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Isolando a vasculatura de um órgão?

Isolando a vasculatura de um órgão?


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Existe uma substância química ou processo que dissolve ou remove todos os outros tecidos de um órgão e deixa toda a vasculatura intacta? Estou planejando fazer uma exibição de prateleira dos vasos sanguíneos no coração de um porco para usar como uma exibição de prateleira.


O nome típico para esta técnica é "fundição por corrosão" - se você pesquisar literatura sobre fundição por corrosão, encontrará muitos artigos detalhando a técnica. Outra resposta menciona "plastinação", mas não acho que seja isso que você está procurando; A plastinação é uma técnica para preservar os próprios tecidos (embora os "Mundos do Corpo" exibam que as referências postadas também usam moldes de corrosão extensivamente).

Resumidamente, na fundição por corrosão, você preenche por gravidade ou pressão a vasculatura com um plástico, geralmente acrílico. É melhor que os vasos sejam eliminados de sangue antes de injetar o plástico, com solução salina / PBS, por exemplo. (Órgãos de um açougueiro funcionam bem, mas você obterá melhores resultados se puder administrar heparina pré-mortem para evitar a coagulação, o que obviamente não é possível para um animal de carne.) O acrílico cura e, em seguida, os tecidos que permanecem são digeridos com um solução básica, variando de NaOH 0,5 M a KOH 6 M dependendo do protocolo (concentrações mais baixas ou NaOH serão digeridos mais lentamente, concentrações mais altas ou KOH serão digeridos mais rapidamente), frequentemente em temperatura elevada (~ 37C). Observe que esta solução também digere tecnicamente toda a vasculatura, mas você já preencheu os lúmens vasculares com plástico, então é isso que resta.


Acho que você está procurando plastinação. Seu criador, Gunther von Hagens, usa-o para preservar corpos inteiros e também tecidos selecionados, como músculos, nervos e vasos, para usos didáticos e para a exposição BODY WORLDS.

Acho que este é o melhor método, mas não tenho certeza sobre sua viabilidade sem um laboratório dedicado. Outros métodos, como a inclusão em parafina, deixariam você com o problema de remover o resto dos tecidos sem usar altas temperaturas.


Estante

NCBI Bookshelf. Um serviço da National Library of Medicine, National Institutes of Health.

Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. Biologia molecular da célula. 4ª edição. Nova York: Garland Science 2002.

  • Por acordo com a editora, este livro pode ser acessado pelo recurso de pesquisa, mas não pode ser navegado.


Introdução

A principal função do sistema linfático é drenar o fluido intersticial extravasado e transportar antígenos para os linfonodos, onde as respostas imunes são provocadas por linfócitos ativados. Além disso, os lácteos, capilares linfáticos nas vilosidades intestinais, são responsáveis ​​pela absorção de gordura dietética e vitaminas lipossolúveis. Assim, vasos linfáticos de diferentes órgãos podem ser funcional e morfologicamente divergentes e, consequentemente, apresentar diversos padrões de expressão molecular. 1 Além disso, estudos de Vegfc Os camundongos + / & # x02212 mostram que os vasos linfáticos internos e da pele pós-natais têm necessidades de crescimento diferenciadas. 2 No entanto, nenhum estudo foi realizado para investigar as diferenças específicas de órgãos das células endoteliais linfáticas em um nível de genoma.

Aqui, comparamos as células endoteliais linfáticas dérmicas e intestinais (LECs) e mostramos que, embora as 2 populações de células exibam perfis de expressão gênica e respostas funcionais semelhantes, ainda existem diferenças significativas. Com base em nossos dados, identificamos liprin & # x003b21, anteriormente relatado apenas como um parceiro de ligação da proteína de ligação de cálcio S100A4, 3 como um novo mediador da integridade dos vasos linfáticos.


Histórico de mudanças

Wu, Z. & amp McGoogan, J. M. Características e lições importantes do surto da doença coronavírus 2019 (COVID-19) na China: resumo de um relatório de 72314 casos do Centro Chinês para Controle e Prevenção de Doenças. JAMA 323, 1239–2142 (2020).

Pober, J. S. & amp Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nat. Rev. Immunol. 7, 803–815 (2007).

Varga, Z. et al. Infecção de células endoteliais e endotelite em COVID-19. Lanceta 395, 1417–1418 (2020).

Goveia, J. et al. Uma abordagem de perfil de paisagem de expressão gênica integrada para identificar heterogeneidade de células endoteliais de tumor de pulmão e candidatos angiogênicos. Célula cancerosa 37, 421 (2020).

Kalucka, J. et al. Atlas do transcriptoma de célula única de células endoteliais murinas. Célula 180, 764–779 (2020).

Hoffmann, M. et al. A entrada da célula SARS-CoV-2 depende de ACE2 e TMPRSS2 e é bloqueada por um inibidor de protease clinicamente comprovado. Célula 181, 271–280 (2020).

Nachman, R. L. & amp Rafii, S. Plaquetas, petéquias e preservação da parede vascular. N. Engl. J. Med. 359, 1261–1270 (2008).

Mehta, P. et al. COVID-19: considere síndromes de tempestade de citocinas e imunossupressão. Lanceta 395, 1033–1034 (2020).

Teijaro, J. R. et al. As células endoteliais são orquestradoras centrais da amplificação de citocinas durante a infecção pelo vírus influenza. Célula 146, 980–991 (2011).

Li, X., Sun, X. & amp Carmeliet, P. Hallmarks of endothelial cell metabolism in health and disease. Cell Metab. 30, 414–433 (2019).


A nova & # 039Bio-ink & # 039 aproxima os órgãos impressos em 3D da realidade

Para as muitas pessoas que esperam pelos transplantes, os órgãos impressos em 3D não chegam em breve. Os pesquisadores têm feito progressos no sentido de desenvolver a tecnologia que tornaria possível simplesmente imprimir novos órgãos para as pessoas que deles precisam. Reportando Materiais avançados, os cientistas criaram uma & # 39bio-ink & # 39 que pode utilizar células de pacientes para bioimprimir vias aéreas em tamanho humano, que permitem que os vasos sanguíneos cresçam em um tecido sintético feito para transplante. Quaisquer órgãos bioimpressos teriam que receber um suprimento de sangue depois de implantados, então este é um passo significativo em direção ao objetivo dos órgãos impressos em 3D.

As doenças pulmonares crônicas são caras e há poucas opções de tratamento para muitas delas, exceto para um transplante de pulmão. Mas o suprimento de & # 39novos & # 39 pulmões não é suficiente para atender às necessidades dos pacientes que deles precisam. Se o tecido pulmonar puder ser cultivado em um andaime, um dia poderá ser possível fazer a bioimpressão desses órgãos.

Neste estudo, os pesquisadores criaram um material sintético que contém células e pode ser usado em uma impressora 3D como a tinta. Esta bio-tinta foi feita com um material natural encontrado em algas marinhas chamado alginato e material de matriz extracelular que havia sido isolado do tecido pulmonar.

“Começamos com a fabricação de pequenos tubos porque esse é um recurso encontrado tanto nas vias aéreas quanto na vasculatura pulmonar. Ao usar nossa nova bio-tinta com células-tronco isoladas das vias respiratórias do paciente, fomos capazes de bioimprimir pequenas vias respiratórias que tinham várias camadas de células e permaneceram abertas ao longo do tempo ”, explicou o autor sênior do estudo Darcy Wagner, professor associado da Lund University .

Embora este estudo tenha usado o bi-oink para fazer as vias aéreas, ele pode ser adaptado para outros tipos de tecido.

& quotEstas bio-tintas de próxima geração também suportam a maturação das células-tronco das vias respiratórias em vários tipos de células encontradas nas vias respiratórias de humanos adultos, o que significa que menos tipos de células precisam ser impressos, simplificando os números de bicos necessários para imprimir tecidos feitos de vários tipos de células , & quot disse Wagner. A resolução deve ser melhorada para produzir sacos aéreos conhecidos como alvéolos e tecido pulmonar mais distal, observou ela.

