E. coli. Este fenômeno é conhecido como "viés de códon", que dificulta enormemente a síntese de proteínas e expressão gênica em E. coli [6].

5. Fatores que afetam a expressão de enzimas em E. coli

A expressão de genes de enzimas em E. coli é influenciada por uma série de fatores. Eles são discutidos a seguir.

5.1. Características Estruturais Únicas e Sutil da Sequência Genética

Sequências únicas de DNA estão envolvidas em diferentes estágios de expressão de enzimas recombinantes, como transcrição e tradução.

(uma) Sequências de DNA envolvidas na transcrição. Três diferentes sequências de DNA e uma proteína multicomponente estão envolvidas na transcrição de genes. (1) O promotor: os promotores normalmente consistem em três regiões chamadas de caixa -35 e caixa -10 e a região espaçadora que separa ambas as caixas. O alinhamento de muitos promotores permite a dedução de uma chamada sequência de consenso. Esta sequência representa a sequência promotora ótima com uma região espaçadora de 17 nucleotídeos. Deve ser mencionado que não há um único promotor presente no E. coli cromossomo idêntico à sequência de consenso. Na maioria dos casos, há um ou dois desvios tanto na caixa −35 quanto na caixa −10 [4]. (2) O terminador transcricional: um terminador transcricional é necessário para permitir o término da transcrição. Duas classes de terminadores foram descritas, terminadores independentes de fatores e dependentes de fatores [7]. (3) A sequência regulatória: os genes são expressos constitutivamente ou regulados. Duas classes diferentes de reguladores foram descritas, repressores transcricionais e ativadores transcricionais. Os repressores se ligam a operadores localizados na região do promotor ou imediatamente a jusante dela e, na maioria dos casos, evitam a ligação do promotor da polimerase de RNA ou agem como um bloqueio de estrada. Para aliviar a repressão, o repressor precisa se dissociar de seu operador. Em alguns casos, um indutor será sintetizado pela célula ou retirado do ambiente que se liga ao repressor causando a dissociação de seu operador [3]. (4) A RNA polimerase: a RNA polimerase consiste em cinco componentes diferentes denominados α, β, β′, ω, e σ. Enquanto α2ββω constituem a enzima central, adição de σ conferir especificidade ao promotor constitui a holoenzima. o σ fator é responsável pelo reconhecimento do promotor, daí que cada σ fator reconhece um promotor diferente [8]. E. coli códigos para seis fatores alternativos onde σ 32 é necessário após uma mudança repentina de temperatura e σ S substitui o serviço de limpeza σ fator σ 70 durante a fase estacionária. Até agora, apenas σ 70 é usado na produção de proteínas recombinantes, como enzimas [3].

(b) Sequências de DNA envolvidas na tradução. Tornou-se claro que a ampla gama de eficiências na tradução de diferentes mRNAs é predominantemente devida à estrutura na extremidade 5 'de cada espécie de mRNA. A região de iniciação da tradução compreende quatro sequências diferentes: (1) a sequência Shine-Dalgarno, (2) o códon de início, (3) a região espaçadora entre a sequência de Shine-Dalgarno e o códon de início, o espaçamento ideal foi determinado como sendo 4 a 8 nucleotídeos e (4) potencializadores de tradução [3].

A estrutura secundária na região de iniciação da tradução do mRNA desempenha um papel importante na eficiência da expressão gênica. Foi demonstrado que a oclusão da sequência de Shine-Dalgarno e / ou do códon de início por uma estrutura de haste-alça impede a acessibilidade à subunidade ribossômica 30S e inibe a tradução [9]. A mutação de nucleotídeos específicos a montante ou a jusante da sequência de Shine-Dalgarno suprimiu a formação de estruturas secundárias de mRNA e aumentou a eficiência da tradução [10, 11].

5,2 A “força” do promotor transcricional

Para maior expressão, o gene das enzimas deve ser colocado sob o controle de um promotor forte. Muitos vetores de plasmídeo e bacteriófago foram desenvolvidos nos quais o gene clonado está situado imediatamente a jusante de um forte promotor transcricional [2]. O uso desses vetores requer que o promotor não seja constitutivo (ou seja, sempre ligado), mas, em vez disso, seja ligado em um estágio específico no crescimento do transformado E. coli células. Isso geralmente é realizado pela adição de um metabólito específico ou por uma mudança na temperatura do meio de crescimento [12]. A regulação da atividade do promotor garante que a expressão de um gene estranho não interfira com as funções normais do gene celular e não seja prejudicial à célula. A falha em regular a expressão de promotores fortes freqüentemente resulta na perda do plasmídeo que carrega o promotor forte ou na expressão constitutiva do promotor forte que pode ser letal para a célula [13].

Os promotores fortes mais amplamente usados ​​são da E. coli operons trp e lac, o promotor tae (um em vitro construção incluindo elementos de ambos os promotores trp e lac), e o promotor esquerdo, ou pL, do bacteriófago lambda [4].

5.3. A estabilidade do vetor em E. coli Células

Após um gene estranho ter sido clonado em um vetor de expressão, o vetor é introduzido em E. coli células que se tornam uma fonte da proteína estranha. No entanto, os plasmídeos nem sempre são estáveis, especialmente em células cultivadas por muitas gerações em culturas em grande escala [14], de modo que, quando um processo é ampliado, é importante que a estabilidade do vetor seja abordada. Uma vez que uma cepa livre de plasmídeo tem uma taxa de crescimento específico mais rápida do que uma cepa contendo plasmídeo, como resultado da energia metabólica que é gasta para a manutenção do plasmídeo, a cepa livre de plasmídeo eventualmente vencerá a cepa contendo plasmídeo [15] .

