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Que diferença no raio de rotação das proteínas pode ser considerada significativa?

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Em simulações de dinâmica molecular de proteínas, o raio de giração é frequentemente usado para avaliar a compactação de uma proteína.
Ao comparar dois raios de giração de proteínas, que diferença pode ser considerada significativa 1 angstrom, 5 angstroms, 10 angstroms? Significado significativo: sim, é definitivamente mais compacto ou não, definitivamente não é mais compacto. Tenho pesquisado, mas não consigo encontrar nenhuma referência relacionada a isso.


Que diferença no raio de rotação das proteínas pode ser considerada significativa? - Biologia

O papiloma invertido (IP) é um tipo de tumor em que as células epiteliais da superfície crescem para baixo no tecido de suporte subjacente. A bexiga, a pelve renal, o ureter, a uretra, o nariz e os seios paranasais são áreas possíveis para a ocorrência de IP [1]. Epistaxe e obstrução nasal com dor facial ou cefaleia atacadas quando o nariz ou a mucosa dos seios da face apresentam o IP [2]. Embora o IP originado da membrana respiratória de contorno pertença a uma neoplasia epitelial benigna, a invasividade local, maior taxa de recorrência e transformação maligna tornam seu tratamento difícil [3]. A taxa de transformação maligna é 5 & # x201310 & # x25 e muitos deles são sincrônicos apresentando-se com carcinoma de células escamosas [4]. O PCNA (antígeno nuclear de proliferação celular) atua como expressão do antígeno no núcleo celular na fase de síntese do DNA durante o ciclo celular e considera o prognóstico do câncer, mas a relação com o IP ainda é controversa [5].

A ciclina e a quinase dependente de ciclina (CDK) desempenham papéis importantes no ciclo celular durante a proliferação e afetam diferentes fases do ciclo celular [6 & # x2013 9]. O CDK1 é um iniciador crucial para a proliferação celular e fator de transformação maligna [10]. Ao contrário, os inibidores de p21, P27 e CDK, limitam os CDKs e interrompem o ciclo celular [8]. O p21 é um inibidor dos CDKs da fase da célula G1 que restringem a entrada das células na fase S. O p27 também pode se ligar a CDKs e atuar como CDKI como p21. O p27 interage com os complexos ciclina E-CDK2, ciclina A-CDK2 e ciclina D1-CDK4, afetando a proliferação celular e a apoptose [6, 7].

O antígeno marcador de proliferação Ki-67, detectado com o anticorpo monoclonal MIB-1, é expresso em todas as fases das células G1, S, G2 e M, exceto G0 [8]. A expressão de Ki-67 também se correlacionou com o comportamento do tumor, grau patológico do tumor e recorrência precoce em vários carcinomas [11 & # x2013 15].

Com relação aos IPs transformados ou sincronizados com cânceres, também fazemos o estudo IHC de p16, p53, Ki-67 e PLUNC (palato, pulmão e proteína do clone do epitélio nasal). A p16 é uma proteína supressora de tumor que desacelera a fase G1 para a célula S e previne a transformação maligna [8]. PLUNC é um material imune inato que tem um efeito anticâncer para o câncer nasofaríngeo, mas nenhum estudo revelou sua relevância para IPs nasossinusais [16].

Levantamentos de PCNA, p53, p21, p27 e Ki-67 foram feitos para ver se eles estavam correlacionados com as extensões do tumor e o resultado do tratamento de IPs nasossinusais [8].

O objetivo deste estudo é investigar os papéis dos reguladores do ciclo celular p53, p21, p27, marcador de proliferação Ki-67, p16, PCNA e material imune inato PLUNC na recorrência e transformação maligna para IPs nasossinusais. Também pesquisamos se os possíveis fatores previstos de Ki-67, PCNA e p27 se correlacionam com CDKs por simulação computacional, finalmente para dar uma possível explicação para o mecanismo de Ki-67, PCNA e p27 para os CDKs no prognóstico de IPs.

Do Hospital da Universidade de Medicina do Departamento da China de janeiro de 2000 a junho de 2010, 60 casos de IPs nasossinusais e 10 casos de IPs com transformação de carcinoma de células escamosas foram coletados e revisados ​​dos prontuários médicos de maneira retrospectiva. Todos os tecidos fixados em formalina 10 & # x25 e preparados em parafina foram usados ​​para estudos de IHC pelo método do complexo avidina-biotina-peroxidase. Anticorpos monoclonais de camundongo (mAb), anti-p16 (Neomarcadores, DCS-50, 200 & # x2009mg / L), anti-p21 (Neomarcadores, MS 387-P, 200 & # x2009mg / L), anti-p27 (Neomarcadores, MS 256 -P, 200 & # x2009mg / L), anti-p53 (Neomarcadores, RM 9105-S), Ki-67 (Neomarcadores RM 9106-S) PCNA e PLUNC (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA) foram usados para imunohistoquímica pelo método da estreptavidina-biotina peroxidase [11]. O xileno foi usado para desparafinar todas as secções de tecido e depois reidratado por séries de álcool e finalmente saturado em água destilada. Em seguida, o tecido foi deslocado para solução salina tamponada com fosfato com adição de 0,3 & # x25 solução de peroxidase de hidrogênio para bloquear a atividade da peroxidase endógena à temperatura ambiente por 10 & # x2009 min, e então o tampão Tris lavado em seguida. As seções foram então fervidas em um forno de micro-ondas por 15 & # x2009min em solução tampão de citrato (10 & # x2009mmol / L pH, 6,0). Os anticorpos primários p53, p21, p27, p16, PCNA, Ki-67 e PLUNC foram aplicados um a um durante 60 & # x2009 min à temperatura ambiente [11].

Em seguida, adicionamos o anticorpo de ligação e o complexo de estreptavidina peroxidase (DAKO LSAB Kit, K-0675 Carpinteria, CA) por 15 & # x2009min em temperatura ambiente. O tetrahidrocloreto de diaminobenzidina 0,05 & # x25 (DAB) foi usado por 15 & # x2009 min para a coloração do tecido e finalmente lavado duas vezes pelo tampão Tris [8, 11].

As secções foram contrastadas com hematoxilina Mayer & # x2019s após lavagem com água desionizada. Os núcleos imunocorados foram quantificados em cada caso. Todas as contagens foram realizadas em um microscópio de luz padrão em campo 1000x para avaliar núcleos positivos / número total de células. Dez campos ou pelo menos 500 células foram contados em cada seção. As seções do tumor foram consideradas negativas se a coloração estava ausente ou presente em & # x3c10 & # x25 das células tumorais. Uma pontuação de 1+ foi dada quando 10 & # x201330 & # x25 das células foram positivas para a reação. Uma pontuação de 2+ foi dada quando 30 & # x201350 & # x25 das células foram positivas para a reação. Uma pontuação de 3+ foi dada quando & # x3e 50 & # x25 das células foram positivas para a reação, respectivamente (Tabelas 1 e 2) [17]. A significância estatística foi analisada por meio do teste qui-quadrado de Pearson ou teste exato de Fisher para análise univariada e o teste de regressão logística múltipla foi usado para análise multivariada. Os resultados foram considerados estatisticamente significativos quando o valor P era & # x3c 0,05.

A correlação dos resultados de IHQ com a recorrência múltipla em univariante pelo quadrado de Pearson Xi e análise de regressão multivariada logística.

A correlação dos resultados de IHQ com a transformação maligna em univariante pelo quadrado de Pearson Xi e análise de regressão multivariada logística.

O docking proteína-proteína foi realizado pelo programa ZDOCK [18] para analisar os três possíveis fatores prognósticos para transformação maligna ligada a CDK1. Para tornar o mecanismo possível para o que encontramos neste estudo, calculamos a interação do Ki-67, p27 e PCNA para CDK1 por biologia computacional. Além disso, utilizamos o programa GROMACS 4.5.5 [19] para observar a estabilidade dos complexos após as predicações de ligação ZDOCK. O ambiente do sistema MD foi definido na modelagem de água TIP3P com caixa d'água à distância de 1,2 & # x2009nm que continha íons Na e Cl na concentração de NaCl 0,145 & # x2009M para neutralização do sistema. Primeiro, definimos etapas de 5.000 ciclos no algoritmo de descida mais íngreme para minimização de energia. Em segundo lugar, as condições de dinâmica de temperatura constante (tipo NVT) foram empregadas para fornecer simulação MD para equilíbrio e realizadas no período de 1 & # x2009ns. Na etapa final, a pressão constante e a dinâmica da temperatura (tipo NPT) foram definidas para a execução da produção no período de 5000 & # x2009ps. A temperatura do sistema durante o processo de simulação foi definida como 310 & # x2009K. Para a análise da trajetória, empregamos o software GROMACS 4.5.5 para contar a raiz do desvio quadrático médio (RMSD) e o raio de giração (Rg), respectivamente. Uma série de dados de conformação MD foi pesquisada a cada 20 & # x2009ps de todas as execuções de produção.

Havia um total de 55 homens e 15 mulheres incluídos neste estudo. Sessenta deles são IPs e os outros 10 são IPs nasossinusais coletados com transformação maligna. A idade é 45,64 & # xb1 14,45 anos variando de 25 a 78 anos. As manchas revelaram níveis significativamente elevados de PLUNC, mas diminuíram os níveis de Ki-67, p53, p21 e p27 em pacientes com recorrência múltipla de IPs (Tabela 1). Também encontramos PCNA, Ki-67 e p27 elevados nos IPs nasossinusais com transformação de carcinoma de células escamosas em comparação com os IPs nasossinusais isolados sem malignidade síncrona (Tabela 2). A expressão elevada de PLUNC está correlacionada à cirurgia de múltiplos seios nasais em pacientes com IPs nasossinusais. No entanto, o nível de expressão PLUNC não está correlacionado com a transformação maligna de IPs em SCC. Também mostramos a expressão de IHC de diferentes níveis para PCNA, Ki-67, p27 e PLUNC nas Figuras 1, 2, 3 e 4. A ressonância magnética ou tomografia computadorizada pré-operatória foram realizadas em todos os pacientes conforme as Figuras 5 e 6.

A expressão PCNA IHC (a) +++ e (b) 0 em IPs.

A expressão Ki67 IHC (a) +++ e (b) 0 em IPs.

A expressão p27 IHC (a) +++ e (b) 0 em IPs.

A expressão PLUNC IHC (a) +++ e (b) 0 em IPs.

Visão sinoscópica do papiloma nasossinusal invertido com transformação maligna.

RM de seios paranasais (visão coronária) e tomografia computadorizada de seios paranasais (visão axial) de papiloma nasossinusal invertido com transformação maligna.

A coloração imunohistoquímica Ki-67 elevada é encontrada em ambos os IPs nasossinusais com múltiplas recorrências e transformação maligna em nossa análise univariada e multivariada pelo teste qui-quadrado de Pearson & # x2019s e teste de regressão logística múltipla, conforme mostrado nas Tabelas 1 e 2 e na Figura 2 (a ) Portanto, o alto índice Ki-67 pode ser considerado um fator importante para o prognóstico e marcadores preditos de malignidade. Poderíamos até mesmo combinar a pesquisa do nível de expressão de Ki-67 e PCNA IHC significativamente aumentado e o nível de p27 mais baixo para prever a tendência de transformação maligna mais alta em pacientes com IPs nasossinusais em nossa pesquisa.

Consequentemente, fizemos algumas análises de docking com estudos de dinâmica molecular final entre o que encontramos os fatores de prognóstico de PCNA e CDK1, Ki-67 e CDK1, e p27 e CDK1, que todos mostraram docking estável na Figura 7 e sua pontuação de docking também é mostrada por Programa ZDOCK. O ZDOCK gerou as 10 primeiras poses de encaixe de CDK1 e Ki-67, CDK1-p27 e CDK1-PCNA. Escolhemos a melhor pontuação de docking para analisar a estabilidade da interação proteína-proteína. O Ki-67, p27 e PCNA para a pontuação de ligação de CDK1 são 20,92, 21,72 e 24,32, respectivamente pelo programa ZDOCK. Os resíduos-chave são Gly9, Ser10, Ile11, Leu12, Lys13, Lys14 e Val15 que foram os principais domínios de ligação para Ki-67 e p27 ao CDK1 mostrado em fita vermelha (Figura 7). Além disso, fizemos análises de MD para esses resíduos-chave para ver a interação dessas três proteínas com o CDK1. Após a simulação MD do complexo CDK1 com Ki-67, p27 e PCNA, realizamos a análise RMSD para tempos de simulação de 5000 & # x2009ps. Todas as três proteínas (Ki-67, p27 e PCNA) revelaram ter flutuação estável após 1000 & # x2009ps de tempo de simulação (Figura 8).

