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Quão específicos são os cortes CRISPR-cas9?

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CRISPR-cas9 usa uma cadeia de RNA que combina com o DNA e faz um corte de fita dupla nesse ponto.

Se o RNA tivesse apenas algumas letras, a enzima cortaria o DNA em muitos lugares. Seria inespecífico. Mas se você puder fazer a cadeia de RNA muito longa, ela cortará apenas no local exato onde você deseja cortar.

Então, por quanto tempo você pode fazer as sequências de RNA? E isso é suficiente para evitar cortes indesejados?


O problema de alvos fora do CRISPR / Cas é frequentemente discutido. Foi demonstrado que o sistema permite incompatibilidades de até cinco pares de base. Para sua pergunta, se é útil alongar o gRNA: foi mostrado que truncar o RNA aumenta a especificidade mais do que alongar (veja também aqui).

Então o que nós podemos fazer? Bem, existem diferentes métodos para melhorar a especificidade. O mais simples pode ser o uso de dosagens menores do sistema CRISPR / Cas. Outro método é usar motivos PAM alterados.

Um método mais complicado é converter o Cas9 em uma nickase. Nesta estratégia, você usaria dois gRNAs diferentes para dois locais de destino diferentes e introduziria ssbreaks. Uma modificação deste método é eliminar completamente a atividade enzimática de Cas9 e fundi-la a uma nuclease FokI que cortará o DNA apenas quando ele se dimerizar.

Existem várias vantagens nesses métodos, no entanto, você também pode perder os efeitos no alvo.

Existe outro método que, na minha opinião, é realmente incrível. É possível alterar a energética do sítio de ligação ao DNA resultando em variantes de alta fidelidade de Cas9 (HF1 e HF2)

Então, espero poder ajudá-lo. Existem outras formas ainda mais eficazes de aumentar a especificidade CRISPR / Cas em vez de alterar o gRNA. Se você estiver interessado, dê uma olhada nas referências.


Avaliação da função específica do local CRISPR / Cas9 e validação da sequência de sgRNA por uma técnica de PCR reversa assistida por Cas9 / sgRNA

A aplicação eficaz do sistema de repetição palíndrômica curta regularmente interespaçada (CRISPR) / Cas9 em biologia, medicina e outros campos é prejudicada pelos efeitos fora do alvo e loci-afinidade de Cas9-sgRNA, especialmente em uma escala ampla do genoma. A fim de eliminar a ocorrência de efeitos fora do alvo e avaliar a afinidade de loci pela detecção específica do local CRISPR / Cas9 e triagem de sequências de sgRNA de alta afinidade, respectivamente, desenvolvemos um método de PCR reverso assistido por CRISPR / Cas9 para local específico detecção e validação de sequência de sgRNA. O método de detecção baseado em PCR pode ser usado diretamente no laboratório com condições de reação de PCR, sem a necessidade de um sistema de detecção adicional, e todo o processo de detecção pode ser concluído em 2 h. Portanto, pode ser facilmente popularizado com um instrumento de PCR. Finalmente, este método é totalmente verificado pela detecção de múltiplas formas de mutações no local e avaliação da afinidade de uma variedade de sequências de sgRNA para o sistema CRISPR / Cas9. Em suma, ele fornece uma nova ferramenta de análise eficaz para pesquisa relacionada à edição do genoma CRISPR / Cas9. Um método de PCR reverso assistido por CRISPR / Cas9 foi desenvolvido para Cas9 / sgRNA detecção específica do local e validação de sequência de sgRNA. A técnica detecta o DNA alvo em três etapas: (1) o DNA alvo é especificamente cortado por um par de complexos Cas9 / sgRNA (2) o DNA clivado é rapidamente ligado por T4 DNA ligase (3) o DNA ligado é eficientemente amplificado por PCR ( PCR ou qPCR).

Palavras-chave: Validação de sgRNA de detecção específica do local CRISPR / Cas9.

Declaração de conflito de interesse

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Figuras

Um método de PCR reverso assistido por CRISPR / Cas9 foi desenvolvido ...

Um método de PCR reverso assistido por CRISPR / Cas9 foi desenvolvido para Cas9 / sgRNA detecção de sítio específico e validação de sequência de sgRNA.…

Ilustração esquemática da detecção CARP

Ilustração esquemática da detecção CARP

Detecção CARP de mutação de base única ...

Detecção CARP de mutação de base única (PCR). uma Determinando a capacidade do CARP de ...