5.3.1. Razões de Instabilidade

(1) A estabilidade do plasmídeo é influenciada pelos genótipos do vetor e do hospedeiro - o mesmo plasmídeo em diferentes hospedeiros exibe diferentes graus de estabilidade e vice-versa [16]. (2) Foi observado que a origem e o tamanho do DNA estranho afetam a estabilidade do plasmídeo [16]. (3) A perda de plasmídeo ocorre primeiro no nível da célula individual como resultado da segregação defeituosa na divisão celular e, em seguida, no nível da população [15]. (4) A instabilidade é devida ao aumento da energia metabólica necessária para a manutenção e função do plasmídeo [17]. (5) A estabilidade do plasmídeo também é função de parâmetros fisiológicos que afetam a taxa de crescimento da célula hospedeira, que incluem pH, temperatura, taxa de aeração, componentes do meio e acúmulo de proteína heteróloga [16].

5.3.2. Soluções para o problema de instabilidade

(1) O método mais comum para garantir que um plasmídeo recombinante não se perca durante o crescimento do microrganismo é a inclusão de antibióticos que são selecionados pela presença de plasmídeos portadores de genes de resistência a antibióticos apropriados. No entanto, a expansão desta abordagem pode não ser economicamente viável devido ao custo dos antibióticos adicionados colocados na célula [14]. (2) Uma estratégia análoga envolve o uso de vetores de plasmídeo de replicação descontrolada, onde o número de cópias do plasmídeo é relativamente baixo em temperaturas mais baixas e aumenta quando a temperatura aumenta. O menor número de cópias do plasmídeo durante grande parte do ciclo de crescimento da célula reduz a carga metabólica na célula e garante a estabilidade do plasmídeo. Ao mesmo tempo, o maior número de cópias do plasmídeo para uma parte do ciclo de crescimento resulta em altos níveis de expressão do gene estrangeiro clonado [18].

5,4 O número de cópias do gene

Uma vez que o gene alvo é freqüentemente incorporado em um sistema de vetor de plasmídeo, a dosagem do gene depende do número de cópias do plasmídeo. Como pode ser esperado, um aumento no número de cópias resulta em produtividade de proteína recombinante concomitantemente maior, mas não indefinidamente. O número de cópias do plasmídeo é afetado pela genética do plasmídeo e do hospedeiro e também pelas condições de cultivo, como taxas de crescimento, meio e temperatura [19].

5.5. Códons utilizados em genes estranhos em comparação com o padrão normal de uso de códons em E. coli

Uma vez que os 20 aminoácidos são codificados por 61 códons de trinucleotídeos diferentes, vários códons de trinucleotídeos podem codificar a informação para a inserção do mesmo aminoácido na proteína. Os organismos mostram diferenças marcantes na preferência dos códons. Na verdade, parece que a frequência do uso de códons em um organismo é um reflexo direto do pool de tRNAs cognatos [20]. Genes altamente expressos usam códons para os quais há um grande pool de tRNAs cognatos, enquanto os genes reguladores geralmente usam códons para os quais há apenas um pool muito pequeno de tRNAs cognatos. Consequentemente, a expressão de um gene estranho pode ser limitada pela disponibilidade de um aminoacil tRNA particular [21].

O uso de códons pelas diferentes espécies pode ser bastante diferente. Como exemplo, o uso de códons para arginina de quatro espécies diferentes é apresentado na Tabela 2 a seguir.

A superexpressão de genes com alto conteúdo de códons raros pode resultar em síntese defeituosa da enzima correspondente. Além da quantidade, a localização de códons raros na região de codificação pode influenciar significativamente o nível de tradução. Códons raros próximos ao iniciador podem paralisar o ribossomo e impedir a entrada de novos ribossomos [22].

5.5.1. Soluções para o problema do uso do códon

Existem duas soluções experimentais para este problema: (1) aumento na quantidade do tRNA cognato apropriado, (2) alteração desses códons para os freqüentemente usados ​​por mutagênese específica de sequência [22].

5,6. A estabilidade e eficiência do mRNA

O mRNA de genes recombinantes tende a se acumular na célula, no entanto, E. coli Os mRNAs são bastante instáveis. Algumas características do mRNA afetam sua estabilidade. Estes incluem (1) a sequência Shine-Dalgarno (SD) na extremidade 5 'do mRNA que se acredita ajudar a posicionar o mRNA no ribossomo, (2) a distância entre a sequência SD e o códon de iniciação, e (3 ) a estrutura secundária e terciária do mRNA [7].

5.6.1. Soluções

(1) Foi relatado recentemente que a adição de uma sequência curta de DNA específica (aproximadamente 89 pares de bases) à extremidade distal dos genes clonados pode estabilizar o mRNA transcrito desse gene, aumentando assim a expressão gênica. Essa sequência “retrorreguladora” provavelmente se incorpora na extremidade 3 'do mRNA, protegendo-o da digestão da exonuclease [23]. (2) Foi demonstrado que estruturas secundárias estáveis ​​projetadas na região 5 'não traduzida e terminador independente 3' rho do mRNA podem auxiliar na estabilidade do mRNA e prevenir a degradação por exonucleases. Em particular, um grampo de cabelo na extremidade 5 'sem quaisquer saliências de nucleotídeo de fita simples 5' conferiu mRNAs com resistência considerável à atividade de exonuclease no citoplasma [24].