As melhores poses de encaixe de CDK1 (verde) com a proteína alvo (azul): (a) Ki-67, (b) p27 e (c) PCNA. Os dez principais complexos de proteína-proteína com pontuações ZDOCK foram gerados pelo programa ZDOCK. A pontuação ZDOCK mais alta de Ki-67, p27 e PCNA são 20,92, 21,72 e 24,32, respectivamente. Os resíduos de ligação de chave de Ki-67 e p27 são coloridos em vermelho e os resíduos de chave incluem Gly9, Ser10, Ile11, Leu12, Lys13, Lys14 e Val15.

A análise RMSD de todos os átomos de complexos de CDK1 com (a) Ki-67, (b) p27 e (c) PCNA durante 5000 & # x2009ps tempos de simulação. Todos os complexos tendem a uma flutuação estável após o tempo de simulação de 1000 & # x2009ps.

Na Figura 9, calculamos a giração do raio das proteínas para o período de simulação de 5000 & # x2009ps. Os três complexos tendem a valores baixos de raio de giração e flutuação estável ao longo de toda simulação MD, o que indica os complexos compactados entre cada estrutura da proteína. O método SASA (área de solvente) foi utilizado para a natureza hidrofóbica dos três complexos, estes três tornaram-se flutuações estáveis ​​e também apresentaram alteração hidrofóbica estável entre cada interação proteína-proteína (Figura 10). Além do cálculo da energia total dos sistemas MD para cada um dos três complexos durante os tempos de simulação de 5000 & # x2009ps, todos eles tiveram variação de energia estável na faixa de & # x22129.27 & # xd7 10 5, & # x22129.30 & # xd7 10 5 e & # x22121.66 & # xd7 10 6, respectivamente (Figura 11). O resultado da análise de energia revela que todos os sistemas de simulação são estáveis ​​durante 5000 & # x2009ps. Na análise de flutuação de resíduos, medimos o valor RMSF de todos os resíduos para os três complexos (Figura 12). Na validação RMSF do complexo CDK1-Ki67, existem flutuações significativas observadas nos resíduos de 38 a 43 de CDK1, que apresenta grande alteração durante a simulação MD (Figura 12 (a)). Também houve variação significativa observada nos resíduos de 25 a 40 na estrutura da proteína p27 durante a simulação MD, o que denota as grandes mudanças nesta região. Pelo contrário, há menos variação de RMSF nos resíduos de 100 a 200 na estrutura da proteína PCNA durante a simulação MD. Portanto, houve menos alteração de RMSF durante a simulação de MD em PCNA do que Ki-67 e p27.

O raio de giração de complexos de CDK1 com (a) Ki-67, (b) p27 e (c) PCNA durante 5000 & # x2009ps tempos de simulação. Os baixos valores do raio de giração indicam os complexos compactados entre duas estruturas de proteínas.

A análise SASA (área de solvente) de todos os complexos de conformação para definição hidrofóbica durante 5000 & # x2009ps a flutuação estável não indicou nenhuma mudança distinta entre as interações proteína-proteína.

Cálculo de energia total de sistemas MD de (a) Ki-67, (b) p27 e (c) PCNA durante 5000 & # x2009ps tempos de simulação, cada uma das flutuações médias são & # x22129,27 & # xd7 10 5, & # x22129. 30 & # xd7 10 5 e & # x22121.66 & # xd7 10 5, respectivamente.

Análise de RMSF de resíduos de proteína em (a) CDK1 e Ki-67, (b) CDK1 e p27, e (c) CDK1 e PCNA durante o tempo de simulação de 5000 & # x2009ps. O alto valor da flutuação de RMSF denota uma forte variação da estrutura da proteína em todas as simulações de MD.

No entanto, a análise de migração revelou que o PCNA tinha uma grande distância entre o CDK1 em comparação com o Ki-67 e o p27 durante a pesquisa de simulação de DM de 5000 & # x2009ps. Embora tenhamos encontrado a maior distância entre PCNA e CDK1 (Figura 13 (a)), mas sua ligação estável foi mostrada na Figura 12 por análise de RMSF. Além disso, o deslocamento quadrático médio (MSD) do PCNA tem menor migração (Figura 13 (b)). Analisamos ainda os resíduos-chave de CDK1 para ligação de Ki-67 e p27. O resíduo de ligação chave inclui Gly9, Ser10, Ile11, Leu12, Lys13, Lys14 e Val15 no ângulo dos diédricos da estrutura da proteína Ki67-CDK1 durante o tempo de simulação de 5000 & # x2009ps. Todos os resíduos de ligação são estáveis ​​durante toda a simulação MD. No entanto, havia apenas ângulos diédricos estáveis ​​em Gly9, Ser10, Leu12 e Val15 em complexos de proteína p27-CDK1 ao longo de todo o tempo de simulação MD. Finalmente, descobrimos que todos os resíduos de ligação chave, incluindo Gly9, Ser10, Ile11, Leu12, Lys13, Lys14 e Val15 na estrutura da proteína PCNA-CDK1 tinham ângulo de diedro de ligação estável durante toda a simulação de MD, nenhuma mudança maior foi encontrada durante o processo de Ligação de PCNA a CDK1 (Figura 14). As análises de cluster foram usadas para selecionar a estrutura representativa entre todos os quadros MD. Para o ensaio de comparação instantâneo, a estrutura representada selecionada a partir dos últimos grupos de agrupamento para todos os quadros MD de complexos CDK1 de Ki67, P27 e PCNA deslocados em 4860 & # x2009ps, 2740 & # x2009ps e 3880 & # x2009ps, respectivamente, durante o tempo de simulação de 5000 & # x2009ps (Figura 15). O estudo de comparação instantâneo para CDK1 e proteínas alvo para Ki-67, p27 e PCNA são mostrados na Figura 16. Descobrimos que os resíduos de CDK1 de 38 a 43 em CDK1 estão chegando perto de Ki-67 de 0 & # x2009ps a 4860 & # x2009ps (Figura 16 (a)). O resultado é correlacionado à análise de RMSF devido às altas flutuações nos resíduos de 38 a 43 de ligações de CDK1 para Ki-67. Para a análise de instantâneo CDK1-p27, o p27 está se aproximando do CDK1 de 0 & # x2009ps a 2740 & # x2009ps. Os resultados também estão correlacionados com a análise de RMSF por causa das grandes variações nos resíduos de 25 a 40 de ligação de p27 para CDK1 (Figura 16 (b)). Nós só pudemos encontrar a pequena mudança de um loop de PCNA (azul) se afastando de CDK1 (verde) em 3880 & # x2009ps nos resíduos de 100 a 200 na interação de PCNA e CDK1 (Figura 16 (c)). Este resultado também está correlacionado com a análise de RMSF para pequenas flutuações nos resíduos de 100 a 200 de ligações de PCNA para CDK1.

A análise de migração de complexos durante o tempo de simulação de 5000 & # x2009ps: (a) a distância entre CDK1 e as proteínas acopladas ao longo de todo o tempo MD e (b) a análise de deslocamento quadrático médio (MSD) para todos os complexos de CDK1, o alto valor de MSD denota a grande distância da migração da proteína da posição inicial.

O ângulo diedro dos resíduos de ligação da chave: (a) Gly9, (b) Ser10, (c) Ile11, (d) Leu12, (e) Lys13, (f) Lys14 e (g) Val15 na estrutura da proteína CDK1 durante o tempo de simulação de 5000 & # x2009ps. Os ângulos diédricos foram calculados para complexos de CDK1 com proteínas de ligação alvo: Ki-67, p27 e PCNA ao longo de todo o tempo de simulação MD.

Análises de cluster de todas as CDK1 e as proteínas de ligação: (a) Ki-67, (b) p27, e (c) PCNA durante o tempo de simulação de 5000 & # x2009ps, as estruturas representadas foram selecionadas a partir dos últimos grupos de agrupamento para todos os quadros MD de CDK1 complexos. A estrutura representada do complexo Ki-67, p27 e PCNA deslocada em 4860 & # x2009ps, 2740 & # x2009ps e 3880 & # x2009ps, respectivamente.

Comparação entre o instantâneo inicial (0 & # x2009ps) e a conformação representada para todos os complexos CDK1. (a) Um dos loops CDK1 (verde) moveu a aproximação para Ki-67 (azul) a 4860 & # x2009ps. (b) A estrutura da proteína de p27 (azul) ligada a CDK1 (verde) mais firmemente em 2740 & # x2009ps. (c) Um dos laços PCNA (azul) se afastou de CDK1 (verde) a 3880 & # x2009ps.

Para resumir os resultados em nosso estudo e revisões de literatura, o mecanismo molecular de Ki-67, p27 e PCNA interagindo com CDK1 para proliferação de células e transformação maligna em pacientes com IP nasossinusal é mostrado na Figura 17.

O mecanismo molecular de Ki-67, p27 e PCNA no ciclo celular.

Embora os papilomas invertidos raramente ocorram no trato nasossinusal, a natureza recorrente fácil e a transformação maligna freqüentemente incomodam pacientes e médicos.O acompanhamento regular ao longo da vida é necessário para a detecção precoce de recorrência ou alteração maligna e pode levar a um melhor controle da doença para pacientes com IPs [9, 20].

O Ki-67 promoveu o início da fase G1 a partir do G0 em células IPs, e persistiu a expressão para o ciclo celular em fase de proliferação. Ki-67 é uma proteína que afeta o ciclo celular na fase de proliferação de G1-S-G2-M exceto a fase G0 [8, 11, 14]. Na literatura relatando que as mutações p53, p63, p21 e p27 induziram IP nasossinusal com transformação de SCC, ainda havia debates [6, 11, 14]. Ki-67 foi recentemente relatado para a ocorrência de neoplasia nasossinusal [21], o comportamento agressivo do tumor correlacionou-se com o índice Ki-67 mais alto e causou o epitélio nasal a displasia grave e até carcinoma de células escamosas [22]. O Ki-67 elevado pode até ser encontrado nos carcinomas de células escamosas contidos em IPs sincronicamente. Ki-67 também afetará p21, p27 e CDKs [8, 11, 12, 14]. No entanto, não podemos concluir se a diminuição do p27 é causada pela expressão elevada de Ki-67 em tecidos nasossinusais IPs. Mais estudos são necessários para elucidar a relação entre Ki-67 e P27.

A função de supressão tumoral do p53 está relacionada a muitos cânceres relatados por Katori et al. e Gujrathi et al. [22, 23]. Eles sugeriram que o teste de p53 pode ajudar a rastrear lesões de papiloma com potencial para displasia ou carcinoma; no entanto, não encontramos significância na análise multivariada. Isso se deve ao número limitado de pacientes em nosso estudo. No entanto, não apenas o p53, mas também o p63 é elevado expresso em IPs com transformação maligna [11].

A atividade proliferativa aumentada com expressão elevada de Ki-67 de células tumorais foi relatada como um importante marcador de prognóstico em muitos tumores humanos, também é importante na recorrência de IPs e cancerização. Especialmente, o suspeito de Ki-67 afeta diretamente o ciclo celular durante a fase de proliferação e poderia interagir com os genes supressores de tumor p53, p21 e p27 e modula o ciclo celular afetando o ponto de verificação da fase G1 [8, 24, 25]. O Ki-67 recentemente descobriu ter interação entre CDK1 na estrutura da natureza e biologia molecular [26] e CDK1 tem o papel principal na proliferação celular e até mesmo na transformação maligna [10]. Suspeitamos que o Ki-67 não apenas iniciou a entrada das células IPs na fase G1 do ciclo celular, mas também causou a transformação maligna em núcleos celulares ao afetar o CDK1.

Os papéis clínicos de p21 e p27 para a cancerização do CEC de cabeça e pescoço ainda são debates, mas descobrimos que o nível mais baixo de p27 também se revelou em IPs nasossinusais com transformação maligna em nosso estudo. Embora houvesse poucos estudos de p21 e p27 relatando a correlação de IPs humanos com cancerização, os debates ainda permaneceram. Alguns foram com Oncel et al. [11, 27] e alguns foram contra [25, 28] observado.