“Esperamos que mais melhorias tecnológicas das impressoras 3D disponíveis e mais avanços da bio-tinta permitam a bioimpressão em uma resolução mais alta, a fim de projetar tecidos maiores que possam ser usados ​​para transplante no futuro. Ainda temos um longo caminho a percorrer ”, acrescentou ela.

Os pesquisadores também testaram seu novo material impresso em 3D em um modelo de camundongo de imunossupressão, que pretende imitar o que foi visto em pacientes transplantados. Esses ratos toleraram as estruturas impressas em 3D que foram feitas, e novos vasos sanguíneos foram observados crescendo.

"O desenvolvimento desta nova bio-tinta é um passo significativo, mas é importante validar ainda mais a funcionalidade das pequenas vias aéreas ao longo do tempo e explorar a viabilidade dessa abordagem em modelos de animais grandes", observou a autora do primeiro estudo Martina De Santis .


Vasculatura linfática específica de órgão: do desenvolvimento à fisiopatologia

Descobertas recentes de novas funções e origens diversas dos vasos linfáticos mudaram drasticamente nossa visão da vasculatura linfática. Tradicionalmente considerados como condutos passivos para fluidos e células do sistema imunológico, os vasos linfáticos agora emergem como atores ativos e específicos do tecido nos principais processos fisiológicos e fisiopatológicos. Os vasos linfáticos apresentam notável plasticidade e heterogeneidade, refletindo sua especialização funcional para controlar o microambiente tecidual. Além disso, origens alternativas de desenvolvimento de células endoteliais linfáticas em alguns órgãos podem contribuir para a diversidade de suas funções nos tecidos adultos. Esta revisão tem como objetivo resumir os achados mais recentes de diferenciação organotípica de células endoteliais linfáticas em termos de suas funções fisiológicas distintas (patho) na pele, nódulos linfáticos, intestino delgado, cérebro e olhos. Discutimos avanços recentes em nossa compreensão da heterogeneidade dos vasos linfáticos com relação à especialização funcional e molecular específica do órgão do endotélio linfático, como a identidade sanguínea-linfática híbrida do canal de Schlemm, funções dos linfáticos intestinais na absorção de gordura dietética e descoberta da vasculatura linfática meníngea e células endoteliais linfáticas cerebrais perivasculares.

Introdução

Redes de vasos linfáticos ricos (VE) suprem a derme da pele e as membranas mucosas que cobrem os principais órgãos, incluindo o trato respiratório, cavidade nasofaríngea, intestino, mesentério, diafragma, coração e pulmão. Os LVs estão ausentes ou são muito esparsos no osso, medula óssea, tecido adiposo, miocárdio cardíaco e músculos esqueléticos e tecidos parenquimatosos do cérebro, fígado, rim e órgãos endócrinos, como a glândula adrenal ou tireóide. Presumivelmente, esses órgãos são desprovidos de VE devido à escassez de líquido intersticial ou à presença de um sistema de drenagem alternativo, como vasos sanguíneos fenestrados (VB). O líquido intersticial é drenado para capilares linfáticos especializados com extremidades cegas, que se conectam e convergem em LVs coletores e dutos linfáticos gradualmente maiores que deságuam na veia subclávia. As células endoteliais linfáticas (LECs) dos capilares linfáticos são circundadas por uma membrana basal fina e descontínua, não têm células perivasculares e têm junções celulares descontínuas em forma de botão (Baluk et al., 2007). Eles detectam prontamente as mudanças na pressão intersticial por meio de filamentos de ancoragem especializados, que podem modular a abertura de "válvulas de aba" entre as junções de botão para permitir a entrada de fluido. É também por meio dessas válvulas que as células imunes entram nos capilares linfáticos. O fluxo unidirecional da linfa nos vasos coletores é promovido por numerosas válvulas intraluminais e contração coordenada das células musculares lisas do VE (SMCs Schulte-Merker et al., 2011 Sabine et al., 2016). LECs representam uma linhagem distinta de células endoteliais (EC), e LVs são frequentemente distinguidos de BVs com base em sua expressão do fator de transcrição prospero homeobox-1 (Prox1), transmembrana O-glicoproteína podoplanina (também conhecida como gp38), receptor 3 do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR3 também conhecido como Flt4), neuropilina-2 e receptor-1 de hialuronano endotelial de vasos linfáticos (LYVE1 Tammela e Alitalo, 2010 Alitalo, 2011 Aspelund et al. , 2016).

Os LVs têm sido tradicionalmente considerados como condutores passivos para fluidos e algumas células do sistema imunológico, mas essa perspectiva foi enormemente atualizada com a descoberta de novas estruturas, origens e funções dos LVs em vários órgãos. LECs capilares linfáticos específicos de órgão exibem notável heterogeneidade e plasticidade e adquirem propriedades funcionais especializadas adaptadas ao microambiente local. Compreender a diferenciação e função de LEC organotípicas pode ajudar a projetar estratégias terapêuticas e regenerativas mais eficazes para curar um espectro mais amplo de doenças humanas comuns nas quais os LVs demonstraram desempenhar papéis importantes (Tammela e Alitalo, 2010 Alitalo, 2011 Aspelund et al., 2016 ) Avanços na fisiologia e patologia geral, desenvolvimento, linfedema e linfangiogênese tumoral já são cobertos por excelentes revisões recentes (Tammela e Alitalo, 2010 Alitalo, 2011 Mortimer e Rockson, 2014 Aspelund et al., 2016 Dieterich e Detmar, 2016 Ulvmar e Mäkinen, 2016 Potente e Mäkinen, 2017). Nesta revisão, pretendemos resumir os resultados mais recentes e sua importância na compreensão das vasculaturas linfáticas específicas de órgãos e destacar as principais características e exclusividade de sua estrutura e funções no desenvolvimento, homeostase e doenças.

Origens de desenvolvimento de LVs específicos de órgãos

Desde a descoberta de VEGF-C e seu receptor, VEGFR3, como a via principal do fator de crescimento linfangiogênico e o fator de transcrição Prox1 como o mestre da especificação LEC, o desenvolvimento da vasculatura linfática foi extensivamente estudado e caracterizado em modelos de rato e peixe-zebra (Escobedo e Oliver, 2016 Venero Galanternik et al., 2016). A maioria dos LECs é produzida por transdiferenciação do endotélio venoso, quando uma subpopulação de CEs venosos expressando Prox1 é especializada em LECs (Escobedo e Oliver, 2016 Venero Galanternik et al., 2016). É importante ressaltar que estudos recentes de rastreamento de linhagem destacaram uma diversidade inesperada de origens de LEC em vários órgãos. Na pele, os LVs cervicais e torácicos são formados por germinação linfangiogênica de progenitores de LEC derivados da linhagem Tie2 + venoso (Martinez-Corral et al., 2015). Em contraste, a maioria dos LVs lombares é formada por meio do processo de coalescência e formação da rede de vasos (chamada linfovasculogênese) pela linhagem Tie2 isolada - progenitores LEC não venosos. Embora a origem hematopoiética de LECs em tais aglomerados tenha sido conclusivamente excluída (Martinez-Corral et al., 2015), o tipo de célula precursora precisa ainda não foi estabelecido. Da mesma forma, durante o desenvolvimento cardíaco, uma proporção de LECs no coração mostrou descer da linhagem Tie2 - progenitores LEC não venosos (Klotz et al., 2015). Além disso, os LVs mesentéricos se originam de duas fontes distintas de LEC: CEs venosos Tie2 + e clusters de CE isolados decorrentes de CEs hemogênicos PDGFB + e c-Kit + (Stanczuk et al., 2015). Durante o desenvolvimento do linfonodo (LN), todas as células do estroma, incluindo LECs, foram sugeridas como surgindo de precursores nestin + (Koning et al., 2016). Nestina é um marcador de células-tronco mesenquimais, mas também é expressa por uma variedade de outros tipos de células, incluindo CEs, portanto, a origem precisa de LN LECs ainda precisa ser totalmente investigada.