5.7. A localização da proteína clonada no E. coli Célula

Enquanto E. coli proteínas são sintetizadas no citoplasma, é possível direcionar um produto do gene clonado para o citoplasma, a membrana interna ou externa, ou o espaço periplasmático [25]. A secreção de um produto do gene clonado para o espaço periplasmático frequentemente permite níveis mais elevados de expressão da proteína estranha que pode ser degradada por proteases no citoplasma [26]. E. coli é capaz de reconhecer e processar corretamente as sequências de sinal para que a secreção de enzimas no E. coli espaço periplasmático é possível [27].

5.7.1. Existem quatro razões para translocar proteínas recombinantes para o periplasma

(1) o ambiente oxidante facilita a formação de ligações dissulfeto, (2) contém apenas 4% da proteína celular total (

100 proteínas diferentes), (3) há menos degradação de proteínas e (4) purificação fácil por choque osmótico [3].

5.7.2. Desvantagem da Expressão Periplasmática

Embora seja tecnicamente viável direcionar os produtos proteicos de genes estranhos para a membrana interna ou externa, altos níveis de uma proteína estranha na membrana podem interferir nas funções celulares normais e ser letais para a célula [28].

5.7.3. Solução

Recentemente, foram construídos vetores de expressão que colocam os genes para proteínas estranhas, normalmente não secretadas, atrás de um fragmento de DNA que codifica uma sequência de sinal. Isso resulta na proteína estranha sendo secretada de forma eficiente (em grandes quantidades) para o espaço periplasmático sem evidência de acúmulo da forma não processada no citoplasma [29].

5,8. A estabilidade da enzima clonada em E. coli

A secreção de um produto do gene clonado para o espaço periplasmático frequentemente permite níveis mais elevados de expressão da proteína estranha que pode ser degradada por proteases no citoplasma [26]. A produção em grande escala de proteínas eucarióticas em E. coli é frequentemente limitado pela instabilidade desses polipeptídeos no hospedeiro bacteriano [30].

A susceptibilidade à protease pode ser afetada pelas sequências N- e C-terminais da proteína recombinante. A presença de Arg, Leu, Lys, Phe, Trp ou Tyr no N-terminal tem como alvo as proteínas para uma degradação mais rápida (regra do N-end). Os aminoácidos não polares no terminal C podem levar à rápida degradação; no entanto, as proteínas com os últimos cinco aminoácidos polares ou carregados não são degradadas [31].

Outros fatores na susceptibilidade à protease incluem (1) a presença de produtos proteicos danificados ou em excesso causados ​​pela formação de polipeptídeos incompletos, (2) síntese excessiva de subunidades de complexos multiméricos, (3) dano pós-tradução ou engenharia genética da proteína alvo e (4) parâmetros de crescimento da cultura, como composição de nutrientes do meio, temperatura de crescimento e pH [32].

5.8.1. Resolvendo o problema

(1) Uma estratégia comum que tem sido usada para superar esse problema é fundir o gene para a proteína eucariótica a uma porção de um gene bacteriano [33]. (2) Uma abordagem alternativa para estabilizar uma proteína clonada é clonar múltiplas cópias do gene em tandem no mesmo plasmídeo [34].

5,9. Corpos de inclusão e como prevenir sua formação

A produção rápida de proteínas recombinantes pode levar à formação de agregados insolúveis designados como corpos de inclusão [35]. Estas são partículas grandes e esféricas que são claramente separadas do citoplasma e resultam da falha do sistema de controle de qualidade em reparar ou remover proteínas mal dobradas ou não dobradas [36]. Neste caso, pode ser vantajoso clonar o gene em um vetor de secreção de modo que a proteína clonada não se acumule no citoplasma [37].

5.9.1. Soluções

Estratégias para prevenir a formação de corpos de inclusão visam desacelerar a produção de proteínas recombinantes e incluem (1) vetores de baixo número de cópias, (2) promotores fracos, (3) baixa temperatura, (4) coexpressão de chaperonas moleculares, ( 5) uso de um parceiro de solubilização e (6) fermentação em valores extremos de pH [3]. (7) Uma estratégia comum que tem sido usada para superar esse problema é fundir o gene para a proteína eucariótica a uma porção de um gene bacteriano [33].