Além do Ki-67, também encontramos o PCNA, um preditor de transformação maligna de IPs na colaboração com CDK1. Em nossos IPs com transformação maligna, tanto PCNA quanto Ki-67 foram elevados por colorações de IHC.

Como a expressão elevada de PCNA mostrou em IP com transformação maligna de nossa pesquisa, suspeitamos que o PCNA seja um fator importante para induzir a cancerização para pacientes com IP nasossinusal. Recentemente, também é encontrado o PCNA elevado no IP em relação aos pólipos nasossinusais de Mumbuc et al. [3]. O PCNA poderia interagir com o CDK1 e promover a entrada da célula no ciclo celular para a conseqüente proliferação e cancerização.

Finalmente, pesquisamos o PLUNC para os IPs nasossinusais com cancerização, uma vez que é frequentemente relatado como causador da formação de câncer nasofaríngeo. Em nosso estudo anterior, a expressão de PLUNC estava diminuída na sinusite de pseudomonas em estado de doença crônica [29]. O PLUNC também foi correlacionado à rinossinusite crônica com colonização por múltiplas bactérias [17]. E, além disso, o PLUNC também deveria ter função antiinfecciosa e antibiofilme [30, 31]. Porque era suposto ter anticancerígeno de carcinoma nasofaríngeo [32], mas não encontramos correlação de PIs nasossinusais com transformação de CEC. Ao contrário, só pudemos encontrar a expressão elevada de PLUNC em pacientes com IPs nasossinusais com múltiplas recorrências e cirurgia de revisão dos seios da face. O mecanismo adicional e as razões para a expressão elevada de PLUNC e múltiplas recorrências devem ser pesquisados ​​no futuro.

O projeto de drogas auxiliado por computador (CADD) pode ser usado para investigar mais a pesquisa clínica ou de doenças, incluindo pesquisas de doenças [33], estudos de fatores de risco [34], relatos de casos e mecanismo molecular. Em nossos resultados de docking e dinâmica molecular de PCNA, Ki-67 e p27 para CDK1, descobrimos que todos os três tinham docking estável para CDK1. E o p27 deveria ter uma interação mais estável com o CDK1 para funcionar como um inibidor de IPs nasossinusais com cancerização. O PCNA e o Ki67 foram considerados promotores e promovem a proliferação e cancerização celular em IPs nasossinusais.

Em conclusão, este é um primeiro estudo mostrando que o Ki-67, PCNA e p27 são todos importantes nas recorrências de IPs e cancerização via CDK1. E também somos os primeiros a encontrar expressão elevada de PLUNC em múltiplos IPs nasossinusais de recorrência. No entanto, mais pesquisas sobre o mecanismo ainda se justificam no futuro. Os estudos computacionais atuais são todos compatíveis com nossos estudos de laboratório úmido, o que torna nosso estudo mais confiável e pode ser aplicado ao futuro tratamento de pacientes com essa doença. Portanto, pacientes com IP nasossinusal e expressaram Ki-67 elevado, PCNA e p27 diminuído devem ser considerados como tendo maiores possibilidades de transformação maligna e devem ser acompanhados mais de perto na prática clínica [35].


Clonagem molecular e caracterização de um (Lys)6-Tagged Sulfide-Reactive Hemoglobin I from Lucina pectinata

Uma etiqueta poli-Lys foi fundida ao Lucina pectinata sequência codificadora da hemoglobina I (HbI) e purificada usando um processo rápido e eficiente. HbI é uma hemeproteína que se liga ao sulfeto de hidrogênio (H2S) com alta afinidade e tem sido usado para entender reações fisiologicamente relevantes desta molécula de sinalização. O (Lys)6A construção rHbI marcada foi expressa em E. coli e purificado por imobilização em uma matriz de troca catiônica, seguido por cromatografia de exclusão por tamanho. A identidade, estrutura e função da (Lys)6O rHbI marcado foi avaliado por espectrometria de massa, espalhamento de raios-X pequeno e amplo, espectroscopia óptica e análise cinética. Os resultados de espalhamento e espectroscópico mostraram que o (Lys)6rHbI marcado é estrutural e funcionalmente análogo à proteína nativa, bem como ao (His)6-rHbI marcado. Estudos de cinética com H2S indicou que a associação (k sobre) e dissociação (k desligado) as constantes de taxa foram 1,4 × 10 5 / M / se 0,1 × 10 −3 / s, respectivamente. Este resultado confirmou que o (Lys)6-tagged rHbI liga H2S com a mesma alta afinidade de seu homólogo.

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Resultados

A digestão com tripsina fornece peptídeos resistentes à digestão (DRPs) estáveis ​​para todas as isoformas de conglutina

Isoformas de conglutina de amendoim, Ara h 2.02, Ara h 2.01 e Ara h 6, foram digeridas por incubação com tripsina. A Fig. S1 suplementar mostra o curso do tempo da digestão conforme visualizado por eletroforese em gel de poliacrilamida de dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE) sob condições de redução. Os peptídeos originados da digestão permanecem estáveis ​​até o ponto final de 180 minutos de nosso estudo para todas as isoformas de conglutina. Os DRPs da isoforma Ara h 2.02 consistem em dois grupos, com massas moleculares aparentes de aproximadamente 12 kDa e 10 kDa. Os DRPs de Ara h 2.01 exibem um peso molecular aparente de aproximadamente 10 kDa e o exame cuidadoso desta área revela duas bandas co-migrantes. Os DRPs de Ara h 6 migram em bandas de aproximadamente 9 kDa e 5 kDa. Para posterior caracterização, foram usados ​​DRPs preparados por digestão por 90 minutos. Em condições fisiológicas usando pepsina em pH baixo seguida por tripsina / quimiotripsina em pH neutro, as conglutinas de amendoim também são resistentes à proteólise. Os PRMs resultantes têm pesos moleculares semelhantes aos analisados ​​em nosso estudo, e ainda podem se ligar a IgE (dados não mostrados), de acordo com outros estudos 13,22.

Identificação de sequências de DRPs de isoformas de conglutina de amendoim

Os espectros de massa de alta resolução foram registrados para DRPs não reduzidos e reduzidos e alquilados de isoformas Ara h 2, Ara h 2.02 e Ara h 2.01 e Ara h 6. Espectros ESI-MS de DRPs não reduzidos, reduzidos e alquilados são mostrados nas Figs 1 e 2, respectivamente. Para DRPs não reduzidos, uma ampla gama de íons m / z com estados de carga mais elevados (de +8 a +17) é observada, que representam massas com massas moleculares & gt13 kDa. Os espectros de massa para esses DRPs não reduzidos também contêm íons m / z com estados de carga mais baixos (de +2 a +6), representando as massas & lt5 kDa. DRPs reduzidos e alquilados fornecem uma faixa de estado de carga de +4 a +12, representando as massas de 2,2–10 kDa. Nos espectros dos DRPs reduzidos e alquilados, pode-se observar que um íon de estado de carga dá várias massas m / z, desviando 57 Da um do outro. Isso se refere à alquilação parcial de cisteínas. A Tabela Suplementar S1 resume as massas encontradas para os DRPs, tanto da forma não reduzida quanto da forma reduzida e alquilada. A tripsinólise de Ara h 2.02 e 2.01 levou a DRPs de massas moleculares de 16,2–17,6 kDa, bem como a alguns pequenos peptídeos de 2–4 kDa (ver Tabela Suplementar S1). Ara h 6 mostrou DRPs de massas moleculares de 13,5–14,1 kDa. Levando em consideração a modificação pós-tradução conhecida, processamento pós-tradução e combinação das massas de DRP intacto e reduzido e alquilado usando o mapeamento de ligações dissulfeto 19, as massas experimentais foram ligadas a massas teóricas (ver Tabela Suplementar S1).

DRPs não reduzidos foram submetidos a ESI-MS para determinar as massas de peptídeos individuais. Os péptidos podem ser ligados por ligações dissulfureto. Painel a: DRPs de Ara h 2.02 Painel b: DRPs de Ara h 2.01 Painel c: DRPs de Ara h 6.

DRPs reduzidos e alquilados foram submetidos a ESI-MS para determinar as massas de peptídeos individuais. Painel a: DRPs de Ara h 2.02 Painel b: DRPs de Ara h 2.01 Painel c: DRPs de Ara h 6.

Perfis de eletroforese bidimensional (2-DE) de DRPs de isoformas de conglutina individuais (ver Fig. S2 suplementar) foram usados ​​para atribuir pontos, onde diferentes valores de pI de DRPs forneceram instruções adicionais para verificação de peptídeo. A Figura 3 fornece uma visão geral das sequências peptídicas encontradas nos DRPs das três conglutinas de amendoim. Após a digestão, detectamos proteínas com uma ligação peptídica hidrolisada no Arg59/71 para Ara h 2 e Arg50 para Ara h 6 (Fig. 3. Painel a - Ara h 2.02, peptídeos a e b Painel b - Ara h 2.01, peptídeos b, c, d ee Painel c - Ara h 6, peptídeos a e b) , que após a redução produz dois peptídeos com pesos moleculares de 7,2-9,7 kDa para Ara h 2 e 4,8-9,4 kDa para Ara h 6. Nos DRPs intactos de Ara h 2, um processamento proteolítico C-terminal do fragmento Y / RY foi observada 29, mas também clivagem no local de clivagem de tripsina Arg149/137-Asp150/138. Além disso, os peptídeos com segmentos curtos internos deletados (S48TR50 em Ara h 6 e D61PYSPSPYDRR71 em Ara h 2,02). Em DRPs de Ara h 2, segmentos internos foram detectados a partir de Asp35 ou Asp42 (Fig. 3. Painel a - Ara h 2.02 péptidos f, g e h, Painel b - Ara h 2.01 péptido f). Esses peptídeos curtos não contêm resíduos de cisteína e não permanecem associados ao núcleo de proteína estável. O terminal N do Ara h 6 após a digestão mostrou alguma diversidade do terminal N (proteólise em Arg5 ou Arg7, Fig. 3. Painel c - Ara h 6 peptídeos a – d). Para todas as três conglutinas, as partes mais susceptíveis à digestão são os terminais N e C e, em menor grau, uma parte interna limitada. É evidente que em todas as três isoformas de conglutina, o principal local interno de ataque de tripsina é estruturalmente idêntico (R59| R60| D61PYSPSPYDRR71| G72 em Ara h 2.02, R58| R59| G60 em Ara h 2.01 e R47| S48TR50| S51 em Ara h 6), localizado no loop que não possui estrutura local definida. Suplementar Fig. S3 contém alinhamento de sequência das isoformas de conglutina com atribuição de elementos de estrutura secundária e diagrama de topologia 2D mostrando as pontes dissulfeto.

Usando a sequência das conglutinas intactas (linha superior de cada painel), os peptídeos identificados são mostrados nas linhas subsequentes (indicadas com letras). Cada linha representa um peptídeo único encontrado. As linhas marcadas com ‘R’ representam peptídeos que são liberados do núcleo da proteína após a digestão. Painel a: Sequências de DRPs de espécies de proteína Ara h 2.02 Painel b: Sequências de DRPs de espécies de proteína Ara h 2.01 Painel c: Sequências de DRPs de espécies de proteína Ara h 6.

A estrutura secundária das isoformas da conglutina do amendoim não é afetada pela digestão e a simulação dinâmica molecular revela estruturas conformacionalmente estáveis ​​de PRM

Os espectros de dicroísmo circular (CD) de UV Far foram adquiridos em pH 8 e pH 1,2, a 37 ° C, a fim de se obter um melhor entendimento das propriedades estruturais dos DRPs de Ara h 2,02, Ara h 2,01 e Ara h 6. Os espectros de as três isoformas nativas mostram uma forte elipticidade positiva de 200 a 190 nm, tipicamente indicando a presença de estruturas α-helicoidais (gráficos de linha na Fig. 4). A forma do espectro de CD de UV distante de DRPs é semelhante ao das proteínas nativas (gráficos de traços na Fig. 4). O cruzamento zero, ou seja, o comprimento de onda na elipticidade de 0 mdeg, é o mesmo para DRPs e isoformas nativas, confirmando que nenhuma mudança notável na estrutura secundária ocorreu como resultado da degradação da proteína intacta em fragmentos menores. As conglutinas nativas e seus DRPs têm espectros de CD ultravioleta altamente comparáveis ​​em pH neutro e baixo pH, indicando que nenhuma desnaturação ocorre no estômago.