Prox1 e VEGF-C / VEGFR3 / ADAM metalopeptidase com trombospondina tipo 1 motivo 3 / colágeno e domínios EGF de ligação de cálcio 1 são componentes moleculares obrigatórios que definem o destino do LEC e a expansão do LV em todos os órgãos, no entanto, existem importantes diferenças específicas do órgão a jusante caminhos. Por exemplo, o bloqueio da sinalização de PI3K, que atua a jusante do VEGFR3 ativado, afetou seletivamente o desenvolvimento de LVs mesentéricos, mas não dérmicos (Stanczuk et al., 2015). Assim, as origens e a heterogeneidade dos LECs em cada órgão são mais diversas do que o esperado anteriormente, e outras descobertas interessantes sobre este tópico são esperadas na próxima década.

Vasculatura linfática da pele

A pele é a primeira linha de defesa do corpo contra um ambiente hostil, incluindo patógenos que podem entrar após uma lesão na pele. Embora a epiderme seja avascular, a derme da pele é rica em VB e VG (Fig. 1 A). Os LVs dérmicos são os principais condutores para patógenos e células imunológicas da periferia para a drenagem de LNs. Eles também desempenham um papel importante no transporte reverso do colesterol, transportando o colesterol ligado à lipoproteína de alta densidade dos tecidos periféricos para a circulação sanguínea sistêmica para regular o metabolismo do colesterol (Fig. 1 B Lim et al., 2013 Martel et al., 2013 Randolph e Miller , 2014). A taxa de migração de células dendríticas (DCs) e linfócitos T via LVs aferentes dérmicos é dramaticamente aumentada durante o pico da inflamação (Fig. 1 C Kim et al., 2014 Hunter et al., 2016). A maioria das células imunes na linfa de LVs aferentes são células T (80–90%) e DCs (10–15% Hunter et al., 2016). As células de memória T CD4 + efetoras são o subconjunto principal que migra via LVs aferentes dérmicos no estado estacionário, bem como na inflamação, e as células T reguladoras Foxp3 + CD4 + (células T reg) constituem até 25% da população de células T intralinfáticas (Brinkman et al., 2016 Hunter et al., 2016). As células T reg do tecido são reguladores importantes da função linfática dérmica e reparam os LVs na inflamação e no linfedema (Gousopoulos et al., 2016), não está claro se as células T reg também contribuem para manter a integridade normal do VE.

Eventos celulares e moleculares durante a migração de células imunes via LVs dérmicos foram amplamente estudados e revisados ​​(Randolph et al., 2017). O ligante de quimiocina do motivo C-C 21 (CCL21) produzido por LECs é necessário para o tráfego de células T e DC em LVs da pele e provavelmente na maioria dos LVs de outros órgãos (Girard et al., 2012 Randolph et al., 2017). LECs secretam CCL21 abluminalmente e luminalmente, e os gradientes extracelulares de CCL21 guiam tanto o recrutamento quanto o rastreamento direcional intraluminal de DCs (Russo et al., 2016 Randolph et al., 2017). Além disso, a sinalização de fosfato de esfingosina-1 (S1P) via receptor S1P 1 (S1PR1) regula a decisão de uma célula T de sair ou permanecer no tecido (Baeyens et al., 2015). Não se sabe se a produção de S1P por LECs dérmicos é tão importante para a regulação da saída de linfócitos do tecido como mostrado anteriormente para LN LECs (Pham et al., 2010). A molécula de adesão celular vascular 1 (VCAM-1), expressa por LECs inflamados, promove a entrada de células T e DC em LVs (Brinkman et al., 2016 Randolph et al., 2017 Teijeira et al., 2017). As células T reg produzem níveis especialmente elevados de linfotoxina-α2β1, que envolve o receptor-β de linfotoxina em LECs para promover a transmigração celular (Brinkman et al., 2016). A adesão de células T intralinfática subsequente e o rastreamento dentro dos capilares são suportados pela molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1) em LECs e antígeno-1 associado à função de linfócito integrina em células T (Teijeira et al., 2017). Além de CCL21, C-X3-C motif quimiocina ligante 1 e CXC motif quimiocina ligante 12 são secretados de LECs para guiar DC e outras células imunes inatas que trafegam para LVs inflamados (Fig. 1 C Kabashima et al., 2007 Johnson e Jackson , 2013). O espectro de quimiocinas e receptores de adesão produzidos por LECs dérmicos diferem dependendo da natureza dos estímulos inflamatórios, por exemplo, ICAM-1, CXCL9 e CXCL10 são fortemente induzidos em LECs em um modelo de hipersensibilidade de contato, mas não durante a resposta imune inata induzida por Adjuvante de Freund (Vigl et al., 2011). Essas respostas LEC diferenciais são provavelmente importantes para a coordenação temporal de retenção de tecido versus saída de populações de células imunes específicas durante a inflamação. Recentemente, um novo papel de LYVE1 na transmigração DC foi descoberto (Johnson et al., 2017). No interstício dérmico inflamado, as DCs são revestidas com hialuronano e interagem com LYVE1 em LECs capilares linfáticos, mediando a docagem entre as duas células dentro de "cálices transmigratórios" discretos que envolvem DCs em trânsito, facilitando assim a transmigração de DC para LVs (Fig. 1 C Johnson et al ., 2017). A interação da cápsula de ácido hialurônico bacteriano com LEC LYVE1 também está envolvida na disseminação de um estreptococo do grupo A (GAS) patógeno residente na pele comum do local da infecção para o LN de drenagem regional (Fig. 1 C Lynskey et al., 2015). A disseminação linfática do GAS pode ser prejudicial para o hospedeiro, pois causa linfangite e linfadenite. No entanto, bloqueando o acúmulo de LN de GAS em Lyve1 - / - camundongos aumentou a disseminação sistêmica de bactérias na circulação sanguínea (Lynskey et al., 2015), indicando que altos níveis de LYVE1 em LECs podem ser importantes para a contenção de patógenos.

A saída de neutrófilos para os VE dérmicos é mínima tanto no estado estacionário quanto na inflamação estéril. No entanto, durante a infecção bacteriana, os neutrófilos são os primeiros a migrar da pele inflamada para a drenagem de LN, onde estimulam a proliferação de linfócitos (Hampton et al., 2015). A migração de neutrófilos depende do antígeno 1 associado à função dos linfócitos, um receptor de integrina / complemento CD11b e receptores de quimiocina CXC ou CC CXCR4 e / ou CCR7 (Fig. 1 C Gorlino et al., 2014 Hampton et al., 2015 Arokiasamy et al., 2017). Dermis também contém uma população abundante de macrófagos, o que contribui para o controle local da linfangiogênese e remodelação linfática durante o desenvolvimento, inflamação e cicatrização de feridas (Harvey e Gordon, 2012 Kim et al., 2014). Na pele adulta, os macrófagos desempenham um papel único na regulação da hipertensão sensível ao sal: em resposta ao aumento do estresse osmótico local, os macrófagos da pele ativam o fator nuclear da produção e secreção de VEGF-C 5 dependente de células T ativadas (Fig. 1 C ) A expansão resultante da rede linfática cutânea aumenta a depuração de eletrólitos intersticiais, reduz a pressão do fluido nos tecidos periféricos e restaura a homeostase (Machnik et al., 2010 Wiig et al., 2013).