Vantagens da Expressão ou Proteínas Heterólogas como Proteínas de Fusão ou com Etiqueta de Proteína. Muitos vetores estão disponíveis que permitem a expressão de proteínas heterólogas que são fundidas em seus parceiros N- ou C-terminais são frequentemente denominados como tag de proteína [38]. Por exemplo, o marcador de histidina (His) é uma proteína de fusão. Esses parceiros de fusão oferecem várias vantagens potenciais. Expressão melhorada: a fusão dos terminais N de uma proteína heteróloga com o terminal C de um parceiro de fusão altamente expresso muitas vezes permite um alto nível de expressão da proteína de fusão [39]. Solubilidade melhorada: a fusão do terminal N da proteína heteróloga com o terminal C de um parceiro de fusão solúvel freqüentemente melhora a solubilidade de uma proteína [40]. Detecção aprimorada: a fusão de uma proteína em qualquer terminal para um peptídeo curto ou um polipeptídeo que é reconhecido por um anticorpo ou proteína de ligação permite a análise de Western blot de uma proteína durante a expressão e purificação [41]. Purificação aprimorada: é um fenômeno amplamente utilizado. Esquemas de purificação simples foram descritos para proteínas fundidas em ambas as extremidades a marcadores que se ligam a resinas de afinidade. As tags disponíveis incluem His6 (seis resíduos de histidina em tandem), que se ligam a Ni-NTA (nitrilotriacetato quelatado com íons Ni 2+) GST (glutationa-S-transferase, que se liga a glutationa-sepharose). Essas tags se ligam às suas resinas específicas e se separam facilmente. Não há efeito dos marcadores na proteína e os excisados ​​facilmente [42].

5,10. Dobramento de proteínas correto e eficiente

Durante ou após a tradução, o polipeptídeo deve se dobrar de modo a adotar sua conformação funcionalmente ativa [43]. Uma vez que muitas proteínas desnaturadas podem ser redobradas em vitro, parece que a informação para o dobramento correto está contida na estrutura polipeptídica primária [44]. No entanto, o dobramento compreende etapas de limitação de taxa durante as quais algumas moléculas podem agregar, particularmente em altas taxas de síntese e em temperaturas mais altas. Em contraste com as proteínas intracelulares, as proteínas secretadas naturalmente encontram um ambiente anormal no citoplasma, a formação de ligações dissulfeto não é favorecida e a glicosilação não pode ocorrer [45].

5.10.1. Soluções

(1) Coexpressar chaperones adicionais para auxiliar no enovelamento de proteínas. Isso pode causar uma redução na expressão da enzima, mas promove a solubilidade. Há evidências de que certas proteínas de choque térmico atuam como acompanhantes moleculares na prevenção da formação e do acúmulo de agregados desdobrados, ao mesmo tempo em que aceleram as reações de dobramento. (2) Para a formação da ligação dissulfeto, coexpressar a tiorredoxina (ou usar como parceiro de fusão) ou usar cepas deficientes em tiorredoxina redutase. Uma alternativa a considerar é direcionar a proteína para o periplasma onde a formação da ligação dissulfeto pode ocorrer (a maioria E. coli proteínas com ligações dissulfeto estão localizadas no periplasma) [46].

5,11. Características de crescimento celular

As características de crescimento celular têm influência marcante na expressão de enzimas recombinantes. Algumas das manipulações dos meios de cultura são as seguintes. (uma) Diminuir a temperatura de crescimento da cultura: as vantagens da redução da temperatura de crescimento são as seguintes. (1) O crescimento a 37 ° C pode promover a formação de corpos de inclusão para algumas proteínas, enquanto o crescimento a temperaturas mais baixas (por exemplo, 30 ° C, 25 ° C, 15 ° C) pode não. (2) A temperatura mais baixa também diminui a atividade da protease. As desvantagens são as seguintes. (1) O cultivo da cultura a uma temperatura mais baixa reduzirá significativamente o crescimento de E. colie, portanto, um período de indução mais longo (por exemplo, durante a noite) pode ser necessário para obter uma quantidade suficiente de proteína recombinante. (2) O cultivo da cultura em uma temperatura mais baixa diminuirá a taxa de síntese de proteínas, possivelmente evitando que as proteínas recombinantes saturem a maquinaria de dobramento celular e se agreguem [47]. (b) Adição de cofatores: potenciais cofatores devem ser adicionados ao meio de crescimento. Algumas proteínas não podem se dobrar adequadamente sem seu cofator e, portanto, podem formar corpos de inclusão. (c) alteração de pH: a alteração do pH do meio de crescimento pode melhorar a expressão. O pH é uma variável de cultura que pode afetar a atividade proteolítica, a secreção e os níveis de produção de proteína [48].

5,12. Carga metabólica no organismo

Independentemente da natureza do gene estranho ou do design do fermentador, a introdução de um plasmídeo exógeno em um E. coli a célula é obrigada a impor alguma carga metabólica [49].

5.12.1. Solução

Isso pode ser evitado (1) integrando o gene estranho no E. coli cromossomo através do uso de um lisógeno bacteriófago lambda defeituoso carregando o gene estranho [50], (2) pela inserção direta de um gene estranho em um local específico no cromossomo hospedeiro [51].

6. Conclusão

Embora a expressão eficiente de genes estranhos em E. coli é dependente de uma série de fatores, no entanto, é razoável esperar que a maioria dos genes estranhos possam ser expressos em níveis elevados em E. coli e que esta expressão poderá ser ampliada. Embora a estratégia de expressão e aumento de escala provavelmente varie, há mais semelhanças do que diferenças de um gene para o próximo, resultando no desenvolvimento de uma abordagem de "sistemas" para a clonagem, expressão e aumento de escala da enzima genes em E. coli. O objetivo final de produzir uma proteína desejada em um hospedeiro heterólogo econômico é influenciado por uma variedade de fatores. No entanto, maximizar a produção de proteínas heterólogas para aplicação comercial ainda é uma arte. Começamos a entender os fatores que influenciam a produção eventual. Esses fatores, descritos em detalhes neste artigo, são variados e, às vezes, mal compreendidos. Em grande parte, a abordagem permanece empírica. No entanto, nossa experiência coletiva nos permitirá racionalizar nossa abordagem no projeto de produção heteróloga de enzimas comercialmente importantes em uma variedade de sistemas de expressão. Após a produção, estabilização e formulação de proteínas, haverá obstáculos significativos na utilização de catalisadores biológicos naturais e outras proteínas para fins terapêuticos e industriais.