Detecção CARP de mutação de base única ...

Detecção CARP de mutação de base única (qPCR) (as barras de erro representam réplicas técnicas e ...

Detectando especificidade de nucleotídeo único de Cas9-sgRNA ...

Detecção da especificidade de um único nucleotídeo de Cas9-sgRNA com CARP baseado em qPCR. uma Localização detalhada de comum ...

Avaliando a especificidade de um único nucleotídeo de sgRNA ...

Avaliando a especificidade de um único nucleotídeo de sgRNA com CARP baseado em qPCR. uma Localização detalhada da base única ...

Explorando os efeitos de diferentes ...

Explorando os efeitos de diferentes sgRNAs na eficiência de clivagem simultaneamente. uma qPCR logarítmico ...


Função e mecanismo de CRISPR em procariontes

CRISPR fornece procariotos com imunidade adquirida contra elementos genéticos invasivos. Esses loci incorporam material genético de vírus e plasmídeos e o utilizam para direcionar elementos genéticos estranhos de uma maneira específica para a sequência. As etapas envolvidas na proteção contra elementos genéticos estranhos usando o sistema CRISPR / Cas são a aquisição de DNA espaçador do vírus invasor, biogênese do RNA CRISPR (crRNA), que permitirá o reconhecimento de DNA estranho, e interferência, na qual o DNA invasivo é reconhecido e clivado.

Aquisição de DNA espaçador

Quando uma célula procariótica é invadida por um vírus, porções do DNA viral são amostradas e incorporadas nas regiões espaçadoras do locus CRISPR. As enzimas de nuclease Cas1 e Cas2 estão envolvidas na aquisição do espaçador em E. coli e provavelmente em todos os sistemas CRISPR / Cas, pois são as únicas proteínas Cas encontradas conservadas em todos os sistemas. O DNA que é amostrado e incorporado em loci CRISPR como espaçadores pode estar localizado próximo a motivos adjacentes de protoespaçador (PAMs) dentro do genoma viral. Os PAMs são importantes na seleção de ácidos nucleicos estranhos em sistemas tipo I e tipo II. Geralmente, os espaçadores são adicionados ao lado da sequência líder, embora o novo espaçador também possa ser inserido aleatoriamente na matriz de espaçadores de repetição.

Biogênese crRNA

Durante o estágio de interferência, os crRNAs se associam às proteínas Cas para formar um complexo que reconhece, direciona e destrói o material genético viral. Os pares de bases do crRNA com a sequência complementar no DNA viral, marcando-o para destruição. O reconhecimento da sequência PAM também pode ser necessário para o reconhecimento do DNA estranho. Em sistemas do tipo II, Cas9 realiza a etapa de interferência usando crRNA e tracrRNA, o que permite reconhecer DNA estranho. Além de reconhecer sequências alvo, Cas9 tem atividade de endonuclease e cliva o DNA estranho.


A figura mostra como o sistema CRISPR / Cas se defende contra elementos genéticos estranhos em procariotos.


CRISPR-Cas9 também pode cortar RNA

Cientistas de Würzburg descobriram que as chamadas tesouras de DNA Cas9 da Campylobacter também podem atingir facilmente o RNA. A partir da esquerda: Prof. Dra. Cynthia Sharma, Sara Eisenbart, Thorsten Bischler, Belinda Aul do Instituto de Biologia da Infecção Molecular (IMIB) e Prof. Dr. Chase Beisel do Helmholtz-Institute of RNA-based Infection Research (HIRI) em W & uumlrzburg. Crédito: Hilde Merkert, IMIB

A capacidade de editar genes à vontade, seja para reverter doenças genéticas ou melhorar colheitas de alimentos e energia, está passando por uma revolução. Ele está sendo conduzido por CRISPR-Cas9, uma tecnologia modelada em um mecanismo celular encontrado em bactérias. O CRISPR-Cas9 reconhece e corta o material genômico estranho de vírus invasores e, assim, protege as bactérias de serem infectadas.

A proteína Cas9 atua como uma tesoura, enquanto outras partes do sistema guiam Cas9 para as seções de DNA a serem cortadas. Os cientistas usaram essas tesouras moleculares em combinação com guias artificiais para modificar genes especificamente, não apenas em bactérias, mas também em plantas e animais.