O transporte linfático é importante para a homeostase normal da pele e está implicado em várias doenças inflamatórias da pele, incluindo dermatite atópica e de contato e psoríase. A densidade e a função dos VE dérmicos reduzem gradualmente com a idade, o que pode contribuir para o desenvolvimento de doenças cutâneas relacionadas à idade (Karaman et al., 2015). O comprometimento da função dérmica do VE leva a linfedema, hiperpigmentação, ceratose e papilomatose (Carlson, 2014). Estudos de modelos animais de inflamação crônica da pele demonstraram que o bloqueio da expansão do VE exacerba a doença, enquanto a estimulação da linfangiogênese pela administração de VEGF-C a reduz (Huggenberger et al., 2010).

Vasculatura linfática meníngea

O parênquima cerebral não tem LVs e, em vez disso, tem um sistema de drenagem de fluidos alternativo, mas essencial, o chamado sistema glifático (Iliff et al., 2012). O sistema glifático é denominado por sua dependência das células gliais para uma função de drenagem semelhante ao sistema linfático. O sistema glifático promove a eliminação de resíduos do cérebro, acelerando o fluxo de líquido cefalorraquidiano através do parênquima cerebral, que é ∼60% mais eficiente durante o sono (Iliff et al., 2012). No entanto, a recente redescoberta das redes linfáticas das meninges cerebrais de camundongos levantou questões interessantes e conceitos intrigantes (Aspelund et al., 2015 Louveau et al., 2015), e estruturas semelhantes também foram encontradas em espécimes de autópsia de meninges humanas (Absinta et al., 2017). É importante ressaltar que a técnica de ressonância magnética clínica de alta resolução permitiu a visualização de redes linfáticas meníngeas humanas (Absinta et al., 2017). Na verdade, a existência de vasculatura linfática na superfície do cérebro humano foi proposta há dois séculos e exibida em coleções de modelos de cera anatômicos (Museu de Modelos de Cera Josephinum, Viena, Áustria Lukić et al., 2003), mas tem sido principalmente ignorado. A maioria dos LVs meníngeos está localizada na camada meníngea (também chamada de “dura-máter”) e são fenotipicamente semelhantes aos capilares linfáticos em outros órgãos (Fig. 2 Aspelund et al., 2015). No entanto, as válvulas estão presentes apenas em LVs perto da base do crânio ao lado dos nervos cranianos. A ativação de VEGFR3 por VEGF-C aumenta o diâmetro dos LVs meníngeos e o bloqueio da sinalização de VEGFR3 anula completamente os LVs meníngeos, indicando que esses vasos, como LVs periféricos, são regulados por VEGFR3 (Aspelund et al., 2015). Um estudo recente (Antila et al., 2017) demonstrou que a sinalização VEGF-C – VEGFR3 é crucial não apenas para o desenvolvimento, mas também para a manutenção da integridade do VE meníngea durante a vida adulta. Funcionalmente, algum líquido cefalorraquidiano e líquido intersticial do parênquima cerebral fluem através do sistema glifático, drenam para os VEs meníngeos e atingem os LNs cervicais profundos. Curiosamente, um declínio significativo no fluxo de líquido cefalorraquidiano via LVs meníngeos foi observado em camundongos idosos (Ma et al., 2017), o que implica que as redes linfáticas meníngeas podem ser direcionadas para condições neurológicas associadas à idade. Mais pesquisas são necessárias para mapear as conexões entre este circuito linfático recém-descoberto, o sistema glifático e o resto do circuito linfático em todo o corpo (Louveau et al., 2017). Também seria intrigante determinar se a drenagem do líquido cefalorraquidiano para os VE meníngeos também aumenta durante o sono. Além disso, é razoável especular que o comprometimento desse circuito linfático possa estar relacionado ao edema cerebral, que muitas vezes é detectado durante isquemia, concussões, inflamação e tumores cerebrais. Além disso, será importante estabelecer se os LVs meníngeos estão envolvidos na eliminação de β amiloide e outras proteínas mal dobradas do parênquima cerebral, que são frequentemente e altamente acumuladas em pacientes com doenças neurodegenerativas, como as doenças de Alzheimer e Parkinson.

O cérebro também é considerado um órgão com privilégios imunológicos, em parte por causa da escassez de LVs. Pensava-se que as células T infiltradas no cérebro saíam pela circulação venosa e não pela circulação linfática, o que é o caso em todos os outros órgãos (Ransohoff e Engelhardt, 2012). No entanto, uma grande população de células T foi observada no lúmen dos LVs meníngeos, levantando a possibilidade intrigante de uma porta alternativa para as células T egressem do cérebro para os LNs cervicais profundos (Louveau et al., 2015). Dissecar a rota linfática para células T residentes no cérebro irá avançar nossa compreensão da comunicação entre o sistema nervoso central e o sistema imunológico e desvendar novos alvos terapêuticos para distúrbios neurológicos inflamatórios, incluindo encefalomielite e esclerose múltipla (Louveau et al., 2017). Outra questão que requer mais investigação é se os LVs meníngeos podem atuar como uma rota para a metástase do câncer cerebral. Assim, a redescoberta dos VE meníngeos revela novos conceitos sobre funções e doenças cerebrais.

LECs murais cerebrais (muLECs)

Em 2017, três grupos de pesquisa (Bower et al., 2017 van Lessen et al., 2017 Venero Galanternik et al., 2017) identificaram independentemente uma nova população de muLECs isolados (também chamados de receptor de manose-1 + células perivasculares) em torno de BVs meníngeas usando modelos de peixe-zebra transgênicos (Fig. 2). Os muLECs expressam marcadores LEC, como LYVE1 e Prox1, e um marcador de macrófago perivascular, receptor de manose-1, mas, ao contrário de todos os outros ECs, eles não formam um vaso lumenizado. Os muLECs são encontrados exclusivamente no lado interno da meninge, adjacente ao parênquima cerebral. Eles se originam do endotélio linfático no mesencéfalo ou do plexo vascular coróide óptico por meio do surgimento da linfangiogênese durante o desenvolvimento do cérebro e se diferenciam em uma linhagem mural dispersa e não luminosa. Semelhante a outros LECs, o desenvolvimento de muLEC requer sinalização através da via VEGF-C – VEGF-D – colágeno e domínios EGF de ligação de cálcio 1 – VEGFR3. Os muLECs maduros são células murais relativamente grandes que produzem fatores de crescimento vascular e acumulam lipoproteínas de baixa densidade na corrente sanguínea. Embora os muLECs pareçam ser importantes para a vascularização meníngea, eles são dispensáveis ​​para a manutenção da integridade dos vasos. Esses estudos identificaram uma nova linhagem linfática que se diferencia em células semelhantes a células murais que são necessárias para estabelecer a vasculatura sanguínea meníngea normal e levantaram a possibilidade de que um tipo de célula equivalente exista no cérebro de mamíferos (Bower et al., 2017 van Lessen et al., 2017 Venero Galanternik et al., 2017). Embora os três grupos não tenham a mesma opinião consensual, é tentador especular que muLECs podem ser o equivalente a células carregadas de lipídios, macrófagos perivasculares, células periteliais granulares fluorescentes ou 'Células de Mato' (Mato et al., 1981, 1996 Williams et al., 2001) que absorvem lipídios e lipoproteínas de baixa densidade de BVs meníngeas em mamíferos. Na verdade, os muLECs tornam-se alongados e acumulam uma grande quantidade de gotículas lipídicas após uma dieta aguda com alto teor de colesterol. Além disso, eles são capazes de captar e limpar macromoléculas por meio de receptores de manose (van Lessen et al., 2017 Venero Galanternik et al., 2017). É necessária uma investigação comparativa adicional entre peixes e mamíferos para compreender os papéis e a importância dos muLECs.