As conglutinas nativas e seus DRPs foram analisados ​​por espectroscopia de CD de UV distante para investigar o conteúdo da estrutura secundária, tanto em pH neutro quanto em pH baixo para simular as condições gástricas e duodenais. As linhas sólidas representam as conglutinas de amendoim nativas. As linhas pontilhadas representam os DRPs das respectivas conglutinas. Painéis superiores (a, b, c) em pH = 8,0, painéis inferiores (d, e, f) em pH = 1,2. Painéis esquerdos (a, d): Ara h 2.02 Painéis intermediários (b, e): Ara h 2.01 Painéis direitos (c, f): Ara h 6.

Para analisar as consequências da ação proteolítica para as três isoformas, uma simulação de dinâmica molecular foi realizada nas proteínas intactas e digeridas por 500 ns para Ara h 2 e 800 ns para Ara h 6. De acordo com as flutuações quadradas médias da raiz do backbone (RMSF ), pode-se notar que ambas as isoformas de Ara h 2 têm três regiões com alta mobilidade: a parte N-terminal flanqueadora até a primeira Cys, a parte C-terminal do último resíduo Cys até o final da sequência, e uma região que é quase toda a alça não estruturada entre o segundo e o terceiro resíduo Cys (Fig. 5a, b). A mobilidade das regiões Ara h 6 é semelhante, exceto que a parte C-terminal não é móvel devido a um dissulfeto localizado no C-terminal da proteína (Fig. 5c). Os locais de clivagem de tripsina são marcados com uma seta na Fig. 5 para os DRPs e estes são considerados para análise de dinâmica molecular posterior. Além disso, a Fig. 5d-f mostra os locais de clivagem sensíveis à tripsina para todos os DRPs identificados neste estudo (Fig. 3). Pode-se observar que os valores de RMSF de quase todos os locais sensíveis à tripsina encontrados neste estudo são maiores que 0,60 Å, (Fig. 5d-f), enquanto os locais resistentes à tripsina estão virtualmente mostrando valores de RMSF menores que 0,70 Å. Na verdade, o valor preditivo positivo para a suscetibilidade dos locais de corte alvo nas conglutinas de amendoim à tripsinólise é de 83%, para a resistência à ação proteolítica é de 87%, se o valor de RMSF de corte foi estabelecido em 0,65 Å.

Painéis superiores (a, b, c): Conglutinas intactas, painéis inferiores (d, e, f): Locais afetados por tripsina em DRPs. Painéis esquerdos (a, d): Ara h 2.02 Painéis intermediários (b, e): Ara h 2.01 Painéis direitos (c, f): Ara h 6. As setas indicam os locais afetados pela tripsina. A linha azul representa a sequência da proteína. Linhas verdes representa as partes das sequências de proteínas que contêm a hélice α como estrutura secundária C representa a cisteína que está envolvida na formação da ligação dissulfureto.

Quatro mínimos locais de RMSF podem ser vistos com & lt0,5 Å, correspondendo às regiões α-helicoidais (Fig. 6), ou seja, o núcleo de proteína altamente estruturado. De acordo com a Fig. 6, que representa os valores RMSF sobrepostos da proteína intacta com seus DRPs correspondentes, a mobilidade local dos DRPs demonstra um padrão semelhante, incluindo regiões α-helicoidais com mínimos RMSF. A Figura 7 representa a estrutura 3D da proteína intacta sobreposta com seu DRP correspondente. Nos DRPs, apenas uma pequena mudança conformacional pode ser observada, para Ara h 2 no loop não estruturado e na região C-terminal, e para Ara h 6 desvios são observados no loop não estruturado e na região N-terminal , enquanto as regiões α-helicoidais permaneceram em sua estrutura helicoidal sem qualquer movimento helicoidal e rearranjo para todas as isoformas de conglutina (Fig. 7), e até mesmo se tornaram ligeiramente menos dinâmicas. Estes resultados indicam que a proteólise não altera substancialmente a estabilidade conformacional das proteínas.

Painel a: Comparação de Ara h 2.02 e seu DRP (Fig. 3a, peptídeo d) Painel b: Comparação de Ara h 6 e seu DRP (Fig. 3c, peptídeo d). As setas representam os mínimos do RMSF cuja posição está localizada na região α-helicoidal da proteína. As linhas verdes representam as partes das sequências de proteínas, que contêm hélice α como estrutura secundária.

Painel a: Ara h 2.02 Painel b: Ara h 6. A estrutura em vermelho representa a conformação de proteínas intactas e a estrutura em azul representa DRP (peptídeo d da Fig. 3a, c). As setas mostram locais de clivagem, indicando que as partes não estruturadas são afetadas.

O desvio quadrático médio da raiz (RMSD) e o raio de giração dos DRPs foram calculados avaliando os desvios espaciais na estrutura. Esta análise confirmou ainda a compactação dos DRPs (ver Figs suplementares S4 e S5). Durante todo o tempo de simulação, os DRPs de Ara h 2 e Ara h 6 mostram um perfil de RMSD mais baixo, sugerindo que eles são mais estáveis ​​do que as proteínas intactas correspondentes.

Os valores do raio de giração (Rg) revelam um gráfico inferior de DRPs durante todo o tempo de simulação e implicam que os DRPs têm uma conformação visivelmente mais compacta em comparação com a proteína intacta. A estrutura mais compacta de DRPs do que as proteínas intactas correspondentes (com efeito mais pronunciado no caso de Ara h 2), bem como maior compactação de Ara h 6 do que Ara h 2, está de acordo com as mudanças nos elementos da estrutura secundária da proteína durante o simulação (ver Fig Suplementar S6), por exemplo visivelmente maior conteúdo de hélices em DRPs do que em proteínas Ara h 2 intactas e maior conteúdo de hélices em Ara h 6 do que em Ara h 2.Isso pode ser explicado pela perda de sequências de aminoácidos não estruturadas, resultando em uma fração maior de elementos estruturados nos produtos de digestão.

Peptídeos resistentes à digestão exibem propriedades de ligação de IgE como isoformas de conglutina nativas

A ligação de IgE de DRPs de Ara h 2 e Ara h 6 foi avaliada por eletroforese em gel 2D combinada com imunotransferência. A Figura 8a mostra que as três isoformas deram origem a pontos de ligação de IgE. Os DRPs de Ara h 6 têm mais pIs ácidos do que os DRPs das isoformas Ara h 2. O immunoblotting de IgE também revela manchas adicionais com pesos moleculares mais elevados. Isto representa uma pequena fração de Ara h 6 intacta, que permanece após 90 min de digestão, conforme observado em SDS-PAGE e 2-DE. As manchas que não se ligaram a IgE (a & lt10 kDa e com pI ácido) pareceram originar-se de Ara h 6 (Fig. 8a e Fig. S2 suplementar).

Painel a: eletroforese 2-D (esquerda) e eletroforese 2-D com Imunoblot de IgE de DRPs da mistura Ara h 2 / h 6. M: Marcadores moleculares Painel b-d: Potência de ligação de IgE determinada por IgE-ELISA de peptídeos resistentes à digestão (linhas tracejadas) e conglutina nativa (linhas sólidas). Um exemplo típico é mostrado (Painel b: Ara h 2.02 Painel c: Ara h 2.01 Painel d: Ara h 6). As potências de ligação de IgE dos DRPs são semelhantes às das conglutinas intactas.

Além disso, a potência de ligação de IgE dos DRPs em comparação com a da conglutina de amendoim intacta foi avaliada em um nível quantitativo por IgE-ELISA. A Figura 8 (painéis b – d) mostra os gráficos de inibição de Ara h 2.02, Ara h 2.01 e Ara h 6 e seus DRPs. Para Ara h 2.02 e Ara h 6, os gráficos de inibição de DRPs estão virtualmente sobrepostos aos das proteínas intactas. Para Ara h 2.01, há uma pequena mudança para uma concentração mais alta, sugerindo uma potência de ligação de IgE ligeiramente mais baixa. A partir de três experimentos independentes, o IC médio50 valores (a concentração necessária para inibir 50% do sinal) foram obtidos e o aumento da IC50 valor entre DRPs e proteínas intactas foi determinado. Para Ara h 2,02, Ara h 2,01 e Ara h 6, este aumento foi de 0,8 (± 0,4), 1,4 (± 1,4) e 1,5 (± 0,6), respetivamente. Como esses números estão próximos de 1, pode-se concluir que a potência de ligação de IgE de todas as três isoformas da conglutina de amendoim não é afetada pela tripsinólise.


Resultados

Para elucidar a dinâmica das proteínas de membrana periférica, usamos a dinâmica de partículas dissipativas (DPD), uma técnica de simulação de granulação grossa que é comumente usada para simular membranas na escala mesoscópica [30]. Nesta abordagem, grupos de átomos são combinados em grânulos eficazes que são os blocos de construção de construções mais complexas, e. lipídios e proteínas. As contas interagem por meio de potenciais eficazes e estão sujeitas a um termostato (consulte Métodos para obter detalhes).

(a) Modelo de um lipídio L com uma única cabeça hidrofílica (cinza) e três contas de cauda hidrofóbicas (amarelo). (b) Um modelo de proteína com raio consistia em uma única camada hexagonal (contas de diâmetro) de contas hidrofílicas (vermelhas) e três camadas de contas de cauda hidrofóbicas (azul). (c) Instantâneo de uma membrana de L lipídios e cinco cópias embutidas de (água não mostrada para melhor visibilidade).

Para modelar um sistema de água, lipídios e proteínas de membrana periférica, usamos três tipos de esferas que representam grupos hidrofílicos, grupos hidrofóbicos e água. Os lipídios (denotados como) foram construídos como polímeros lineares consistindo em um único grupo de cabeça hidrofílica e contas de cauda hidrofóbicas (Figura 1a). Utilizamos como lipídio padrão. Proteínas de membrana periférica (denotadas como) foram modeladas como cilindros com seção transversal hexagonal, consistindo em uma camada de cordão hidrofílica e hidrofóbica que formam a âncora de membrana (Figura 1b). As contas dentro do cilindro foram conectadas com molas harmônicas para obter estruturas protéicas bastante rígidas e compactas semelhantes às vistas na natureza como consequência de interações covalentes e não covalentes da cadeia polipeptídica. O raio das proteínas foi determinado pelo número de contas ao longo da seção transversal hexagonal de uma proteína,. Nós nos concentramos em PMPs com comprimento de âncora de membrana. Em todas as simulações, as proteínas foram inseridas em bicamadas lipídicas pré-montadas com um tamanho de patch de (Figura 1 c). Aqui, a escala de comprimento DPD intrínseca corresponde a. Antes de registrar as posições de todas as contas em função do tempo, os sistemas foram equilibrados com um barostato para um estado livre de tensão (cf. Métodos).

Perturbação de bicamadas lipídicas por proteínas de membrana periférica

Em primeiro lugar, caracterizamos uma bicamada lipídica que consiste em lipídios sem nenhuma proteína incorporada. A espessura desta bicamada era (distância média entre os centros dos grupos de cabeças de lípidos de folhetos opostos, cf. Figura 2). A espessura de um folheto era (distância média entre os centros do grupo da cabeça e os centros do grânulo da cauda terminal dentro de um folheto conforme a Figura 2). A distância entre os folhetos foi (distância média entre os centros das contas da cauda terminal em folhetos opostos cf. Figura 2). O parâmetro de ordem orientacional dos lipídios, sendo o ângulo médio entre os lipídios e a bicamada normal, assumiu um valor. Dados os extremos (quando os lipídios são orientados paralelamente à bicamada normal, para orientação aleatória), o valor observado indica uma bicamada lipídica razoavelmente ordenada, mas fluida.