Referências

  1. M. Devasahayam, "Fatores que afetam a expressão de glicoproteínas recombinantes", Indian Journal of Medical Research, vol. 126, nº 1, pp. 22–27, 2007. Ver em: Google Scholar
  2. M. J. Carrier, M. E. Nugent, W. C. A. Tacon e S. B. Primrose, “High expression of cloned genes in E. coli e suas consequências, ” Tendências em Biotecnologia, vol. 1, não. 3 e # x20135, pp. 109–113, 1983. Ver em: Google Scholar
  3. W. Schumann e L. C. S. Ferreira, “Produção de proteínas recombinantes em Escherichia coli,” Genética e Biologia Molecular, vol. 27, no. 3, pp. 442–453, 2004. Ver em: Google Scholar
  4. B. R. Glick e G. K. Whitney, "Fatores que afetam a expressão de proteínas estranhas em Escherichia coli,” Journal of Industrial Microbiology, vol. 1, não. 5, pp. 277-282, 1987. Ver em: Google Scholar
  5. R. Crowl, C. Seamans, P. Lomedico e S. McAndrew, “Versatile expression vetores for high-level synth of cloned gene products in Escherichia coli,” Gene, vol. 38, no. 1 & # x20133, pp. 31–38, 1985. Ver em: Google Scholar
  6. T. A. Brown, Clonagem de genes - uma introdução, Wiley-Blackwell, 4ª edição, 1995.
  7. G. D. Stormo, T. D. Schneider e L. M. Gold, "Characterization of translational iniciation sites in E. coli,” Pesquisa de ácidos nucléicos, vol. 10, não. 9, pp. 2971–2996, 1982. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  8. T. M. Gruber e C. A. Gross, "Multiple sigma subunits and the partitioning of bacterial transcription space," Revisão Anual de Microbiologia, vol. 57, pp. 441–466, 2003. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  9. V. Ramesh, A. De e V. Nagaraja, "Engenharia de hiperexpressão da proteína Mu C do bacteriófago pela remoção da estrutura secundária na região de iniciação da tradução", Engenharia de Proteínas, vol. 7, não. 8, pp. 1053–1057, 1994. Ver em: Google Scholar
  10. J. Coleman, M. Inouye e K. Nakamura, "Mutações a montante do sítio de ligação ao ribossomo afetam a eficiência translacional", Journal of Molecular Biology, vol. 181, no. 1, pp. 139-143, 1985. Ver em: Google Scholar
  11. G. Gross, C. Mielke, I. Hollatz, H. Blockers, e R. Frank, “sequência primária de RNA ou estrutura secundária na região de iniciação da tradução controla a expressão de dois interferons variantes& # x3b2 genes em Escherichia coli,” The Journal of Biological Chemistry, vol. 265, no. 29, pp. 17627-17636, 1990. Ver em: Google Scholar
  12. J. R. Swartz, “Advances in Escherichia coli produção de proteínas terapêuticas, ” Opinião Atual em Biotecnologia, vol. 12, não. 2, pp. 195–201, 2001. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  13. S. Ringquist, S. Shinedling, D. Barrick et al., “Translation Initiation in Escherichia coli: sequências dentro do sítio de ligação ao ribossomo, ” Microbiologia Molecular, vol. 6, não. 9, pp. 1219–1229, 1992. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  14. J. Pierce e S. Gutteridge, "Preparação em larga escala de ribulosebifosfato carboxilase de um sistema recombinante em Escherichia coli caracterizado por extrema instabilidade do plasmídeo ”, Microbiologia Aplicada e Ambiental, vol. 49, nº 5, pp. 1094-1100, 1985. Ver em: Google Scholar
  15. R. E. Ashby e K. A. Stacey, "Estabilidade de um plasmídeo F trim em populações de uma cepa deficiente de recombinação de Escherichia coli na cultura contínua, ” Antonie van Leeuwenhoek, vol. 50, não. 2, pp. 125–134, 1984. Ver em: Google Scholar
  16. R. Meena e P. Harish, "sistemas de expressão para a produção de proteínas heterólogas," Ciência Atual, vol. 80, não. 9, pp. 1121–1128, 2001. Ver em: Google Scholar
  17. S. Aiba, H. Tsunekawa e T. Imanaka, "Nova abordagem para a produção de triptofano por Escherichia coli: manipulação genética de plasmídeos compostos em vitro,” Microbiologia Aplicada e Ambiental, vol. 43, não. 2, pp. 289–297, 1982. Ver em: Google Scholar
  18. M. Bittner e D. Vapnek, "Vectores de clonagem versáteis derivados do plasmídeo de replicação em fuga pKN402," Gene, vol. 15, não. 4, pp. 319-329, 1981. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  19. J. E. Hughes e D. L. Welker, "Controle de número de cópias e compatibilidade de plasmídeos nucleares em dictyostelium discoideum", Plasmídeo, vol. 22, não. 3, pp. 215-223, 1989. Ver em: Google Scholar
  20. O. G. Berg e C. G. Kurland, "Growth rate-optimized tRNA abundance and codon using", Journal of Molecular Biology, vol. 270, nº 4, pp. 544–550, 1997. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  21. N. Stoletzki e A. Eyre-Walker, “Synonymous codon usage in Escherichia coli: seleção para precisão translacional, ” Biologia Molecular e Evolução, vol. 24, não. 2, pp. 374–381, 2007. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  22. G. F. T. Chen e M. Inouye, "Papel dos códons AGA / AGG, os códons mais raros na expressão gênica global em Escherichia coli,” Genes e desenvolvimento # x26, vol. 8, não. 21, pp. 2641–2652, 1994. Ver em: Google Scholar
  23. H. C. Wong e S. Chang, "Identificação de um retrorregulador positivo que estabiliza mRNAs em bactérias", Anais da Academia Nacional de Ciências dos Estados Unidos da América, vol. 83, nº 10, pp. 3233-3237, 1986. Ver em: Google Scholar
  24. S. A. Emory, P. Bouvet e J. G. Belasco, "A 5 & # x2032-terminal stem-loop structure can estabilize mRNA in Escherichia coli,” Genes e desenvolvimento # x26, vol. 6, não. 1, pp. 135–148, 1992. Ver em: Google Scholar
  25. F. Baneyx, “Recombinant protein expression in Escherichia coli,” Opinião Atual em Biotecnologia, vol. 10, não. 5, pp. 411–421, 1999. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  26. C. S. Hoffman e A. Wright, "Fusions of secreted protein to alcaline phosphatase: an approach for study protein secretion", Anais da Academia Nacional de Ciências dos Estados Unidos da América, vol. 82, não. 15, pp. 5107–5111, 1985. Ver em: Google Scholar