Canal de Schlemm (SC): intermediário linfático e glaucoma

SC é um canal revestido de endotélio que circunda a córnea e fornece uma rota vascular única para o fluxo do humor aquoso, que atualiza constantemente a câmara anterior do olho (Fig. 3 A). O humor aquoso, continuamente produzido pelo corpo ciliar, flui para a câmara anterior e é drenado para as veias aquosa e episcleral através da rede trabecular e SC. SC tem semelhanças morfológicas, moleculares e funcionais com LVs. Em 2014, vários grupos de pesquisa independentes (Aspelund et al., 2014 Kizhatil et al., 2014 Park et al., 2014 Truong et al., 2014) descobriram que SC representa um novo tipo de vaso intermediário, que expressa marcadores LEC Prox1, VEGFR3 e integrina α9, mas não LYVE1 e podoplanina. O SC primitivo é formado por ECs sanguíneos que brotam da veia coroidal, e os ECs SC são reespecificados pós-natalmente para adquirir fenótipos linfáticos por meio da regulação positiva de Prox1, que também parece atuar como um biossensor molecular para o fluxo de humor aquoso (Park et al., 2014). É importante ressaltar que Tie2 é expresso antes de Prox1 em CEs SC e é mantido em um alto nível para regular criticamente a integridade SC durante a idade adulta (Kim et al., 2017). Assim, os CEs SC parecem originar-se de progenitores de CE venosos Tie2 + (Aspelund et al., 2014 Kizhatil et al., 2014 Park et al., 2014). Outro importante regulador de SC é a sinalização VEGF-C / VEGFR-3, que é crítica para a formação e diferenciação de SC. Surpreendentemente, a suplementação de VEGF-C também pode induzir o crescimento de SC em adultos, levando a uma redução da pressão intraocular no modelo de glaucoma idoso (Aspelund et al., 2014).

O humor aquoso é drenado rapidamente transcelularmente por meio de CEs SC, causando a formação de vacúolos gigantes (Fig. 3, B e C). Quando o CS está prejudicado, a drenagem do humor aquoso é impedida e a pressão intraocular é aumentada, levando ao glaucoma (Jonas et al., 2017). A este respeito, o glaucoma induzido por SC defeituoso também pode ser considerado como "linfedema ocular". No entanto, a patogênese que envolve os defeitos do SC no glaucoma ainda é pouco compreendida. Curiosamente, fenótipos de glaucoma congênito primário foram detectados em modelos de camundongos de dupla Angpt1/Angpt2 exclusões ou Tie2 deleção durante o período pós-natal, destacando a importância do sistema angiopoietina (Angpt) -Tie2 no desenvolvimento do CS (Thomson et al., 2014). Na verdade, Tie2 mutações foram identificadas em pacientes com glaucoma congênito primário (Souma et al., 2016). No entanto, embora a taxa de incidência de glaucoma congênito primário seja baixa, o glaucoma primário de ângulo aberto é freqüentemente observado em idosos. Um estudo recente (Kim et al., 2017) mostrou que duplo Angpt1/Angpt2 exclusões ou Tie2 a deleção em camundongos adultos prejudica gravemente a integridade do SC e a transcitose de fluido do humor aquoso transcelular, levando a pressão intraocular elevada, danos aos neurônios da retina e comprometimento da função das células ganglionares da retina, que são todas marcas do glaucoma primário de ângulo aberto. Accordingly, Tie2 reactivation using a Tie2 agonistic antibody relieved the phenotype in double Angpt1/Angpt2-deleted mice and rejuvenated the SC in aged mice (Kim et al., 2017). These findings provide not only a novel molecular pathway in understanding pathogenesis of primary open-angle glaucoma but also a new therapeutic avenue for its treatment.

Sinusoidal LVs in LNs

LNs are highly dynamic secondary lymphoid organs where antigens, together with costimulatory signals, are delivered by afferent LVs (Fig. 4 A). LN LVs are extended lymphatic networks from peripheral afferent LVs, which continue to form the subcapsular sinus (SCS), stretch into the medullary sinus, and ultimately exit as efferent LVs. LVs traverse through densely packed aggregations of immune cells, predominantly B and T cells and such architecture facilitates intimate interaction between LN LVs and immune cells, directly influencing immune responses. Thus, LN LVs efficiently transport antigens and innate immune cells from various organs to naive lymphocytes in LNs, which is one of the crucial steps for the initiation and regulation of adaptive immune response as well as for the maintenance of immune tolerance (Junt et al., 2008 Randolph et al., 2017). During the acute phase of local tissue inflammation, robust lymphangiogenesis, stimulated by VEGF-A, C and D secreted from infiltrated, activated macrophages, occurs in the draining LN, and subcapsular LN LVs proliferate and penetrate deep into the cortex (Kataru et al., 2009). In this situation, activated B cells also contribute to LN lymphangiogenesis to promote dendritic cell (DC) mobilization from the inflamed tissue to LN (Angeli et al., 2006). As shown in helminth infection model, VEGF-A and VEGF-C production by B cells and mesenteric LN lymphangiogenesis relies on lymphotoxin-dependent feed-forward cross-talk of B-cells and surrounding follicular reticular cells (Dubey et al., 2017). Interferon-γ secreted from activated T cells can be a negative but balancing regulator that suppresses LN lymphangiogenesis during inflammation resolution (Kataru et al., 2011).

LN LECs produce several factors that regulate leukocyte trafficking, delivery of inflammatory signals, modulation of T cell activation, and development of secondary lymphoid organs. LECs regulate the exit of immune cells via efferent LVs by secreting S1P, generated by sphingosine kinases with the S1P lyase enzyme, creating an S1P gradient important for immune cell egress through efferent LVs (Fig. 4 A Pham et al., 2010). In addition to its role in T cell trafficking, LN LEC-derived S1P promotes naive T cell survival by sustaining their mitochondrial function and oxidative phosphorylation (Mendoza et al., 2017). Integrin α9β1 on LECs is also necessary for LN lymphocyte egress, and the interaction between integrin α9β1 and its ligand tenascin-C has been shown to enhance the production of S1P by LECs (Ito et al., 2014). LN LECs are also an important source of interleukin-7, critical for lymphocyte expansion during LN remodeling (Onder et al., 2012). Interleukin-7 expression by LECs also provides a niche for memory T-helper cells in inducible bronchus-associated lymphoid tissues during allergic inflammation in lung (Shinoda et al., 2016). LN LECs produce immunosuppressive factors, such as TGF-β, indoleamine-2,3-dioxygenase, and nitric oxide to maintain peripheral tolerance to self-antigen in lymph (Fig. 4 B Lukacs-Kornek et al., 2011 Malhotra et al., 2012). Of note, LN LECs directly express peripheral tissue antigens and induce deletional tolerance in CD8 + T cell via PD-1–PD-L1 or LAG-3–MHC-II pathways (Rouhani et al., 2015). Moreover, a subset of LECs was shown to provide antigens to DCs, which then induced CD4 + T cell anergy (Rouhani et al., 2015). On the other hand, Dubrot et al. (2014) also reported that LECs can acquire preloaded peptide–MHC-II complexes from DCs to induce CD4 + T cell tolerance. Overall, LN LECs play multiple tolerogenic roles against self-antigens by directly presenting a variety of peripheral tissue antigens for CD8 + T cell deletional tolerance, whereas they also induce CD4 + T cell tolerance via antigen transfer to or from DCs (Fig. 4 B).

Tumors produce lymphangiogenic growth factors, tumor antigens, and premetastatic signals to tumor draining LNs even before LN metastasis (Karaman and Detmar, 2014 Ogawa et al., 2014 Dieterich and Detmar, 2016). COX-2/PGE2-EP3–dependent induction of VEGF-C and VEGF-D in macrophages and DCs induces tumor-induced LN lymphangiogenesis (Ogawa et al., 2014). Interestingly, LECs of tumor draining LNs are capable of scavenging and cross-presenting tumor antigens, which induce dysfunction of CD8 + T cells (Lund et al., 2012). Tumor and tumor draining LN–derived VEGF-C promotes these processes and accelerates metastasis (Lund et al., 2012). In addition to follicular DCs, proliferating SCS LECs can capture or act as a reservoir for persistent viral antigens, contributing to the development of an effective memory CD8 + T cell pool with increased effector function and protective capacity (Fig. 4 B Tamburini et al., 2014). This beneficial role of LN LECs can be exploited to improve efficacy of vaccines against viral infections.