Ao incorporar um PMP em uma bicamada lipídica, os dois folhetos são perturbados de maneira característica. As regiões entre as posições médias da cabeça lipídica e as contas terminais da cauda nos dois folhetos são mostradas como listras coloridas. O plano intermediário neutro e imperturbado é indicado como linha tracejada. Um único PMP foi inserido no folheto inferior (formato indicado na região). Membrana imperturbada e espessura do folheto, e, são indicados longe da proteína. (a) Ao inserir proteínas curtas (isto é, e) o folheto superior dobrou em direção ao plano médio não perturbado, enquanto o folheto inferior permaneceu quase imperturbado. (b) Para âncoras de membrana mais longas (), o folheto superior dobrou para longe do plano médio devido à interferência estérica dos lipídios com a porção hidrofóbica oposta da proteína. O folheto inferior dobrou apenas ligeiramente para dentro, resultando em um espessamento local da membrana. Além disso, a espessura do folheto superior,, foi ligeiramente reduzida devido à compressão estérica.

A fim de sondar as alterações da forma da bicamada e da configuração dos lipídios ao incorporar uma proteína da membrana periférica na membrana, inserimos uma única com raio e aumento do comprimento hidrofóbico () na bicamada. Após o equilíbrio, a inclinação da proteína em relação à bicamada normal foi muito modesta (). Apenas a proteína mais curta,, mostrou uma inclinação um pouco melhorada () com flutuações aumentadas. O último também se reflete na distribuição dos ângulos de inclinação da proteína que foi ligeiramente mais amplo do que para todos os outros PMPs (dados não mostrados). Esta observação sugere que assume uma configuração ligeiramente menos estável dentro da membrana em comparação com proteínas com porções hidrofóbicas mais longas.

Em seguida, monitoramos o perfil da seção transversal perturbada da membrana, ou seja, as posições médias dos centros do grupo da cabeça do lipídio e dos centros do grânulo da cauda do lipídio terminal. Em geral, perturbações marcadas eram visíveis em regiões de membrana próximas à proteína (Figura 2 a). Quando a porção hidrofóbica da proteína não alcançou o folheto oposto (e, Figura 2 a), o folheto oposto foi parcialmente dobrado em direção ao plano intermediário não perturbado. O folheto no qual a proteína foi incorporada permaneceu quase imperturbável e, portanto, a membrana era mais fina perto da proteína, ou seja. A menor perturbação foi observada para a qual o comprimento da porção hidrofóbica () correspondeu aproximadamente à espessura do folheto não perturbado (). Para PMPs com uma porção hidrofóbica mais longa (), o folheto oposto dobrou para longe do plano médio (Figura 2 b). As deflexões absolutas do plano médio no limite do PMP aumentaram quase linearmente com o comprimento da fração hidrofóbica, ou seja, para. O folheto no qual o PMP foi incorporado apenas dobrou ligeiramente na mesma direção (Figura 2b), ou seja, um aumento líquido na espessura da membrana () próximo à proteína emergiu.

Em seguida, determinamos a espessura dos folhetos da membrana, ou seja, a distância média das cabeças de lipídios e extremidades da cauda dentro de um folheto. O folheto no qual o PMP foi inserido mudou sua espessura apenas marginalmente, qualquer que seja a proteína inserida (dados não mostrados). O folheto oposto ao PMP, no entanto, mostrou mudanças significativas dependendo do comprimento da porção hidrofóbica (Figura 3 a). Em particular, para e uma forte compressão do folheto emergiu enquanto um comprimento da porção hidrofóbica teve apenas um efeito insignificante, uma vez que a porção hidrofóbica era muito curta para penetrar fortemente no folheto oposto. Esse achado é corroborado pela observação de que os lipídios apresentaram diminuição no parâmetro orientacional, ou seja, alinharam-se menos com a bicamada normal, ao se situarem bem em frente a essas proteínas (Figura 3b). No entanto, proteínas mais curtas também induziram uma mudança na orientação dos lipídios no folheto oposto: Aqui, os lipídios se alinharam mais fortemente com a bicamada normal, ou seja, aumentaram. Dentro do folheto no qual a proteína foi incorporada, a orientação do lipídio também foi afetada próximo ao PMP. Perto de, os lipídios foram inclinados com mais força, ao passo que eles se alinharam melhor ao longo da superfície normal para proteínas com uma porção hidrofóbica mais longa. Assim, em todos os casos, a liberdade dos lipídios é restringida, ou seja, desvia-se do valor não perturbado, que é entropicamente desfavorável.

(a) Ao inserir uma construção, a espessura do folheto oposto é significativamente alterada perto da proteína em relação ao valor não perturbado. A compressão do folheto aumenta quando o comprimento da porção hidrofóbica é aumentado. (b) O parâmetro de ordem de orientação dos lipídios (sendo o ângulo médio dos lipídios com a bicamada normal) no folheto superior e inferior também é afetado nas proximidades de um PMP. Apenas longe da proteína uma convergência para o valor não perturbado é observada. De acordo com a compressão local do folheto superior, uma inclinação mais forte dos lipídios é observada diretamente no lado oposto ao do PMP. Legenda como em (a).

Para complementar os resultados acima, também analisamos a distância média entre os folhetos, ou seja, a distância média dos centros dos grânulos lipídicos terminais em cada folheto (cf. também a Figura 2). Como resultado, encontramos uma distância reduzida () próximo à proteína mais curta, enquanto que para nenhuma alteração em relação a foi observada. Para proteínas mais longas () a distância aumentou em,, e, respectivamente.

Em resumo, nossos resultados sobre a inclinação lipídica e a espessura da bicamada estão de acordo com observações anteriores [31]. Indo além desses resultados, também quantificamos as perturbações de cada monocamada e o comprimento de acoplamento alterado das monocamadas.

Difusão de proteínas de membrana periférica

Tendo quantificado as perturbações locais da membrana induzidas pela incorporação de uma proteína de membrana periférica em uma bicamada lipídica, perguntamos a seguir como essas proteínas se difundem dentro da membrana. Para proteínas transmembrana, a famosa relação Saffman-Delbruck [32] prevê uma dependência logarítmica de tamanho para raios pequenos () (1) Aqui, e são a espessura e a viscosidade da membrana, é o raio da proteína, é a constante de Euler e é o soma das viscosidades do fluido acima () e abaixo () da membrana [33]. A validade da Eq. (1) foi confirmado por simulações [34] e experimentos [35] - [37].

Para investigar se a difusão dependente do tamanho das proteínas da membrana periférica também é descrita pela Eq. (1), incorporamos PMPs únicos () de raios variados () em uma bicamada lipídica (). Devido ao uso de potenciais soft-core no DPD, o momento e o transporte de massa acontecem na mesma escala de tempo, permitindo, portanto, uma quantificação sólida das propriedades de transporte, mesmo em sistemas razoavelmente pequenos. Após o equilíbrio, a posição de uma proteína foi rastreada por etapas. Durante este período, as proteínas se moveram em média uma distância de. A partir da série temporal de posições, determinamos o deslocamento quadrático médio da proteína (média do tempo). O coeficiente de difusão foi obtido posteriormente pelo ajuste do deslocamento quadrático médio. A incerteza na determinação do coeficiente de difusão foi menor do que a julgada por várias execuções para as mesmas configurações de parâmetro. Como referência, também determinamos os coeficientes de difusão de uma proteína transmembrana com 5 camadas de contas hidrofóbicas e de um único lipídeo. O último rendeu o coeficiente de difusão com o qual todos os coeficientes de difusão das proteínas foram comparados.

De forma semelhante ao caso de uma membrana que separa dois fluidos de viscosidades diferentes, antecipamos os PMPs, uma vez que o topo de uma proteína sente a água circundante enquanto seu fundo é enterrado no núcleo da bicamada. Portanto, esperava-se que variasse com a profundidade de penetração da proteína. Consequentemente, foi usado como um parâmetro de ajuste aberto na Eq. (1). O segundo parâmetro de ajuste foi.

Como resultado, descobrimos que a Eq. (1) fornece um excelente ajuste para os coeficientes de difusão dependentes do tamanho de todas as proteínas simuladas (Figura 4 a). Em contraste com a nossa expectativa, não mostrou uma variação significativa quando a profundidade de penetração da proteína foi aumentada, estendendo o comprimento da porção hidrofóbica (Figura 4b). No entanto, a alteração de foi proporcional ao comprimento da porção hidrofóbica da proteína (Figura 4b). Este resultado reflete que a proteína não experimenta o arrasto viscoso total () de uma proteína transmembrana, mas apenas uma porção menor devido à menor profundidade de penetração. Notavelmente, o coeficiente de difusão para quase coincidiu com o de uma proteína transmembrana. Em nossas simulações, não observamos um anel significativo de lipídios viajando com a proteína. Mais provavelmente, a granulação grossa e o uso de potenciais suaves (ou seja, uma baixa razão de impulso para propagação de massa inerente ao DPD) suaviza o surgimento desses conjuntos de dinâmica de curto alcance antecipados.

(a) A dependência do coeficiente de difusão de uma proteína de membrana periférica em seu raio é bem descrita pela Eq. (1) denota o coeficiente de difusão de um lipídio, é o tamanho de uma esfera de simulação. As proteínas com são denotadas por círculos preenchidos, losangos, quadrados e círculos abertos, quadrados, respectivamente. As barras de erro são menores que o tamanho do símbolo. Observação: para melhor visibilidade, as curvas correspondentes a terem sido deslocadas por um fator, as curvas não deslocadas coincidem aproximadamente com a curva superior. (b) A viscosidade na Eq. (1) (mostrado aqui como quantidade adimensional) não varia sistematicamente ao aumentar a profundidade de penetração de uma proteína. Em contraste, a viscosidade da superfície (mostrada como quantidade adimensional) mostra um aumento linear com a profundidade de penetração.

Ao dissecar, ou seja, extrair a contribuição da membrana, é notável que, embora ambos surjam do atrito com os lipídios. Atribuímos essa diferença aos diferentes contatos que um PMP faz com os lipídios: enquanto a parte inferior da proteína está principalmente em contato com os grânulos da cauda lipídica, a face lateral está imersa em cadeias lipídicas alongadas. Comparando os coeficientes de difusão de PMPs, descobrimos que eles variam no máximo entre a menor () e a maior profundidade de penetração (). Portanto, da mesma forma que as proteínas transmembrana com uma incompatibilidade hidrofóbica [38], [39] a variação da mobilidade difusiva é muito moderada.

Agrupamento de proteínas de membrana periférica dentro do mesmo folheto

Dado que as proteínas da membrana periférica perturbam a bicamada lipídica e reduzem os graus de liberdade dos lipídios, pode-se esperar um agrupamento dinâmico de proteínas impulsionado pela entropia em analogia às observações feitas para as proteínas transmembrana [10]. Portanto, estudamos como uma primeira etapa o comportamento de agrupamento de duas proteínas de membrana periférica que residem no mesmo folheto.

Para sondar e caracterizar as interações mediadas por membrana de proteínas de membrana periférica, determinamos a energia livre de associação entre dois PMPs. Para este fim, quantificamos o potencial de força média (PMF), por meio de uma amostragem guarda-chuva da distribuição de distância entre proteínas (ver [40], [41] para uma introdução detalhada). Aqui, restringimos nossa análise a pares de proteínas idênticas e variamos os raios das proteínas () e os comprimentos da porção hidrofóbica ().

Como resultado, descobrimos que o PMF para todos os pares de PMP dentro do mesmo folheto tinha um mínimo profundo em pequenas distâncias interproteínas (Figura 5a), isto é, quando as proteínas estão localizadas lado a lado. Esta característica indica um estado ligado, ou seja, a formação de um dímero (transitório). Além do mínimo no PMF, 2–3 mínimos do lado fraco emergiram que provavelmente refletem configurações metaestáveis ​​com 1–2 lipídios entre os PMPs. Para grandes distâncias entre proteínas, o PMF converge para uma constante, ou seja, os PMPs não interagem em distâncias maiores.

(a) Potenciais representativos de força média,, de dois PMPs () que residem no mesmo folheto. O mínimo de está localizado na distância prevista onde as proteínas se tocam (linha tracejada). A energia de ligação aumenta com o crescimento do comprimento hidrofóbico da proteína (mostrado em preto, vermelho e verde, respectivamente). Instantâneos representativos indicam a configuração da proteína no estado ligado e não ligado. Grupos hidrofílicos e hidrofóbicos são mostrados em vermelho / cinza e azul / amarelo, respectivamente. (b) A energia de ligação aumenta com o comprimento da porção hidrofóbica,. Enquanto se observa para raios pequenos () apenas um pequeno aumento na energia de dimerização, um forte aumento é visto para raios maiores ().