Embora as tesouras Cas9 sejam conhecidas por cortar DNA, pesquisadores da Julius-Maximilians-Universität Würzburg (JMU) e do Helmholtz Institute for RNA-based Infection Research (HIRI) na Alemanha demonstraram que a proteína Cas9 do patógeno alimentar Campylobacter jejuni também corta o RNA.

"A proteína também é capaz de cortar ácidos ribonucléicos - RNA, para abreviar", diz a professora Cynthia Sharma, do Instituto JMU de Biologia de Infecção Molecular (IMIB). "Não apenas isso, mas descobrimos que também podíamos programar Cas9 para direcionar e cortar moléculas específicas de RNA."

O RNA desempenha um papel central em todas as formas de vida. Um dos principais papéis dos RNAs é servir como mensageiro do material genômico na célula. Os genes codificados no DNA são extraídos pela sua transcrição em RNA. O RNA então serve como modelo para a tradução dessas informações em proteínas. A capacidade de direcionar o RNA em vez de DNA expande a forma como a tesoura Cas9 pode ser usada. Os usos potenciais incluem o controle de quais genes são ativados ou desativados, o combate a vírus humanos e a detecção rápida de agentes infecciosos.

Os pesquisadores descobriram esta função enquanto observavam as moléculas que interagem com o Cas9 no Campylobacter. Estes incluíram vários RNAs da célula. Análises posteriores mostraram que o Cas9 não apenas se ligava ao RNA, mas também poderia cortá-lo como o faz com o DNA. Os pesquisadores determinaram que ele poderia ser facilmente instruído a cortar RNAs específicos.

"A descoberta foi surpreendente, dado que se pensa que Cas9 tem como alvo natural apenas o DNA", disse o Prof. Chase Beisel, que recentemente ingressou no HIRI da NC State University (EUA) e tem colaborado com o Prof. Sharma no projeto.

Enquanto os pesquisadores fizeram essa descoberta com a proteína Cas9 de Campylobacter, dois outros grupos de pesquisadores relataram recentemente descobertas semelhantes com Cas9s de duas outras bactérias. Isso levanta a possibilidade de que esta nova descoberta fascinante possa ser uma característica geral das proteínas Cas9 na natureza. Outra questão levantada por este estudo é se a capacidade do Cas9 de atingir o RNA tem algum papel fisiológico no Campylobacter. Por exemplo, estão se acumulando evidências de que os sistemas CRISPR-Cas podem não apenas servir para combater infecções, mas podem estar naturalmente envolvidos no controle de quais genes em Campylobacter são ativados e desativados. O Prof. Sharma e o Prof. Beisel concordam: "Continuamos maravilhados com o que a Cas9 é capaz de fazer e com os novos aplicativos e tecnologias que esses insights criam."


A descoberta do CRISPR abre caminho para o novo método de teste COVID-19

A nova plataforma LEOPARD tem o potencial de detectar uma variedade de biomarcadores relacionados a doenças em apenas um teste. Crédito: Sandy Westermann / HIRI

A maioria dos diagnósticos moleculares convencionais geralmente detecta apenas um único biomarcador relacionado à doença. Ótimos exemplos são os testes de PCR atualmente usados ​​para diagnosticar COVID-19 pela detecção de uma sequência específica do SARS-CoV-2. Os chamados métodos singleplex fornecem resultados confiáveis ​​porque são calibrados para um único biomarcador. No entanto, determinar se um paciente está infectado com uma nova variante do SARS-CoV-2 ou um patógeno completamente diferente requer a sondagem de muitos biomarcadores diferentes ao mesmo tempo.

Cientistas do Instituto Helmholtz para Pesquisa de Infecção baseada em RNA (HIRI) e da Universidade Julius Maximilians (JMU) em Würzburg agora abriram o caminho para uma plataforma de diagnóstico completamente nova com LEOPARD. É um método baseado em CRISPR altamente multiplexável, com potencial para detectar uma variedade de biomarcadores relacionados a doenças em apenas um teste.

LEOPARD, que significa "Leveraging Engineered tracrRNAs and On-target DNAs for PArallel RNA Detection", é baseado na descoberta de que o corte de DNA por Cas9 pode estar ligado à presença de um ácido ribonucleico (RNA) específico. Este link permite que o LEOPARD detecte muitos RNAs de uma vez, abrindo oportunidades para a detecção simultânea de RNAs de vírus e outros patógenos em uma amostra de paciente.