SCS LECs and medullary sinusoidal LECs have distinct features including cellular organization, expression profiles, roles, and responses to inflammation (Fig. 4 A Iftakhar-E-Khuda et al., 2016). For instance, macrophage scavenger receptor 1 is selectively expressed by SCS LECs and regulates the binding and transmigration of lymphocytes entering from peripheral tissues into LN parenchyma, whereas endomucin produced by medullary sinusoidal LECs presumably regulates lymphocyte trafficking via L-selectin (Iftakhar-E-Khuda et al., 2016). Medullary sinusoidal LECs also produced the highest levels of peripheral tissue antigens and PD-L1 and therefore play a key role in the deletion of alloreactive CD8 + T cells (Cohen et al., 2014). SCS LECs, but not peripheral LECs, express plasmalemma vesicle-associated protein (also known as MECA-32 Rantakari et al., 2015). The SCS floor allows the entrance of only small (<70 kD and <4 nm) solutes, which are then rapidly transported through the LN parenchyma to BVs by conduits, a specialized tubular meshwork formed by extracellular matrix from follicular reticular cells. Plasmalemma vesicle-associated protein plays a central role in such selective barrier function of subcapsular sinusoids by forming molecular “sieves” or diaphragms covering transendothelial channels in SCS LECs, which then prevents the passage of larger solutes to follicular reticular cell conduits (Fig. 4 A Rantakari et al., 2015).

A substantial degree of specialization is also present in the SCS LECs, where LECs facing the LN capsule (or “ceiling” LECs) express high levels of a CCL21/CCL19 decoy chemokine receptor CCRL1. Polarized CCRL1 expression creates a CCL21 gradient, allowing the directional DC migration into the LN paracortex to reach T cells (Ulvmar et al., 2014). Ceiling LECs are LYVE1 negative and also produce CCL1 chemokine (Das et al., 2013), whereas floor LEC are LYVE1 positive. The floor LEC layer is interspersed with CD169 + SCS macrophages, which take up antigens and pathogens (Fig. 4 A). Interestingly, although DCs are able to transmigrate directly through the floor of the SCS, naive T cells use the medullary sinus to reach LN parenchyma however, transmigrating DCs also induce structural alterations in the SCS floor, which allows subsequent homing of T cells through the SCS (Braun et al., 2011). Onder et al. (2017) recently highlighted a new role of LECs in LN formation. Different from the prevailing LN formation model (Mebius, 2003 van de Pavert and Mebius, 2010), this study reports that that initiation of LN development requires lymphoid tissue inducer cell-mediated activation of LECs and that the engagement of mesenchymal stromal cells is a subsequent event. Mechanistically, LN initiation is mediated mainly through receptor activator of the NF-κB signaling–noncanonical NF-κB pathway in LVs and is driven by CCL21 and S1P receptor–dependent retention of lymphoid tissue inducer cells in the LN anlage (Onder et al., 2017).

Lacteals and lymphatic vasculature in the small intestine

In addition to the common task of all LVs in transporting interstitial fluid and immune cells, the intestinal lymphatic vasculature plays a major role in the uptake and transport of dietary fat. In mammals, dietary lipids are repackaged in enterocytes into large (200–1,000 nm) triglyceride-loaded particles or “chylomicrons,” which are secreted basally into intestinal stroma. In addition to triglycerides, chylomicrons can also incorporate fat-soluble vitamins and drugs, as well as some microbiota components, such as bacterial lipopolysaccharides (Bernier-Latmani and Petrova, 2017). The single lymphatic capillary located at the center of each small intestinal villus, called a lacteal, takes up chylomicrons and other interstitial fluid components from villi and transports them to the submucosal and mesenteric collecting LVs (Fig. 5, A and B). The lymphatic vascular plexus, located in the intestinal muscular layer, drains independently to the mesenteric collecting LVs. Intestinal lymph is transported to the mesenteric LNs and thoracic duct and is subsequently released into the blood circulation (Fig. 5 A). Through these transport processes, lipid-soluble drugs can directly access the target organs while bypassing the liver, where most of drugs are degraded (Trevaskis et al., 2015). The mechanism and selectivity of chylomicron uptake into lacteals are not entirely clear and may involve both intercellular transport through LEC junctions and intracellular transport across LECs in vesicles (Bernier-Latmani and Petrova, 2017). Periodic squeezing of lacteals, which is mediated by the contraction of surrounding longitudinal smooth muscle cells in intestinal villi controlled by the autonomic nervous system, allows efficient drainage of absorbed lipids into the collecting vessel network (Choe et al., 2015).

Although the majority of adult LVs are quiescent, intestinal lacteals exhibit low but detectable proliferation under steady-state conditions and frequently harbor filopodia, indicating an ongoing lymphangiogenic response (Bernier-Latmani et al., 2015 Bernier-Latmani and Petrova, 2016). Mechanistically, maintenance of lacteal integrity and fat transport function requires continuous Notch and VEGF-C–VEGFR-3 signaling, with VEGF-C being supplied by the surrounding smooth muscle cells (Fig. 5 C Bernier-Latmani et al., 2015 Nurmi et al., 2015). Lacteals are characterized by a mix of both continuous zipper junctions and discontinuous button-like junctions, and loss of Notch signaling impairs the formation of mature button-like junctions (Bernier-Latmani et al., 2015). Optimal junctional organization and transport function of lacteals also require adrenomedullin-calcitonin receptor signaling lymphatic-specific inactivation of calcitonin receptor results in intestinal lymphangiectasia and protein-losing enteropathy (Davis et al., 2017). Identification of the specific lacteal transcriptome will be important to further understand the molecular mechanisms underlying the functional specialization of lacteals.

The intestine harbors a large population of immune cells whose task is to maintain and fine-tune the balance between immune tolerance to the myriad of commensal intestinal bacteria and ingested harmless antigens and responses against potential pathogens. Similar to other tissues, CCR7-expressing DCs migrate into intestinal lymphatics in response to the CCL21 gradient generated by LECs. The transport of food antigens by CD103 + DCs to mesenteric LNs appears to be a key step in the establishment of oral tolerance through the induction of mesenteric LN T reg cells (Pabst and Mowat, 2012). Production of such T reg cells is also maintained by lymphatic trafficking of DCs after ingestion of apoptotic intestinal epithelial cells, which are continuously produced as a result of rapid intestinal epithelium turnover (Cummings et al., 2016). The CCR7 + Rorgt + subset of intestinal innate lymphoid cells also egresses via intestinal LVs to mesenteric LNs, but the functional significance of such transport requires further investigation (Fig. 5 B Mackley et al., 2015). Given the importance of T cell trafficking via dermal LVs, it would also be interesting to characterize lymphatic transport of intestinal T cell subsets.