A profundidade do mínimo principal em comparação com o valor de PMF longe da proteína, isto é, reflete a força de ligação e, portanto, determina a estabilidade do dímero. Dependendo do comprimento da porção hidrofóbica e do raio da proteína, observamos valores na faixa (Figura 5b). Valores experimentais comparáveis ​​foram relatados para associação mediada por membrana de hélices transmembrana () [42]. Observamos a energia de ligação mais fraca para e a ligação mais forte para (Figura 5 b). Para um determinado comprimento da porção hidrofóbica, aumentou com os raios da proteína. Curiosamente, a largura do mínimo principal dificilmente mudou com o raio da proteína quando os PMPs eram bastante curtos (: largura). Para porções hidrofóbicas mais longas (), a largura aumentou gradualmente com o raio (até).

Para relacionar o PMF à estabilidade real dos dímeros, calculamos a seguir os tempos médios de primeira passagem do mínimo de energia para o estado não ligado. Resolvendo o problema de Kramers para um poço de potencial quadrado, a previsão é que depende quadraticamente da largura potencial e exponencialmente da profundidade potencial (). Portanto, a contribuição dominante para a estabilidade do dímero é. Como resultado da integração total, encontramos sms (cf. Tabelas S1, S2).Para comparação, também monitoramos o tempo de vida de dímeros pré-formados que podem se dissociar devido ao movimento difusivo. Os tempos de vida acessíveis desta abordagem concordam muito bem com os tempos médios de primeira passagem calculados acima.

Em resumo, encontramos uma atração mediada por membrana entre os PMPs no mesmo folheto, que é aprimorada para aumentar o comprimento e o raio da fração hidrofóbica. Em particular, observamos que as profundidades potenciais eram bastante pequenas () quando a âncora hidrofóbica das proteínas não penetrou no folheto oposto. Para proteínas com comprimentos e raios hidrofóbicos, encontramos valores maiores de que destacam uma tendência significativa para as proteínas dimerizar. É importante notar aqui que o agrupamento de PMPs dentro do mesmo folheto também foi investigado em um estudo de simulação relacionado [31], mas o PMF não foi determinado. Os autores observaram um aumento no tamanho dos clusters quando as proteínas penetraram também no folheto oposto, ao passo que quase nenhum agrupamento foi observado para proteínas restritas a um único folheto. Essas observações são consistentes com os valores de energia encontrados aqui.

Agrupamento de proteínas de membrana periférica em folhetos opostos

Para elucidar se as proteínas da membrana periférica também interagem e potencialmente dimerizam quando situadas em folhetos opostos de uma bicamada, inserimos uma única proteína em cada um dos dois folhetos (e) e determinamos novamente o potencial de força média (PMF). Como acima, variamos sistematicamente os raios da proteína () e o comprimento das porções hidrofóbicas ().

Semelhante aos nossos resultados acima, todos os PMFs mostraram um mínimo profundo a uma pequena distância interproteína que indicou um estado dimerizado metaestável (Figura 6a). Em contraste com os PMPs no mesmo folheto, o mínimo do PMF estava aqui tipicamente situado a uma distância muito pequena (), ou seja, os PMPs formaram dímeros de folheto cruzado em que as proteínas individuais assumiram uma configuração empilhada (cf. instantâneos na Figura 6 a) . O mínimo global foi algumas vezes seguido por uma pequena barreira repulsiva em distâncias intermediárias que deve ser superada para atingir o estado dimerizado. A energia de ligação,, depende do raio da proteína e da combinação de comprimentos hidrofóbicos, (Figura 6 b). A ligação mais forte foi encontrada para combinações de um PMP muito curto e um PMP longo (e). As combinações que envolveram um PMP que combinou melhor em uma única monocamada () mostraram valores médios de (com). A ligação mais fraca foi observada para, e combinações de e. Para aumentar os raios da proteína, a forma característica do PMF foi preservada, mas a profundidade do poço de potencial () aumentou, ou seja, os dímeros se tornaram mais estáveis. É importante notar aqui que uma ligação extraordinária forte, emergiu para o maior raio (ou seja, um diâmetro de proteína de 3-4 nm). Dada a simplicidade do nosso modelo e os efeitos de tamanho finito inevitáveis ​​que podem suprimir parte das ondulações relevantes e modos de bicamada peristáltica, este valor pode ser uma superestimação. Apesar de algumas correções numéricas que podem ser antecipadas para esses casos extremos, a tendência geral de estabilizar dímeros para raios crescentes é um resultado consistente de nossas simulações.

(a) Potenciais representativos de força média,, de dois PMPs () que residem em folhetos opostos. Para combinações de proteínas suficientemente curtas (, curva preta, curva vermelha), o mínimo de emerge em distâncias de fuga. Para um ligeiro aumento de é observado como resultado da construção dos PMPs por meio de grânulos finitos, ou seja, a configuração (i) é energeticamente menos favorável do que o arranjo (ii). Para proteínas mais longas (curva verde), um arranjo lado a lado de PMPs é observado, e o mínimo de, portanto, é deslocado para distâncias maiores. Instantâneos representativos indicam que os arranjos discutidos grupos hidrofílicos e hidrofóbicos são mostrados em vermelho / cinza e azul / amarelo, respectivamente. (b) Diagrama de fases para a capacidade de dimerização ao alterar os comprimentos de âncora de membrana e de um par de PMPs. Os valores codificados por cores de indicam a força de ligação. Observe que a escala logarítmica dos valores dos códigos de cores estão marcados em preto.

A forma do dímero dependia significativamente do comprimento das metades hidrofóbicas dos PMPs envolvidos (cf. instantâneos na Figura 6 a). Quando o comprimento hidrofóbico dos dois PMPs era pequeno o suficiente (ou), as proteínas formaram um dímero em forma de pilha (arranjo de fundo para fundo) e a largura do mínimo global no PMF era aproximadamente o diâmetro das proteínas. Conseqüentemente, as proteínas se atraíam enquanto se sobrepusessem. Para distâncias maiores, uma pequena parte repulsiva emergiu no PMF, refletindo o trabalho que deve ser feito para reorganizar os lipídios e as proteínas antes que o dímero possa se formar. A altura desta barreira repulsiva era maior quando ambas as proteínas eram muito curtas (,) ou, em menor grau, quando uma era muito longa (,). Em particular, a combinação de duas proteínas muito curtas () produziu uma barreira de energia de de modo que uma dimerização espontânea dessas proteínas é muito improvável. Quando as âncoras hidrofóbicas de ambas as proteínas penetraram no folheto oposto (e), os parceiros de dimerização foram localizados lado a lado (cf. instantâneo na Figura 6 a). A bacia atrativa do PMF, neste caso, foi muito semelhante aos resultados para os PMPs no mesmo folheto, ou seja, além de uma distância entre proteínas de praticamente nenhuma atração pôde ser observada.

Como antes, também calculamos os tempos médios de primeira passagem como uma medida para o tempo de vida do dímero (cf. Tabelas S3, S4). Em comparação com PMPs que residem no mesmo folheto, os dímeros de folheto cruzado eram geralmente mais estáveis ​​devido a mínimos mais profundos e mais largos no PMF. Os tempos de escape variaram de sa 100 ms e além, indicando que uma ampla gama de dímeros de folheto cruzado razoavelmente estáveis ​​podem se formar. Novamente, sondar a estabilidade de um dímero pré-formado monitorando a dissociação difusivamente conduzida das proteínas produziu tempos de vida semelhantes.

Resumindo nossos resultados, descobrimos que alterar o raio e / ou o comprimento hidrofóbico de um par de proteínas de membrana periférica fornece um meio para induzir o agrupamento de folheto cruzado de proteínas inicialmente independentes. Tal evento de dimerização pode ser considerado como a formação de uma proteína transmembranar eficaz e metaestável. Nossas observações sugerem ainda que a tendência de duas proteínas de formarem um dímero que atravessa a membrana depende de dois parâmetros: (a) na perturbação da membrana por cada proteína individual quando a proteína é mais longa ou mais curta do que a espessura do hospedeiro monocamada, e (b) na combinação hidrofóbica do domínio transmembranar eficaz do dímero de folheto cruzado. De acordo com essa afirmação, descobrimos que uma combinação de proteínas com apresentou forte dimerização já nos menores raios (). Embora o comprimento de cada uma dessas proteínas corresponda apenas mal à espessura da monocamada, o dímero resultante tem apenas uma incompatibilidade hidrofóbica muito pequena (e, respectivamente). Em contraste, as combinações de proteínas mostraram tempos de escape mais longos apenas para raios grandes (), uma vez que rende a melhor correspondência para a espessura da monocamada. No caso de uma incompatibilidade muito forte do dímero (), uma dimerização significativa com longos tempos de escape só é vista para raios muito grandes.

Estabelecendo conjuntos de proteínas maiores

Para examinar se um número maior de proteínas de membrana periférica em folhetos opostos pode mostrar oligomerização de ordem superior, inserimos 5 PMPs de raio em cada folheto em posições aleatórias. As proteínas estavam livres para se difundir e se agregar espontaneamente. Para raios maiores (), incorporamos apenas 3 proteínas em cada folheto para evitar efeitos de tamanho finito. Novamente, os comprimentos das porções hidrofóbicas dos PMPs foram variados sistematicamente.

Como resultado, encontramos na primeira instância novamente a formação espontânea de dímeros de folheto cruzado de PMPs que já havíamos observado antes (cf. Figura 6). Posteriormente, no entanto, esses dímeros mostraram a capacidade de formar conjuntos ainda maiores quando os dímeros tinham vida longa o suficiente para se encontrarem por meio de difusão (Figura 7 a). Em particular, observamos a formação de trímeros de dímeros pré-montados para uma combinação de e. A partir do curso do tempo de simulação, determinamos a vida útil desses trímeros. Eles aumentaram com o aumento dos raios de (), para () e ().

Dímeros de folha cruzada (cf. Figura 6) mostraram a capacidade de formar oligômeros maiores, e. trímeros de dímeros para (esquerda) ou grandes aglomerados lado a lado para (direita).

Para uma combinação de e observamos a formação de dímeros de folheto cruzado para o menor raio (), sem qualquer agrupamento subsequente. Para raios maiores (), no entanto, emergiram novamente trímeros de dímeros de folhetos cruzados com estabilidade crescente. Nos casos descritos, os dímeros do folheto cruzado tinham um comprimento de (distância média dos grupos de cabeça na proteína superior e inferior). A parte transmembrana eficaz de um dímero de folheto cruzado, portanto, induz uma pequena incompatibilidade hidrofóbica de controle de montagem () com a bicamada não perturbada.

Também observamos uma dimerização / trimerização de dímeros para raios grandes () quando dímeros pré-formados tinham uma incompatibilidade hidrofóbica negativa, ou seja, para e (), para e (), e para e (). Nenhuma maior oligomerização de dímeros foi observada para e, onde os dímeros pré-formados tinham uma incompatibilidade de desaparecimento (). Deduzimos a partir dessas descobertas que uma incompatibilidade hidrofóbica absoluta de um (meta) dímero estável de dois PMPs produz uma atração mediada por membrana que pode causar maior oligomerização de dímeros. Este resultado está de acordo com a noção de que mesmo uma pequena incompatibilidade hidrofóbica de uma proteína transmembrana produz uma interação atraente mediada por membrana que pode conduzir o agrupamento transiente [10], [14]. Dímeros de folheto cruzado, portanto, agem a este respeito de forma semelhante às proteínas transmembrana.

A formação de um tipo variante de grandes aglomerados foi observada quando os PMPs em diferentes folhetos estavam penetrando no folheto oposto (,) (Figura 7 b). Esses agrupamentos não consistiam em entidades transmembranares eficazes como antes, mas sim em uma montagem lado a lado de proteínas. O número médio de proteínas nos clusters foi 3-6 e os tempos de vida dos clusters foram (conforme determinado a partir do curso de tempo de simulação). Ambos, o tamanho do cluster e a estabilidade aumentaram novamente com um aumento do comprimento hidrofóbico e do raio dos PMPs envolvidos. O agrupamento mais forte foi observado para o maior raio (). Aqui, todas as proteínas na membrana montadas em apenas um grande cluster que foi estável durante toda a simulação ().