O estudo publicado hoje em Ciência foi iniciado por Chase Beisel, professor do JMU e líder do grupo de pesquisa do HIRI, e a professora Cynthia Sharma do Instituto de Biologia da Infecção Molecular (IMIB) do JMU. “Com o LEOPARD, conseguimos detectar fragmentos de RNA de nove vírus diferentes ', diz Beisel.“ Também fomos capazes de diferenciar o SARS-CoV-2 e uma de suas variantes em uma amostra de paciente enquanto confirmamos que cada amostra foi coletada corretamente do paciente."

CRISPR-Cas9 é conhecido principalmente como uma ferramenta biomolecular para edição de genoma. Aqui, o CRISPR-Cas9 funciona como uma tesoura molecular que corta sequências de DNA específicas. Essas mesmas tesouras são usadas naturalmente pelas bactérias para cortar o DNA associado aos vírus invasores. Seja editando genomas ou eliminando vírus, o corte de Cas9 é dirigido por RNAs guia. Os RNAs guias encontrados nas bactérias devem emparelhar com um RNA separado denominado tracrRNA. O casal de RNA pode então trabalhar com Cas9 para direcionar o corte de DNA.

Uma descoberta inesperada

O tracrRNA foi pensado para emparelhar apenas com RNAs guia provenientes do sistema antiviral. No entanto, os cientistas de Würzburg descobriram que o tracrRNA estava emparelhando com outros RNAs, transformando-os em RNAs guias. Cynthia Sharma, presidente de Biologia de Infecção Molecular II do IMIB e porta-voz do Centro de Pesquisa para Doenças de Infecção (ZINF) do JMU ficou surpresa com esta descoberta: "Quando procuramos por RNAs que se ligam a Cas9 em nosso organismo modelo Campylobacter, surpreendentemente encontramos que detectamos não apenas RNAs guia, mas também outros fragmentos de RNA na célula que se pareciam com RNAs guia. O tracrRNA estava emparelhando com esses RNAs, resultando em RNAs guia "não canônicos" que poderiam direcionar o corte de DNA por Cas9. "

A plataforma de diagnóstico LEOPARD se baseia nessa descoberta. "Nós descobrimos como reprogramar os tracrRNAs para decidir quais RNAs se tornam RNAs guias", diz Beisel. "Ao monitorar um conjunto de DNAs correspondentes, podemos determinar quais RNAs estavam presentes em uma amostra com base em quais DNAs foram cortados. Como parte da pandemia em andamento, o LEOPARD pode permitir que um médico descubra se o paciente está infectado com SARS-CoV -2, se for uma variante única e se a amostra foi coletada corretamente ou precisa ser repetida - tudo em um único teste. "

No futuro, o desempenho do LEOPARD pode diminuir até mesmo os testes de PCR multiplexados e outros métodos. "A tecnologia tem o potencial de revolucionar o diagnóstico médico não apenas para doenças infecciosas e resistências a antibióticos, mas também para câncer e doenças genéticas raras", disse Oliver Kurzai, diretor do Instituto de Higiene e Microbiologia da JMU, que forneceu amostras de pacientes para o estudo.

"O trabalho destaca a excelente pesquisa colaborativa e interdisciplinar que ocorre aqui em Würzburg", disse Jörg Vogel, diretor do IMIB e HIRI, uma instalação conjunta da JMU com o Centro Helmholtz para Pesquisa de Infecções em Braunschweig. "O LEOPARD demonstra de forma impressionante que podemos cobrir todo o espectro de pesquisas complementares de ponta em Würzburg, desde os fundamentos da pesquisa de RNA até as aplicações clínicas."


Tecnologia simples torna a edição de genes CRISPR mais barata

Pesquisadores da Universidade da Califórnia, em Berkeley, descobriram uma maneira muito mais barata e fácil de direcionar uma nova ferramenta de edição de genes, CRISPR-Cas9, para cortar ou rotular o DNA.

Algumas sequências de DNA aparecem várias vezes no genoma. Aqui, uma sonda guia de RNA marca regiões repetitivas no núcleo de um espermatozóide da rã Xenopus laevis.

A técnica CRISPR-Cas9, inventada há três anos na UC Berkeley, tomou a genômica de assalto, com sua capacidade de se agarrar a uma sequência muito específica de DNA e cortá-la, inativando genes com facilidade. Isso é uma grande promessa para a terapia genética direcionada para curar doenças genéticas e para descobrir as causas das doenças.