The role of LVs in intestinal pathological states, for example in inflammatory bowel disease (IBD), is attracting increasing attention (von der Weid et al., 2011 Bernier-Latmani and Petrova, 2017). Increased lymphangiogenesis and lymphatic vascular dysfunction, such as lymphangiectasia and intralymphatic lymphocyte stasis, have long been described as pathological features of Crohn’s disease (von der Weid et al., 2011). Data from animal models suggest that damage to lymphatic vasculatures and its unproductive expansion may be contributing or perhaps even initiating factors in IBD (Bernier-Latmani and Petrova, 2017). Diphtheria toxin–mediated conditional ablation of LVs in the intestine leads to rapid animal demise because of extreme disruption to the intestinal mucosal barrier and septic shock (Jang et al., 2013). Furthermore, impaired intestinal lymphatic vascular function or lymphangiogenic response exacerbates intestinal inflammation and worsens symptoms in experimental models of colitis (von der Weid et al., 2011 D’Alessio et al., 2014 Davis et al., 2017). Mice deficient in D6 decoy chemokine receptor, which is highly expressed by LECs and is necessary to restrict aberrant inflammatory leukocyte adhesion to LVs, develop more severe colitis, further underscoring a major role of LVs in resolution of intestinal inflammation (Vetrano et al., 2010 McKimmie et al., 2013). Conversely, even transient inflammation during acute intestinal infection has been shown to induce a long-lasting damage of LV function and gut immunity, suggesting that cumulative immunological scarring of intestinal LVs could underlie the development of IBD (Fonseca et al., 2015). In contrast, prolymphangiogenic therapy using adenoviral delivery of VEGF-C markedly reduces disease severity (D’Alessio et al., 2014). Further studies of molecular characteristics of intestinal lymphatic endothelium in homeostasis and diseases, together with identification of immune cell subsets that travel via LVs, will be important to better understand the mechanisms behind responses against pathological insults.

Perspectives and open questions

The discovery of lymphatic-specific molecular markers, growth factors and their receptors, and transcription factors transformed the field of lymphatic vascular biology and laid the foundations for further conceptual advances in understanding the mechanisms and functions of organotypic lymphatic vasculatures. Many questions are emerging in this rapidly developing field, some of which are outlined below.

Efficient in vitro LEC fate programming for tissue engineering

All tissue regeneration procedures, from wound healing to transplantation of engineered organs, demand adequate vascularization by both BVs and LVs. Therefore, reliable methods for the in vitro production of LECs will likely improve the outcomes. Prox1 overexpression partially reprograms mature blood ECs toward the LEC lineage, and several stimuli, such as retinoic acid, WNT, or constitutively active ERK signaling, facilitate acquisition of LEC phenotype (Marino et al., 2011 Deng et al., 2013 Bowles et al., 2014 Nicenboim et al., 2015). Furthermore, generation of fully differentiated LECs from human pluripotent stem cells is feasible (Lee et al., 2015). However, unlike for blood ECs (Orlova et al., 2014), questions regarding the best combination of transcription factors, extracellular inputs, and intracellular signaling cascades for driving LEC fate commitment still require definitive answers.

Degree and functional significance of LEC heterogeneity

The discovery of the developmental heterogeneity of LECs has raised several further questions. What are the origins of LECs in other organs, and what is the reason for the existence of multiple LEC sources? Can LECs of different origins be distinguished in mature vessels, and do such LECs participate equally in the growth and expansion of LVs during inflammation and regeneration? Single-cell sequencing approaches have already provided a host of important insights into the heterogeneity and population dynamics of immune and cancer cells (Papalexi and Satija, 2017) therefore, it is anticipated that the application of this methodology to LECs will open new perspectives for high-resolution mapping of LEC subpopulations in different organs and associated phenotypes.

Organ-specific lymphangiocrine signaling

BVs not only deliver oxygen and nutrients to tissues but also produce tissue-specific molecules that participate in organ repair and regeneration (Rafii et al., 2016 Augustin and Koh, 2017 Potente and Mäkinen, 2017). LECs are also capable of secreting distinguishable molecules, including growth factors, cytokines, and chemokines, which are defined as “lymphangiocrine” molecules. Most of such lymphangiocrine signals to date have been linked to the regulation of immune responses, especially in LNs (e.g., S1P, which promotes migration and survival of T cells). Identifying lymphangiocrine molecules in other organs and understanding how they contribute to the organ-specific function are essential future tasks to accomplish.

Maintenance of organ-specific differentiation

The transcriptional profiles of cultured human intestinal LECs differ from those of dermal LECs, indicating that some organ-specific features are conserved in vitro (Norrmén et al., 2010). However, standard cell culture conditions introduce significant biases when analyzing the specialized phenotypes of ECs. Analyses and comparisons of various “omics” of LECs isolated (1) from different organs, (2) at different stages of development, and (3) during tissue regeneration or in pathological conditions will undoubtedly be useful when characterizing their organotypic properties and identifying tissue-specific markers of LVs and the mechanisms for their maintenance. The current boom in the development of “organ-on-chip” devices will provide an important new opportunity for modeling and studying heterotypic interactions of LECs with other tissue components, including various epithelia, immune cell populations, and microbiota products.


Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration Em vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration em vitro.

Resumo

15 &mum/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2 .

Protocolo

1. Isolation of Human T Lymphocytes

    Obtain human blood from a healthy donor. Allow the blood to cool to room temperature (

2. Culture of Human T Lymphocytes

  1. Using a pipette, transfer the PBMC to a T-75 culture flask in 20 mL RPMI 1640 media containing 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin, and 1 &mug/mL phytohemagglutinin (PHA).
  2. Incubate at 37°C and 5% CO2 for at least 1 hour, and up to 24 hours. This step allows monocytes, which will be adherent to the flask surface, to be separated from the lymphocytes that remain in suspension. If a short incubation (1 hour) is used at this step, it is acceptable to use RPMI 1640 media containing 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin without supplementing with PHA as specified in step 2.1.
  3. Carefully remove all of the media from the flask, add it to a 50 mL conical tube, and centrifuge at 500 x g for 5 minutes.
  4. Resuspend the cell pellet, which now primarily contains lymphocytes, and transfer the cells to a new T-75 flask containing 25 mL RPMI 1640 media containing 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin, and 1 &mug/mL PHA.
  5. Incubate at 37°C for 3 days (2 days if the initial incubation of PBMC was overnight). After 24 hours of growth, it may be necessary to add 15-20 mL of fresh media and transfer to a larger T-175 flask.
  6. After 3 days, use a pipette to remove the media and suspended lymphocytes from the flask and transfer to a 50 mL conical tube. Centrifuge at 500 x g for 5 minutes.
  7. Resuspend the cell pellet and transfer cells to a new T-75 or T-175 flask containing 25 mL (T-75) or 50 mL (T-175) RPMI 1640 with 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin, and 20 ng/mL human IL-2 or IL-15.
  8. Grow lymphocytes for 4-7 days. If starting with a T-75 flask, the culture will need to be expanded and transferred to a T-175 flask after 1-2 days.

3. Em vitro Lymphocyte Migration Assay

  1. 1 day before the migration assay, coat a glass-bottom 0.17 mm dish with 20 &mug/mL Protein A or G in PBS overnight at 4°C.
  2. Wash the dish extensively with PBS.
  3. Immobilize human ICAM-1/Fc (10 &mug/mL) and human SDF-1 (2 &mug/mL) by adding these reagents in PBS solution to the dish and incubating 4 hours at room temperature.
  4. Prepare T lymphocytes by first determining the cell density in culture in the T-175 flask using a hemacytometer. Approximately 2-5 x 10 5 cells should be used per dish to achieve a cell density appropriate for migration analysis.
  5. Wash T lymphocytes twice with PBS and then resuspend in 1 mL L-15 media containing 1 mg/mL D-glucose.
  6. Wash the dish coated with ICAM-1/Fc and SDF-1 extensively with PBS.
  7. Transfer T lymphocytes in 1 mL media to the dish and maintain them at 37°C.

4. Capturing an Image Sequence Using NIS Elements Software

  1. Open NIS Elements software.
  2. In the camera settings menu, choose "2x2 binning" as the mode for both live imaging and image capture.
  3. Go to the Applications menu and choose Define/Run Experiment.
  4. Choose the length of time between images and the total length of the image capture sequence.
  5. Press the "Run" button to begin image acquisition.
  6. Cells can be tracked and migration parameters (velocity, path length, displacement, etc.) quantified using one of several software packages, including ImageJ, AutoQuant or Volocity (Figure 1).
  7. To generate a "spider web plot," the x-y coordinates for each cell and timepoint are collected (Figure 2) and projected onto a graph with a common starting point for each cell at the origin (Figure 3).