Para complementar nossos resultados, também realizamos simulações em que uma única proteína com um raio grande () foi incorporada no folheto da membrana inferior, enquanto 5 proteínas com um raio pequeno () foram situadas no folheto superior. Como resultado, observamos que as proteínas pequenas mostraram uma tendência a se agrupar acima da proteína grande situada no folheto oposto (Figura 8 a). O grau de montagem, isto é, o número de proteínas pequenas que oligomerizam de forma estável com a proteína grande, depende da combinação de comprimentos das porções hidrofóbicas das proteínas. Uma forte oligomerização com tempos de vida foi observada, por exemplo, para (proteínas grandes) e (proteínas pequenas). Para esses casos, normalmente duas pequenas proteínas montadas acima de uma grande proteína. O efeito mais forte foi visto para e: Quatro pequenas proteínas montadas acima da proteína grande e permaneceram lá durante todo o tempo de simulação (). De fato, por razões estéricas, no máximo quatro pequenas proteínas () podem ser colocadas sob uma grande proteína (). Quando as proteínas pequenas e grandes eram ambas longas o suficiente para alcançar o folheto oposto, isto é, e, descobrimos que as proteínas pequenas não se localizavam acima, mas sim na borda da proteína grande (cf. Figura 8 a). Encontramos um agrupamento notavelmente grande com,, onde até quatro pequenas proteínas cercaram a grande proteína, estabelecendo assim um pentâmero (tempo de vida) oligômeros menores com a mesma configuração de comprimento de proteína foram estáveis ​​ao longo de toda a simulação ().

(a) Usando proteínas com raios diferentes, frequentemente se observa um agrupamento de pequenos PMPs sob uma grande proteína no folheto oposto. No folheto inferior, um único PMP com raio e comprimento da fração hidrofóbica foi incorporado, enquanto o folheto oposto hospedou quatro PMPs com raio e comprimento da fração hidrofóbica. Dependendo do comprimento das porções hidrofóbicas, até quatro pequenos PMPs montados de forma estável acima de um único PMP maior no folheto oposto (grau de preenchimento dos círculos que codificam o número de pequenos PMPs). Dois instantâneos representativos ilustram fenótipos representativos. (b) Em membranas não homogêneas, os PMPs também freqüentemente se agrupam abaixo ou próximo a um microdomínio de lipídeo (espesso) no folheto oposto.

Finalmente, investigamos se a montagem acima descrita de proteínas em folhetos opostos também ocorreu quando uma das proteínas foi substituída por um microdomínio lipídico. Para tanto, criamos uma bicamada assimétrica composta por dois tipos de lipídios, e, onde 10% dos lipídios do folheto superior eram longos,. Devido aos parâmetros impostos (cf. Métodos), os lípidos longos formaram um microdomínio espesso (, distância média da cabeça do lípido à cauda do lípido) no folheto superior. Um único PMP foi então inserido no folheto homogêneo oposto. Novamente, variamos sistematicamente o raio da proteína () e o comprimento hidrofóbico (). Como resultado, observamos uma co-localização dos lipídios e do PMP com a conformação precisa dependendo dos parâmetros da proteína. Em geral, proteínas de comprimento curto e médio () montadas acima do microdomínio lipídico (Figura 8 b). Em contraste, por e observamos que os lipídios longos preferencialmente localizados na borda da proteína, às vezes até circundando-a. Assim, também o agrupamento de PMPs e microdomínios (espessos) de lipídios no folheto oposto é um meio de formação de estrutura nas membranas.


Discussão

A formação de nanoclusters K-Ras, que funcionam como interruptores digitais transitórios em nanoescala na ativação de MAPK, é essencial para a transdução do sinal Ras (5). Como os nanoaglomerados de K-Ras.GTP se formam e que mecanismo opera para manter a fração agrupada de K-Ras em um nível constante em uma ampla faixa de concentrações de K-Ras.GTP não foi resolvido. Lidamos com esse problema aqui usando modelagem & # x000a0silico para mostrar que as interações entre K-Ras e um pool citosólico de Gal3 desempenham um papel central na condução de nanoclustering K-Ras na membrana plasmática. Desenvolvemos um modelo matemático para simular a dinâmica da nanoclustering K-Ras na membrana plasmática. Aplicamos um algoritmo genético para buscar os possíveis parâmetros do modelo capazes de realizar as observações experimentais e validar os parâmetros ótimos estimados representando os mecanismos de colisão. Além disso, um método computacional foi desenvolvido para calcular as taxas de colisão de proteínas com base em taxas de difusão de proteínas determinadas experimentalmente e mecanismos de difusão. As taxas de colisão calculadas foram constantes em uma ampla gama de números de proteínas, apoiando nosso uso de um sistema de reação homogêneo para descrever a difusão bidimensional da proteína Ras na membrana plasmática. O modelo realiza com sucesso a fração constante de Ras agrupados com base na bioquímica conhecida de Gal3 e, é importante notar, prevê que um mecanismo chave para essa fração constante é a disponibilidade da proteína Gal3 no citosol para recrutamento para a membrana plasmática. Além disso, nossas simulações demonstram que a probabilidade de formação de complexo de proteína é um parâmetro útil para usar em combinação com taxas de colisão constantes para definir taxas de ligação que realizam dados experimentais.

Com base em nossos resultados publicados de imagens quantitativas EM e FLIM-FRET (13), o modelo in & # x000a0silico propõe que as proteínas & # x000a0Gal3 são recrutadas para a membrana plasmática como & # x000a0a resultado de colisões moleculares com monômeros K-Ras.GTP de difusão livre. Os complexos K-Ras.GTP-Gal3 resultantes se montam rapidamente em complexos pentaméricos impulsionados por interações moleculares entre as proteínas Gal3 constituintes. Os nanoclusters pentaméricos podem acumular complexos K-Ras.GTP ou K-Ras.GTP-Gal3 adicionais. No entanto, nossas simulações mostram que a probabilidade de incorporação bem-sucedida de proteínas K-Ras adicionais após a colisão com um pentâmero K-Ras.Gal3 deve ser muito menor do que durante a montagem do pentâmero, talvez refletindo um mecanismo de retenção biofísica diferente. Uma possibilidade é que o complexo relativamente estável de cinco proteínas K-Ras ancoradas à membrana por domínios polibásicos e um pentâmero Gal3 remodela o ambiente lipídico em nanoescala do cluster. Por & # x000a0analogia com substrato de quinase C rico em alanina miristoilada ligando-se à membrana plasmática (36), a remodelação envolveria um aumento na concentração local de fosfolipídios ácidos, incluindo PS e PIP2, permitindo o recrutamento adicional de proteínas K-Ras carregadas positivamente, mas com uma afinidade mais baixa do que a realizada pela interação direta proteína-proteína Gal3.

Qualquer que seja o mecanismo preciso, o modelo que formulamos fornece fielmente o resultado importante da formação de nanoaglomerado K-Ras.GTP independente da concentração com a estequiometria K-Ras previamente observada e a vida útil do nanoaglomerado (8 & # x0201310). O modelo também recapitula nossos resultados experimentais publicados recentemente, mostrando que a disponibilidade de Gal3 no citosol é o determinante crítico da fração agrupada K-Ras.GTP (13). Assim, alterar a expressão de Gal3 modula diretamente a transmissão do sinal via K-Ras (14,37). Esses achados são significativos porque a expressão de Gal3 e sua localização subcelular são alteradas em vários tipos de tumor (38). Dado que a fração agrupada é um determinante crítico da sensibilidade de uma célula à ativação dependente de EGF da cascata de MAPK (5), os novos dados implicam o pool citosólico de Gal3 como um modulador da ativação de MAPK por EGF, bem como de saída de sinal de & # x000a0 mutante oncogênico K-RasG12V. Tomados em conjunto, estes dados implicam expressão alterada de Gal3 na tumorigênese mediada por K-Ras.

Para um sistema de equações diferenciais ordinárias com soluções em estado estacionário, as taxas cinéticas no modelo devem ser restringidas pelas condições de equilíbrio do sistema. No entanto, nossas simulações sugerem que este sistema pode não estar totalmente balanceado, por exemplo, quando alteramos os valores dos pares de parâmetros, como uma1 e d1, simultaneamente e proporcionalmente, as propriedades de equilíbrio do sistema foram alteradas. Além disso, as distribuições simuladas do tamanho do nanoaglomerado não se tornaram exponenciais nem tinham um grande agregado cujo tamanho correspondia ao número total de moléculas.Essas observações sugerem que a formação de nanoaglomerados é regulada por certos processos-chave de não-equilíbrio. Na verdade, o sistema inclui uma série de reações unidirecionais, como a desmontagem de nanoclusters e a separação de complexos Ras-Gal3 dentro de nanoclusters. Além disso, a formação rápida de pentâmeros Gal3 resulta em taxas de ligação muito diferentes & # x000a0 para montagem de pentâmero Ras-Gal3 versus crescimento de nanocluster como resultado de colisões Ras e Ras-Gal3 adicionais. Uma análise mais detalhada da interação entre as reações equilibradas e desequilibradas por meio das soluções de estado estacionário seria interessante de prosseguir. No entanto, este não é um exercício trivial, porque nosso sistema modelado inclui 27 equações e as equações envolvendo K-Ras.GTP, Gal3 e Ras-Gal3 & # x000a0espécies são complexas. No futuro, outras abordagens teóricas, como o método da equação mestre, podem ser usadas para analisar a cinética dos nanoaglomerados e fornecer insights mais profundos sobre a física subjacente à formação dos nanoaglomerados.

Foi demonstrado que uma série de proteínas ancoradas em lipídios operam em nanoaglomerados distintos nos folhetos internos e externos da membrana plasmática, incluindo outras isoformas de Ras e proteínas ancoradas em GPI (7 & # x020139,39,40). Todas essas proteínas mostram uma fração agrupada independente da concentração e um excesso de monômero sobre a proteína agrupada, embora com diferentes números de proteínas em cada nano agrupamento. Embora o modelo que desenvolvemos seja específico para nanoclustering K-Ras, no centro do modelo está um mecanismo que promove rapidamente a interação cooperativa entre monômeros e dímeros. Para K-Ras, essa cooperatividade é fornecida pela ligação proteína-proteína. Na tentativa de generalizar o modelo, especulamos que um mecanismo de núcleo semelhante pode operar para outras proteínas nanoclustered, talvez impulsionado por interações proteína-proteína ou proteína-lipídio. Tal hipótese é facilmente tratável por simulação e experimento e pode permitir a definição de um princípio biofísico comum para a organização não aleatória de proteínas ancoradas em lipídios na membrana plasmática.


Avaliação da correlação das proteínas do ciclo celular e a interação do Ki-67 no prognóstico do papiloma invertido do seio paranasal e na transformação do carcinoma de células escamosas

O papiloma invertido (PI) nasossinusal recorrente pode ser transformado em carcinoma espinocelular nasossinusal. Usamos os padrões de expressão de proteínas por método imunohistoquímico para ver se a expressão de p53, p16, p21 e p27 pertence aos reguladores do ciclo celular e PCNA (antígeno nuclear de proliferação celular) e Ki-67 os marcadores de proliferação em sessenta pacientes com inversão nasossinusal papiloma e 10 deles com transformação de carcinoma espinocelular. Níveis significativamente elevados de Ki-67, p27 e PCNA em IP com transformação de carcinoma de células escamosas do trato nasossinusal em comparação com papiloma invertido foram revelados. Nenhuma variação de p16, p21, PLUNC (palato, pulmão e proteína do clone do epitélio nasal) e expressão de p53 foi correlacionada com a transformação maligna de IP nasossinusal por pesquisa multivariada. No entanto, encontramos expressão elevada de PLUNC em IPs com múltiplas recorrências. Finalmente, descobrimos que o PCNA, p27 pode interagir com CDK1, que promove a proliferação de células IP e se correlaciona com o carcinoma de células escamosas nasossinusais. O Ki-67 pode atuar ao longo dos ciclos celulares para causar a transformação maligna. Em conclusão, este é o primeiro estudo mostrando a correlação do Ki-67, o PCNA interagindo com o CDK1 pode levar à transformação maligna. A expressão elevada de PLUNC nos IPs nasossinusais foi relacionada a múltiplas recorrências em humanos.