A tecnologia também pode ser ajustada para travar sem cortar, rotulando o DNA com uma sonda fluorescente que permite aos pesquisadores localizar e rastrear um gene entre milhares no núcleo de uma célula viva em divisão.

A técnica recém-desenvolvida agora torna mais fácil criar os guias de RNA que permitem que o CRISPR-Cas9 almeje o DNA com tanta precisão. Na verdade, por menos de US $ 100 em suprimentos, qualquer um pode fazer dezenas de milhares dessas sondas guiadas com precisão cobrindo todo o genoma de um organismo.

O processo, que eles chamam de CRISPR-EATING - para “Tudo o que está disponível transformado em novos guias” - é relatado em um artigo a ser publicado na edição de 10 de agosto da revista. Célula de Desenvolvimento.

Como prova de princípio, os pesquisadores transformaram todo o genoma da bactéria intestinal comum E. coli em uma biblioteca de 40.000 guias de RNA que cobriam 88 por cento do genoma bacteriano. Cada guia de RNA é um segmento de 20 pares de bases de RNA: o modelo usado pelo CRISPR-Cas9 enquanto busca DNA complementar para se ligar e cortar.

Os pesquisadores criaram centenas de sondas-guia de RNA para uma pequena região do genoma da rã Xenopus laevis, anexaram-nas ao CRISPR-Cas9 com um marcador fluorescente e marcaram com sucesso essa região do DNA em um núcleo para que ela pudesse ser seguida na vida amostras.

Essas bibliotecas podem ser empregadas na edição tradicional de CRISPR-Cas9 para direcionar qualquer sequência de DNA específica no genoma e cortá-la, que é o que os pesquisadores fazem para definir a função de um gene: eliminá-lo e ver quais coisas ruins acontecem na célula . Isso pode ajudar a identificar a causa de uma doença, por exemplo. O processo é chamado de triagem genética e é feito em lotes: cada uma das milhares de sondas é introduzida em uma única célula em uma placa cheia de centenas de milhares de células.

“Podemos fazer essas bibliotecas com muito menos dinheiro, o que torna o rastreamento genético potencialmente acessível em organismos menos estudados”, como aqueles que ainda não tiveram seus genomas sequenciados, disse o primeiro autor Andrew Lane, um pós-doutorado da UC Berkeley .

Monitoramento de células em tempo real

Mas Lane e sua colega Rebecca Heald, professora de biologia molecular e celular da UC Berkeley, desenvolveram a tecnologia para rastrear cromossomos em tempo real em células vivas, em particular durante a divisão celular, um processo conhecido como mitose. Isso é parte de um projeto maior de Heald para descobrir o que regula o tamanho do núcleo e outros componentes subcelulares à medida que os organismos crescem de apenas algumas células para muitas células.

“Essa tecnologia nos permitirá pintar um cromossomo inteiro e observá-lo ao vivo e realmente segui-lo no núcleo durante o ciclo celular ou conforme ele passa por transições de desenvolvimento, por exemplo em um embrião, para ver como ele muda de tamanho e estrutura ”, Disse Heald.

A nova técnica usa PCR padrão (reação em cadeia da polimerase) para gerar muitos comprimentos curtos de DNA de qualquer segmento de DNA em que um pesquisador esteja interessado, até e incluindo um genoma inteiro. Esses fragmentos são então cortados com precisão em uma região chamada PAM, que é crítica para a ligação CRISPR. Enzimas de restrição simples são então usadas para cortar cada pedaço de 20 pares de bases da extremidade PAM, gerando o tamanho exato do guia de RNA que o CRISPR usa na busca de sítios complementares no genoma. Esses RNAs guia são então facilmente incorporados ao complexo CRISPR-Cas9, produzindo dezenas de milhares de sondas para marcação ou corte de DNA.

“Ao usar o próprio genoma como fonte de RNAs guia, a abordagem deles coloca a criação de bibliotecas que visam regiões contíguas ao alcance de quase qualquer laboratório”, disse Jacob Corn, diretor administrativo e científico da Innovative Genomics Initiative da UC Berkeley. “Isso pode ser muito útil para imagens do genoma e certos tipos de telas, e estou muito interessado em ver como isso permite a descoberta biológica usando ferramentas Cas9.”

Os co-autores de Lane e Heald são Magdalena Strzelecka, Andreas Ettinger, Andrew W. Grenfell e Torsten Wittmann. Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health.