  27. G. L. Gray, J. S. Baldridge, K. S. McKeown, H. L. Heynecker, e C. N. Chang, "Periplasmic production of Corretamente processada hormônio de crescimento humano em Escherichia coli: sequências de sinais naturais e bacterianas são intercambiáveis, ” Gene, vol. 39, no. 2-3, pp. 247-254, 1985. Ver em: Google Scholar
  28. F. J. Mergulh & # xe3o e G. A. Monteiro, “Análise de fatores que afetam a produção periplasmática de proteínas recombinantes em Escherichia coli,” Journal of Microbiology and Biotechnology, vol. 17, não. 8, pp. 1236–1241, 2007. Ver em: Google Scholar
  29. J. Ghrayeb, H. Kimura, M. Takahara, H. Hsiung, Y. Masui e M. Inouye, "Secretion cloning Vectors in Escherichia coli,” EMBO Journal, vol. 3, não. 10, pp. 2437–2442, 1984. Ver em: Google Scholar
  30. L. C. Simrnons e D. G. Yansura, “O nível de translação é um fator crítico para a secreção de proteínas heterólogas em Escherichia coli,” Nature Biotechnology, vol. 14, não. 5, pp. 629-634, 1996. Ver em: Google Scholar
  31. S. Gottesman, S. Wickner e M. R. Maurizi, “Protein quality control: triage by chaperones and proteases,” Genes e desenvolvimento # x26, vol. 11, não. 7, pp. 815–823, 1997. Ver em: Google Scholar
  32. N. Dedhia, R. Richins, A. Mesina e W. Chen, “Improvement in recombinant protein production in ppGppdeficient Escherichia coli,” Biotecnologia e Bioengenharia, vol. 53, pp. 379-386, 1997. Ver em: Google Scholar
  33. K. Itakura, T. Hirose, R. Crea e A. D. Riggs, “Expression in Escherichia coli de um gene quimicamente sintetizado para o hormônio somatostatina, ” Ciência, vol. 198, no. 4321, pp. 1056–1063, 1977. Ver em: Google Scholar
  34. J. L. Hartley e T. J. Gregori, "Cloning multiple copy of a DNA segment," Gene, vol. 13, não. 4, pp. 347-353, 1981. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  35. S. Betts e J. King, “Há um jeito certo e um jeito errado: na Vivo e em vitro dobramento, dobramento incorreto e montagem de subunidade do tailspike P22, ” Estrutura, vol. 7, não. 6, pp. R131 – R139, 1999. Veja em: Publisher Site | Google Scholar
  36. J. R. Blackwell e R. Horgan, "Uma nova estratégia para a produção de uma proteína recombinante altamente expressa em uma forma ativa", FEBS Letters, vol. 295, no. 1 & # x20133, pp. 10–12, 1991. Veja em: Publisher Site | Google Scholar
  37. B. Fahnert, H. Lilie e P. Neubauer, "Inclusion corpos: formação e utilização", Avanços em Engenharia Bioquímica / Biotecnologia, vol. 89, pp. 93–142, 2004. Ver em: Google Scholar
  38. D. Esposito e D. K. Chatterjee, "Enhancement of soluble protein expression through the use of fusion tags", Opinião Atual em Biotecnologia, vol. 17, não. 4, pp. 353–358, 2006. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  39. H. P. S & # xf8rensen e K. K. Mortensen, "expressão solúvel de proteínas recombinantes no citoplasma de Escherichia coli,” Fábricas de células microbianas, vol. 4, artigo 1, 2005. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  40. S. Stahl e P. A. Nygren, "The use of gene fusions to protein A and protein G in immunology and biotechnology", Pathologie Biologie, vol. 45, não. 1, pp. 66–76, 1997. Ver em: Google Scholar
  41. S. C. Makrides, “Estratégias para alcançar a expressão de alto nível de genes em Escherichia coli,” Avaliações Microbiológicas, vol. 60, não. 3, pp. 512–538, 1996. Ver em: Google Scholar
  42. T. Moks, L. Abrahms & # xe9n, E. Holmgren et al., "Expression of human insulin-like growth factor I in bactéria: uso de vetores de fusão de genes otimizados para facilitar a purificação de proteínas", Bioquímica, vol. 26, no. 17, pp. 5239–5244, 1987. Ver em: Google Scholar
  43. J. G. Thomas e F. Baneyx, "Protein misfolding and including body training in recombinant Escherichia coli células superexpressando proteínas de choque térmico ”, The Journal of Biological Chemistry, vol. 271, no. 19, pp. 11141–11147, 1996. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  44. M. J. Gething e J. Sambrook, "Protein Fold in the cell", Natureza, vol. 355, não. 6355, pp. 33–45, 1992. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  45. C. H. Schein e M. H. M. Noteborn, "Formação de proteínas recombinantes solúveis em Escherichia coli é favorecido pela temperatura de crescimento mais baixa, ” Biotecnologia, vol. 6, não. 3, pp. 291-294, 1988.Veja em: Google Scholar
  46. D. C. Andersen e L. Krummen, "Recombinant protein expression forapeutic applications," Opinião Atual em Biotecnologia, vol. 13, não. 2, pp. 117–123, 2002. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  47. S. Hunke e J. M. Betton, "Efeito da temperatura na formação de corpos de inclusão e resposta ao estresse no periplasma de Escherichia coli,” Microbiologia Molecular, vol. 50, não. 5, pp. 1579–1589, 2003. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  48. J. H. Choi e S. Y. Lee, "Secretory and extracellular production of recombinant protein using Escherichia coli,” Microbiologia Aplicada e Biotecnologia, vol. 64, nº 5, pp. 625–635, 2004. Veja em: Publisher Site | Google Scholar
  49. P. Neubauer, H. Y. Lin e B. Mathiszik, "Carga metabólica da produção de proteína recombinante: inibição das capacidades celulares para captação de glicose e respiração após indução de um gene heterólogo em Escherichia coli,” Biotecnologia e Bioengenharia, vol. 83, nº 1, pp. 53–64, 2003. Ver em: Publisher Site | Google Scholar
  50. N. E. Murray, S. A. Bruce e K. Murray, “Molecular cloning of the DNA ligase gene from bacteriophage T4. II. Amplificação e preparação do produto do gene, ” Journal of Molecular Biology, vol. 132, no. 3, pp. 493–505, 1979. Ver em: Google Scholar
  51. O. Raibaud, M. Mock e M. Schwartz, “Uma técnica para integrar qualquer fragmento de DNA no cromossomo de Escherichi coli,” Gene, vol. 29, nº 1-2, pp. 231–241, 1984. Ver em: Google Scholar