On day 6 of culture in the presence of either IL-2 or IL-15, T lymphocytes make up >98% of cells, as determined by positive CD3 staining as well as positive CD4 and/or CD8 staining. For IL-2, we found 83% CD4+ cells, 15% CD8+ and <1% CD4+CD8+ cells. For IL-15, we found 88% CD4+ cells, 11% CD8+ and <1% CD4+CD8+ cells. During T lymphocyte migration on ICAM-1/SDF-1 substrates, cells exhibited a velocity of approximately 15 &mum/min that can be sustained over a 1 hour time period. T lymphocyte migration on ICAM-1/SDF-1 is dependent on LFA-1-mediated adhesion, as an anti-LFA-1 ligand-blocking antibody severely inhibits migration.


Figure 1. Cell tracking of migrating T lymphocytes. T lymphocytes isolated from whole blood and cultured in the presence of IL-2 or IL-15 for 6 days were allowed to adhere and migrate on glass-bottomed dishes coated with 10 &mug/mL ICAM-1 and 2 &mug/mL SDF-1. Images were acquired every 10 seconds for 30 minutes. Cells were identified in each image and tracked over time using Volocity software. This movie shows the random migration of T lymphocytes at a velocity of

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Movie 1. Cell tracking of migrating T lymphocytes. T lymphocytes isolated from whole blood and cultured in the presence of IL-2 or IL-15 for 6 days were allowed to adhere and migrate on glass-bottomed dishes coated with 10 &mug/mL ICAM-1 and 2 &mug/mL SDF-1. Images were acquired every 10 seconds for 30 minutes. Cells were identified in each image and tracked over time using Volocity software. This movie shows the random migration of T lymphocytes at a velocity of


Figura 2. Spatiotemporal cell position. The X-Y coordinates of each cell were obtained for each time point using Volocity software.


Figura 3. "Spider web plot." Using the X-Y-t coordinates for each cell, 15 cells were chosen at random and plotted with a common starting point at the origin. Comparing spider web plots gives a quick visual depiction of differences in migration between different experimental conditions. Plots for T lymphocyte migration under control conditions (left panel) and in the presence of an anti-LFA-1 ligand-blocking antibody (right panel).

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Discussion

In this experiment, we provide details on a simple system to analyze the motility of primary human T lymphocytes. Em vitro migration assays have been used to dissect the roles of many molecules and signaling pathways involved in the locomotion of various cell types. Some critical controls to keep in mind when designing your own experiment from our protocol include: 1) Non-adhesive or non-integrin adhesive substrate coatings, such as bovine serum albumin (BSA) or poly-L lysine (PLL), respectively, 2) integrin-specific blocking antibody treatment to determine integrin specificity, and 3) co-coating without stimulatory signal, such as SDF-1 described in our protocol.


Resumo

There is a complex interaction between the brain and the cerebral vasculature to meet the metabolic demands of the brain for proper function. Preservation of cerebrovascular function and integrity has a central role in this sophisticated communication within the brain, and any derangements can have deleterious acute and chronic consequences. In almost all forms of cognitive impairment, from mild to Alzheimer disease, there are changes in cerebrovascular function and structure leading to decreased cerebral blood flow, which may initiate or worsen cognitive impairment. In this focused review, we discuss the contribution of 2 major vasoactive pathways to cerebrovascular dysfunction and cognitive impairment in an effort to identify early intervention strategies.


The Lungs and Respiration

Air is supplied to the lungs through the process of breathing. The diaphragm plays a key role in breathing. The diaphragm is a muscular partition that separates the chest cavity from the abdominal cavity. When relaxed, the diaphragm is shaped like a dome. This shape limits space in the chest cavity. When the diaphragm contracts, it moves downward toward the abdominal area causing the chest cavity to expand. This lowers the air pressure in the lungs causing the air in the environment to be pulled into the lungs through air passages. This process is called inhalation.

As the diaphragm relaxes, space in the chest cavity is reduced forcing air out of the lungs. This is called exhalation. Regulation of breathing is a function of the autonomic nervous system. Breathing is controlled by a region of the brain called the medulla oblongata. Neurons in this brain region send signals to the diaphragm and the muscles between the ribs to regulate the contractions which initiate the breathing process.


REAGENTS AND SOLUTIONS

Nuclei isolation buffer 1 (NIM1)

This buffer is used to prepare NIM2, which is used to make HB (step 2, Basic Protocol 2). Prepare in advance, mixing the components listed below, and store up to 6 months at 4°C. Volumes should be adjusted based on the number of samples being processed.

Nuclei isolation buffer 1 (NIM1)
Componente Volume (µl) Final Concentration (mM)
for 1 sample
1.5 M sucrose 625 250
(Sigma-Aldrich, cat. no. S0389)
2 M KCl 46.875 25
(Thermo Fisher Scientific, cat. no. AM9640G)
1 M MgCl2 18.75 5
(Thermo Fisher Scientific, cat. no. AM9530G)
1 M Tris‧Cl, pH 8 37.5 10
(Thermo Fisher Scientific, cat. no. AM9855G)
Nuclease-free water 3021.88
Total 3750

Nuclei isolation buffer 2 (NIM2)

This buffer is used to prepare HB (step 2, Basic Protocol 2). Prepare fresh, mixing the components listed below, and keep on ice. These numbers are calculated so that there is spare volume available, if needed. Adjust according to number of samples being processed.

Nuclei isolation buffer 2 (NIM2)
Componente Volume (µl) Final concentration (mM)
for 1 sample
NIM1 (see recipe) 1246.25
1 mM DTT 1.25 1 µM
(Thermo Fisher Scientific, cat. no. P2325)
50× Protease Inhibitor 25
(Roche, cat. no. 11873580001)
Total 1250

Homogenization buffer (HB)

Prepare fresh, mixing the components listed below, and keep on ice. These numbers are calculated so that there is spare volume available, if needed. Adjust according to number of samples being processed. See table below.

Homogenization buffer
Componente Volume (µl) for Final concentration (mM)
1 sample
NIM2 (see recipe) 1212.5
40 U/µl RNaseIn 12.5 0.4 U/µl
(Thermo Fisher Scientific, cat. no. AM2684)
20 U/µl SuperaseIn 12.5 0.2 U/µl
(Invitrogen, cat. no. AM2696)
10% (v/v) Triton X-100 12.5 0.10%
(Sigma-Aldrich, cat. no. T8787-100ML)
Total 1250

Storage buffer (SB)

Prepare fresh and keep on ice. These numbers are calculated so that there is spare volume available, if needed. Adjust according to number of samples being processed. See table below.

Storage buffer
Componente Volume (µl) for Final concentration (mM)
1 sample
Phosphate-buffered saline (PBS1× Invitrogen, cat. no. 10010-049) 995
Bovine serum albumin (BSA Sigma-Aldrich, cat. no. A4503-10G) 40 mg 4%
40 U/µl Protector RNaseIn 5 0.2 U/µl
(Sigma-Aldrich, cat. no. 03335402001)
Total 1000

Printing Vascular Tissue

Printing vessel vasculature is essential for sustaining functional living tissues. Until now, bioengineers have had difficulty building thick tissues, lacking a method to embed vascular networks.
A 3D bioprinting method invented at the Wyss Institute and Harvard SEAS embeds a grid of vasculature into thick tissue laden with human stem cells and connective matrix. Printed within a custom-made housing, this method can be used to create tissue of any shape.
Once printed, an inlet and outlet own opposite ends are perfused with fluids, nutrients, and cell growth factors, which control stem cell differentiation and sustain cell functions. By flowing growth factors through the vasculature, stem cells can be differentiated into a variety of tissue cell types.
This vascularized 3D printing process could open new doors to tissue replacement and engineering.

Crédito: Wyss Institute da Harvard University


Assista o vídeo: Série Homenagem - Isolando Levedura. Criando meio de cultura 2 (Dezembro 2022).