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Quão específicos são os cortes CRISPR-cas9? - Biologia

A beleza do sistema é que ele consiste em apenas dois elementos: um RNA guia, que se liga ao DNA alvo, e a nuclease de corte de DNA Cas9, que se complexifica com o RNA guia. Ambos os elementos podem ser entregues em células usando um único vetor. A técnica altamente eficiente e econômica é tão versátil que pode transformar uma série de disciplinas, da medicina à agricultura e biotecnologia industrial.

Saúde humana

O uso do CRISPR-Cas9 traz enormes possibilidades para promover ainda mais a saúde e o bem-estar humanos. Embora o objetivo final seja erradicar doenças, a maior parte dos trabalhos com a técnica ainda está em fase de pesquisa. Por exemplo, o CRISPR está tendo um enorme impacto sobre como os alvos potenciais de drogas para o câncer e outras condições são descobertos, pois permite aos pesquisadores aprimorar e editar genes específicos de maneira muito mais eficiente e econômica do que com métodos anteriores de edição de genoma.

Em fevereiro de 2016, cientistas pesquisadores em Londres receberam permissão para usar CRISPR-Cas9 para editar embriões humanos saudáveis ​​em uma busca para desenvolver tratamentos para infertilidade. Este foi o primeiro endosso mundial dessa pesquisa e estabeleceu um forte precedente para permitir o avanço de aplicações semelhantes.

Então, quem vai ganhar a corrida para desenvolver a primeira terapêutica CRISPR? Em 2015, a Editas Medicine anunciou seus planos de usar o CRISPR para tentar tratar uma forma rara de cegueira conhecida como amaurose congênita de Leber.

Mais recentemente, em junho de 2016, a aprovação foi dada por um painel federal nos EUA para o primeiro ensaio clínico de CRISPR para criar células imunes geneticamente alteradas para o tratamento do câncer. Cientistas da Universidade da Pensilvânia planejam usar CRISPR na tecnologia pioneira de receptor de antígeno quimérico (CAR) -terapia de células T para desenvolver células T para torná-las mais eficazes na identificação e destruição de três tipos de células tumorais cancerígenas. A terapia com células CAR-T obteve notável sucesso precoce contra certos cânceres do sangue em pacientes que não responderam a outros tratamentos. O uso de CRISPR-Cas9 em combinação com células T CAR pode vir a ser uma virada de jogo no salvamento de vidas de pessoas com cânceres anteriormente intratáveis.

Em outro lugar, os pesquisadores estão explorando a possibilidade de usar o CRISPR para curar o HIV, com algum sucesso já sendo relatado tanto em células humanas isoladas quanto em modelos de camundongos e ratos, enquanto outra equipe de Berkeley está tentando usar a técnica para corrigir a mutação que causa a foice anemia celular.

Pesquisa de safra

Embora o destaque esteja, sem dúvida, no papel potencial do CRISPR na terapia, ele também está sendo usado como uma ferramenta de edição do genoma em uma ampla gama de culturas, incluindo trigo, arroz, soja, batata, sorgo, laranja e tomate. Em um estudo recente, os cientistas do John Innes Center usaram a tecnologia para fazer edições direcionadas a duas safras do Reino Unido - uma brócolis semelhante a brócolis e cevada - e essas edições foram preservadas nas gerações subsequentes. O CRISPR também foi usado para criar videiras resistentes ao oídio e o trigo resistente ao oídio.

Biotecnologia industrial

Existe um grande potencial para o uso de CRISPR em biotecnologia industrial. Um jogador importante no campo é a Caribou Biosciences, que está trabalhando para melhorar as cepas de produção microbiana para gerar melhores fábricas de células para fermentação. Eles também estão usando a técnica para desbloquear o potencial dos micróbios de bioproduzir produtos químicos e enzimas nunca antes produzidos pela fermentação.

A empresa suíça de biologia sintética Evolva também está adicionando o CRISPR ao seu kit de ferramentas, o que promete um grande impulso em sua busca por novos ingredientes e produtos químicos especiais com microorganismos de fabricação de cerveja e de engenharia. Os produtos da Evolva variam de nootkatone, um ingrediente de sabor de toranja que pode ajudar a impedir a propagação do Zika, a bioativos agrícolas e componentes de materiais de última geração.