Direito autoral

Copyright & # xa9 2013 Md. Fakruddin et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob a Licença de Atribuição Creative Commons, que permite o uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o trabalho original seja devidamente citado.


Criando o clone

As etapas de clonagem são as seguintes. O DNA é extraído do organismo em estudo e cortado em pequenos fragmentos de tamanho adequado para clonagem. Na maioria das vezes, isso é conseguido pela clivagem do DNA com uma enzima de restrição. As enzimas de restrição são extraídas de diversas espécies e cepas de bactérias, nas quais atuam como mecanismos de defesa contra vírus. Eles podem ser considerados "tesouras moleculares", cortando o DNA em sequências-alvo específicas. As enzimas de restrição mais úteis fazem cortes escalonados, isto é, deixam uma saliência de fita simples no local da clivagem. Essas saliências são muito úteis na clonagem porque os nucleotídeos desemparelhados irão emparelhar com outras saliências feitas usando a mesma enzima de restrição. Portanto, se o DNA doador e o DNA do vetor forem cortados com a mesma enzima, há uma forte possibilidade de que os fragmentos do doador e o vetor cortado se unam devido às saliências complementares. A molécula resultante é chamada de DNA recombinante. É recombinante no sentido de que é composto de DNA de duas fontes diferentes. Assim, é um tipo de DNA que seria impossível naturalmente e é um artefato criado pela tecnologia do DNA.

O próximo passo no processo de clonagem é cortar o vetor com a mesma enzima de restrição usada para cortar o DNA do doador. Os vetores têm locais-alvo para muitas enzimas de restrição diferentes, mas os mais convenientes são aqueles que ocorrem apenas uma vez na molécula do vetor. Isso porque a enzima de restrição apenas abre o anel do vetor, criando um espaço para a inserção do segmento de DNA do doador. O DNA do vetor cortado e o DNA do doador são misturados em um tubo de ensaio, e as extremidades complementares de ambos os tipos de DNA se unem aleatoriamente. Claro, vários tipos de uniões são possíveis: fragmento de doador para fragmento de doador, fragmento de vetor para fragmento de vetor e, o mais importante, fragmento de vetor para fragmento de doador, que podem ser selecionados. As associações de DNA recombinante se formam espontaneamente da maneira acima, mas essas associações não são estáveis ​​porque, embora as extremidades sejam emparelhadas, a estrutura açúcar-fosfato do DNA não foi selada. Isso é realizado pela aplicação de uma enzima chamada DNA ligase, que sela os dois segmentos, formando uma dupla hélice contínua e estável.

A mistura agora deve conter uma população de vetores, cada um contendo um inserto de doador diferente. Esta solução é misturada com células bacterianas vivas que foram especialmente tratadas para tornar suas células mais permeáveis ​​ao DNA. As moléculas recombinantes entram nas células vivas em um processo denominado transformação. Normalmente, apenas uma única molécula recombinante entrará em qualquer célula bacteriana individual. Uma vez lá dentro, a molécula de DNA recombinante se replica como qualquer outra molécula de DNA de plasmídeo, e muitas cópias são subsequentemente produzidas. Além disso, quando a célula bacteriana se divide, todas as células-filhas recebem o plasmídeo recombinante, que novamente se replica em cada célula-filha.

A mistura original de células bacterianas transformadas é espalhada na superfície de um meio de crescimento em uma placa plana (placa de Petri) para que as células sejam separadas umas das outras. Essas células individuais são invisíveis a olho nu, mas à medida que cada célula passa por rodadas sucessivas de divisão celular, formam-se colônias visíveis. Cada colônia é um clone de célula, mas também é um clone de DNA porque o vetor recombinante agora foi amplificado por replicação durante cada ciclo de divisão celular. Assim, a placa de Petri, que pode conter muitas centenas de colônias distintas, representa um grande número de clones de diferentes fragmentos de DNA. Essa coleção de clones é chamada de biblioteca de DNA. Ao considerar o tamanho do genoma do doador e o tamanho médio das inserções na molécula de DNA recombinante, um pesquisador pode calcular o número de clones necessários para abranger todo o genoma do doador, ou, em outras palavras, o número de clones necessários para constituir uma biblioteca genômica.

Outro tipo de biblioteca é uma biblioteca de cDNA. A criação de uma biblioteca de cDNA começa com ácido ribonucléico mensageiro (mRNA) em vez de DNA. O RNA mensageiro carrega informações codificadas do DNA para os ribossomos para tradução em proteínas. Para criar uma biblioteca de cDNA, essas moléculas de mRNA são tratadas com a enzima transcriptase reversa, que é usada para fazer uma cópia de DNA de um mRNA. As moléculas de DNA resultantes são chamadas de DNA complementar (cDNA). Uma biblioteca de cDNA representa uma amostra dos genes transcritos, enquanto uma biblioteca genômica inclui regiões não transcritas.

Ambas as bibliotecas genômicas e de cDNA são feitas sem levar em conta a obtenção de fragmentos de doadores clonados funcionais. Os clones genômicos não contêm necessariamente cópias completas dos genes. Além disso, o DNA genômico de eucariotos (células ou organismos que possuem um núcleo) contém íntrons, que são regiões do DNA que não são traduzidas em proteínas e não podem ser processadas por células bacterianas. Isso significa que mesmo os genes de tamanho normal não são traduzidos por completo. Além disso, os sinais reguladores de eucariotos são diferentes daqueles usados ​​por procariotos (células ou organismos sem membranas internas - ou seja, bactérias). No entanto, é possível produzir bibliotecas de expressão cortando inserções de cDNA imediatamente adjacentes a uma região promotora bacteriana no vetor nessas bibliotecas de expressão, proteínas eucarióticas são feitas em células bacterianas, o que permite várias aplicações tecnológicas importantes que são discutidas abaixo no sequenciamento de DNA.

Vários vírus bacterianos também têm sido usados ​​como vetores. O mais comumente usado é o fago lambda. A parte central do genoma lambda não é essencial para o vírus se replicar em Escherichia coli, de modo que pode ser excisado usando uma enzima de restrição apropriada, e inserções de DNA doador podem ser unidas na lacuna. Na verdade, quando o fago reembala o DNA em sua cápsula de proteína, ele inclui apenas fragmentos de DNA do mesmo comprimento do genoma normal do fago.

Os vetores são escolhidos de acordo com a quantidade total de DNA que deve ser incluída em uma biblioteca. Os cosmídeos são vetores projetados que são híbridos de plasmídeo e fago lambda, no entanto, eles podem transportar inserções maiores do que os plasmídeos pUC (plasmídeos projetados para produzir um número muito alto de cópias de DNA, mas que podem acomodar apenas pequenas inserções) ou fago lambda sozinho. Cromossomos bacterianos artificiais (BACs) são vetores baseados em plasmídeos de fator F (fator de fertilidade) de E. coli e pode transportar quantidades muito maiores de DNA. Cromossomos artificiais de levedura (YACs) são vetores baseados em plasmídeos de replicação autônoma de Saccharomyces cerevisiae (fermento de padeiro). Na levedura (um organismo eucariótico), um YAC se comporta como um cromossomo de levedura e se segrega adequadamente em células-filhas. Esses vetores podem carregar as maiores inserções de todos e são usados ​​extensivamente na clonagem de grandes genomas, como o genoma humano.


Assista o vídeo: Tutorial de como fazer as copias no codificador IDEAL CONTROLES (Outubro 2022).