Além do CRISPR

Apesar do poder extraordinário e das aplicações potenciais da técnica, há preocupação na comunidade científica de que o CRISPR possa inadvertidamente alterar regiões do genoma diferentes das pretendidas, afetando assim a célula tratada de maneiras possivelmente imprevisíveis. Embora o potencial para mutações fora do alvo tenha menos importância em técnicas como a terapia com células CAR-T, que envolvem edições somáticas em vez de edições do genoma, é um problema que deve ser abordado. Muitos pesquisadores, incluindo aqueles que planejam ensaios clínicos, estão usando algoritmos baseados na web para prever os efeitos fora do alvo do CRISPR. No entanto, agora se sabe que eles não são cem por cento precisos, o que significa que os métodos de identificação fora do alvo precisarão ser muito melhorados se a edição do genoma for usada com segurança no tratamento de pacientes.

O CRISPR tem outras limitações que impulsionaram a busca por técnicas alternativas de edição de genes. Por exemplo, os componentes do CRISPR são muito grandes para serem inseridos no genoma do vírus normalmente usado para terapia genética. Uma solução potencial para isso vem na forma de um mini-Cas9 que tem sido usado com sucesso em camundongos para corrigir o gene responsável pela distrofia muscular. Outros problemas são que o Cas9 não corta em todos os lugares para onde é direcionado, e o caminho que usa para inserir uma nova sequência de DNA está sujeito a erros. Os pesquisadores estão buscando ativamente enzimas alternativas para Cas9 para expandir o repertório da técnica, além de estratégias que envolvem a desativação de Cas9 e amarrá-la a outras enzimas para permitir diferentes mudanças de sequência.

Em maio, um sistema de edição de genes inteiramente novo - uma proteína derivada de bactéria chamada NgAgo, que é programada usando uma sequência curta de DNA que corresponde à área-alvo - causou uma onda inicial de excitação. Embora os laboratórios até agora não tenham conseguido reproduzir os resultados, a técnica promete abrir um novo caminho a seguir no campo.

Inovação responsável

A preocupação pública com o uso de CRISPR para manipulação do genoma não pode ser ignorada, com muitas pessoas acreditando que abre o caminho para um futuro no qual os pais podem escolher as características de seus filhos. Outro medo é que essa edição da linha germinativa permita que o gene modificado seja transmitido às gerações futuras com resultados imprevisíveis. Outros oferecem argumentos mais subjetivos. Quem decide o que constitui uma melhoria de um genoma? Devemos alterar os organismos vivos de alguma forma?

A comunidade científica reconhece plenamente a necessidade de agir com cautela nesta área controversa e de estabelecer diretrizes específicas para uma prática responsável. Uma conferência em Washington DC em dezembro de 2015, para discutir a ética do uso da tecnologia CRISPR em humanos, pediu uma "moratória sobre quaisquer tentativas de modificação do genoma da linha germinativa para aplicação clínica em humanos" e por uma "estrutura para um discurso aberto sobre o uso de Tecnologia CRISPR-Cas9 para manipular o genoma humano ”.

É correto que os cientistas continuem a abordar as preocupações do público e a discutir abertamente os benefícios e riscos do CRISPR. Com o tempo, é provável que a técnica se torne mais aceita à medida que seus extraordinários poderes são realizados e os temores de seu potencial uso indevido são dissipados. Entretanto, não se pode ignorar o facto de que o CRISPR já atinge todos os sectores das ciências da vida e é apenas uma questão de tempo até que estejamos perante uma séria revolução tecnológica.


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These authors contributed equally: Xueli Tian and Tingxuan Gu

Afiliações

Basic Medical College, Zhengzhou University, 450001, Zhengzhou, Henan, China

Xueli Tian, Mee-Hyun Lee & Zigang Dong

China-US (Henan) Hormel Cancer Institute, No.127, Dongming Road, Jinshui District, 450008, Zhengzhou, Henan, China

Xueli Tian, Tingxuan Gu, Satyananda Patel, Mee-Hyun Lee & Zigang Dong

The Hormel Institute, University of Minnesota, Austin, 55912, USA

The Collaborative Innovation Center of Henan Province for Cancer Chemoprevention, Zhengzhou, China

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Contribuições

X.T. and M.H.L. contributed to the literature search and collection of articles, assisted with designing the figures and writing T.G. and S.P. assisted in the literature search and advised which articles were most appropriate A.M.B. edited the manuscript Z.D. supervised the studies and allocated the funding.

Autores correspondentes


Assista o vídeo: Proyecto Final CRISPR Cas9 (Outubro 2022).