1. Introdução

O papiloma invertido (IP) é um tipo de tumor em que as células epiteliais da superfície crescem para baixo no tecido de suporte subjacente. A bexiga, a pelve renal, o ureter, a uretra, o nariz e os seios paranasais são áreas possíveis para a ocorrência de IP [1]. Epistaxe e obstrução nasal com dor facial ou cefaleia atacadas quando o nariz ou a mucosa dos seios da face apresentam o IP [2]. Embora o IP originado da membrana respiratória de contorno pertença a uma neoplasia epitelial benigna, a invasividade local, maior taxa de recorrência e transformação maligna tornam seu tratamento difícil [3]. A taxa de transformação maligna é de 5–10% e muitos deles são sincrônicos apresentando-se com carcinoma de células escamosas [4]. O PCNA (antígeno nuclear de proliferação celular) atua como expressão do antígeno no núcleo da célula na fase de síntese do DNA durante o ciclo celular e considera o prognóstico do câncer, mas a relação com o IP ainda é controversa [5].

A ciclina e a quinase dependente de ciclina (CDK) desempenham papéis importantes no ciclo celular durante a proliferação e afetam diferentes fases do ciclo celular [6–9]. O CDK1 é um iniciador crucial para a proliferação celular e fator de transformação maligna [10]. Ao contrário, os inibidores de p21, P27 e CDK, limitam os CDKs e interrompem o ciclo celular [8]. O p21 é um inibidor dos CDKs da fase da célula G1 que restringem a entrada das células na fase S. O p27 também pode se ligar a CDKs e atuar como CDKI como p21. O p27 interage com os complexos ciclina E-CDK2, ciclina A-CDK2 e ciclina D1-CDK4, afetando a proliferação celular e a apoptose [6, 7].

O antígeno marcador de proliferação Ki-67, detectado com o anticorpo monoclonal MIB-1, é expresso em todas as fases das células G1, S, G2 e M, exceto G0 [8]. A expressão de Ki-67 também se correlacionou com o comportamento do tumor, o grau patológico do tumor e a recorrência precoce em vários carcinomas [11-15].

Com relação aos IPs transformados ou sincronizados com cânceres, também fazemos o estudo IHC de p16, p53, Ki-67 e PLUNC (palato, pulmão e proteína do clone do epitélio nasal). A p16 é uma proteína supressora de tumor que desacelera a fase G1 para a célula S e previne a transformação maligna [8]. PLUNC é um material imune inato que tem um efeito anticâncer para o câncer de nasofaringe, mas nenhum estudo revelou sua relevância para IPs nasossinusais [16].

Levantamentos de PCNA, p53, p21, p27 e Ki-67 foram feitos para ver se eles estavam correlacionados com as extensões do tumor e o resultado do tratamento de IPs nasossinusais [8].

O objetivo deste estudo é investigar os papéis dos reguladores do ciclo celular p53, p21, p27, marcador de proliferação Ki-67, p16, PCNA e material imune inato PLUNC na recorrência e transformação maligna para IPs nasossinusais. Também pesquisamos se os possíveis fatores previstos de Ki-67, PCNA e p27 se correlacionam com CDKs por simulação computacional, finalmente para dar uma possível explicação para o mecanismo de Ki-67, PCNA e p27 para os CDKs no prognóstico de IPs.

2. Materiais e métodos

Do Hospital da Universidade de Medicina do Departamento da China de janeiro de 2000 a junho de 2010, 60 casos de IPs nasossinusais e 10 casos de IPs com transformação de carcinoma de células escamosas foram coletados e revisados ​​dos prontuários médicos de maneira retrospectiva. Todos os tecidos fixados em formalina a 10% e preparados em parafina foram utilizados para estudos de IHQ pelo método do complexo avidina-biotina-peroxidase. Anticorpos monoclonais de camundongo (mAb), anti-p16 (Neomarcadores, DCS-50, 200 mg / L), anti-p21 (Neomarcadores, MS 387-P, 200 mg / L), anti-p27 (Neomarcadores, MS 256-P , 200 mg / L), anti-p53 (Neomarcadores, RM 9105-S), Ki-67 (Neomarcadores RM 9106-S) PCNA e PLUNC (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA) foram usados ​​para imuno-histoquímica através o método da estreptavidina-biotina peroxidase [11]. O xileno foi usado para desparafinar todas as secções de tecido e depois reidratado por séries de álcool e finalmente saturado em água destilada. Em seguida, o tecido foi deslocado para solução salina tamponada com fosfato com adição de solução de peroxidase de hidrogênio a 0,3% para bloquear a atividade da peroxidase endógena em temperatura ambiente por 10 min, e então o tampão Tris foi enxaguado. As seções foram então fervidas em um forno de micro-ondas por 15 min em solução tampão de citrato (10 mmol / L pH, 6,0). Os anticorpos primários p53, p21, p27, p16, PCNA, Ki-67 e PLUNC foram aplicados um a um durante 60 min à temperatura ambiente [11].

Em seguida, adicionamos o anticorpo de ligação e o complexo de estreptavidina peroxidase (DAKO LSAB Kit, K-0675 Carpinteria, CA) por 15 min em temperatura ambiente. O 0,05% de tetrahidrocloreto de diaminobenzidina (DAB) foi usado por 15 min para a coloração do tecido e finalmente lavado duas vezes pelo tampão Tris [8, 11].

As seções foram contrastadas com hematoxilina de Mayer após a lavagem com água desionizada. Os núcleos imunocorados foram quantificados em cada caso. Todas as contagens foram realizadas em um microscópio de luz padrão em campo 1000x para avaliar núcleos positivos / número total de células. Dez campos ou pelo menos 500 células foram contados em cada seção. As seções do tumor foram consideradas negativas se a coloração estava ausente ou presente em & lt10% das células tumorais. Uma pontuação de 1+ foi dada quando 10-30% das células foram positivas para a reação. Uma pontuação de 2+ foi dada quando 30–50% das células foram positivas para a reação. Uma pontuação de 3+ foi dada quando & gt50% das células foram positivas à reação, respectivamente (Tabelas 1 e 2) [17]. A significância estatística foi analisada por meio do teste qui-quadrado de Pearson ou teste exato de Fisher para análise univariada e o teste de regressão logística múltipla foi usado para análise multivariada. Os resultados foram considerados estatisticamente significativos quando o

O docking proteína-proteína foi realizado pelo programa ZDOCK [18] para analisar os três possíveis fatores prognósticos para transformação maligna ligada a CDK1. Para tornar o mecanismo possível para o que encontramos neste estudo, calculamos a interação do Ki-67, p27 e PCNA para CDK1 por biologia computacional. Além disso, utilizamos o programa GROMACS 4.5.5 [19] para observar a estabilidade dos complexos após as predicações de ligação ZDOCK. O ambiente do sistema MD foi ajustado na modelagem de água TIP3P com caixa d'água de 1,2 nm que continha íons Na e Cl na concentração de NaCl 0,145 M para neutralização do sistema. Primeiro, definimos etapas de 5.000 ciclos no algoritmo de descida mais íngreme para minimização de energia. Em segundo lugar, as condições de dinâmica de temperatura constante (tipo NVT) foram empregadas para fornecer simulação MD para equilíbrio e realizadas em um período de tempo de 1 ns. Na etapa final, a pressão constante e a dinâmica da temperatura (tipo NPT) foram definidas para a execução da produção no período de 5000 ps. A temperatura do sistema durante o processo de simulação foi fixada em 310 K. Para a análise da trajetória, empregamos o software GROMACS 4.5.5 para contar a raiz do desvio quadrático médio (RMSD) e o raio de giração (Rg), respectivamente. Uma série de dados de conformação MD foi pesquisada a cada 20 ps de todas as execuções de produção.

3. Resultados

Havia um total de 55 homens e 15 mulheres incluídos neste estudo. Sessenta deles são IPs e os outros 10 são IPs nasossinusais coletados com transformação maligna. A idade é

anos variando de 25 a 78 anos. As manchas revelaram níveis significativamente elevados de PLUNC, mas níveis diminuídos de Ki-67, p53, p21 e p27 em pacientes com recorrência múltipla de IPs (Tabela 1). Também encontramos PCNA, Ki-67 e p27 elevados nos IPs nasossinusais com transformação de carcinoma de células escamosas em comparação com os IPs nasossinusais isolados sem malignidade síncrona (Tabela 2). A expressão elevada de PLUNC está correlacionada à cirurgia de múltiplos seios nasais em pacientes com IPs nasossinusais. No entanto, o nível de expressão PLUNC não está correlacionado com a transformação maligna de IPs em SCC. Também mostramos a expressão de IHC de diferentes níveis para PCNA, Ki-67, p27 e PLUNC nas Figuras 1, 2, 3 e 4. A ressonância magnética ou tomografia computadorizada pré-operatória foram realizadas para todos os pacientes como nas Figuras 5 e 6 .


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(b) RM de seios paranasais (visão coronária) e tomografia computadorizada de seios paranasais (visão axial) de papiloma nasossinusal invertido com transformação maligna.

A coloração imunohistoquímica Ki-67 elevada é encontrada em ambos os IPs nasossinusais com múltiplas recorrências e transformação maligna em nossa análise univariante e multivariante pelo teste qui-quadrado de Pearson e teste de regressão logística múltipla, conforme mostrado nas Tabelas 1 e 2 e Figura 2 (a). Portanto, o alto índice Ki-67 pode ser considerado um fator importante para o prognóstico e marcadores preditos de malignidade. Poderíamos até mesmo combinar a pesquisa do nível de expressão de Ki-67 e PCNA IHC significativamente aumentado e o nível de p27 mais baixo para prever a tendência de transformação maligna mais alta em pacientes com IPs nasossinusais em nossa pesquisa.

Consequentemente, fizemos algumas análises de docking com estudos de dinâmica molecular final entre o que encontramos os fatores de prognóstico de PCNA e CDK1, Ki-67 e CDK1, e p27 e CDK1, que todos mostraram docking estável na Figura 7 e sua pontuação de docking também é mostrada por Programa ZDOCK. O ZDOCK gerou as 10 primeiras poses de encaixe de CDK1 e Ki-67, CDK1-p27 e CDK1-PCNA. Escolhemos a melhor pontuação de docking para analisar a estabilidade da interação proteína-proteína. O Ki-67, p27 e PCNA para a pontuação de ligação de CDK1 são 20,92, 21,72 e 24,32, respectivamente pelo programa ZDOCK. Os resíduos-chave são Gly9, Ser10, Ile11, Leu12, Lys13, Lys14 e Val15 que foram os principais domínios de ligação para Ki-67 e p27 ao CDK1 mostrado em fita vermelha (Figura 7). Além disso, fizemos análises de MD para esses resíduos-chave para ver a interação dessas três proteínas com o CDK1. Após a simulação MD do complexo CDK1 com Ki-67, p27 e PCNA, realizamos a análise RMSD para tempos de simulação de 5000 ps. Todas as três proteínas (Ki-67, p27 e PCNA) revelaram ter flutuação estável após o tempo de simulação de 1000 ps (Figura 8).


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(c) As melhores poses de encaixe de CDK1 (verde) com a proteína alvo (azul): (a) Ki-67, (b) p27 e (c) PCNA. Os dez principais complexos de proteína-proteína com pontuações ZDOCK foram gerados pelo programa ZDOCK. A pontuação ZDOCK mais alta de Ki-67, p27 e PCNA são 20,92, 21,72 e 24,32, respectivamente. Os resíduos de ligação de chave de Ki-67 e p27 são coloridos em vermelho e os resíduos de chave incluem Gly9, Ser10, Ile11, Leu12, Lys13, Lys14 e Val15.

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(c) A análise RMSD de todos os átomos de complexos de CDK1 com (a) Ki-67, (b) p27 e (c) PCNA durante tempos de simulação de 5000 ps. Todos os complexos tendem a uma flutuação estável após o tempo de simulação de 1000 ps.

Na Figura 9, calculamos a giração do raio das proteínas para o período de simulação de 5000 ps. Os três complexos tendem a valores baixos de raio de giração e flutuação estável ao longo de toda simulação MD, o que indica os complexos compactados entre cada estrutura da proteína. O método SASA (área de solvente) foi utilizado para a natureza hidrofóbica dos três complexos, estes três tornaram-se flutuações estáveis ​​e também apresentaram alteração hidrofóbica estável entre cada interação proteína-proteína (Figura 10). Além do cálculo da energia total dos sistemas MD para cada um dos três complexos durante os tempos de simulação de 5000 ps, ​​todos eles tiveram variação de energia estável na faixa de −9,27 × 10 5, −9,30 × 10 5 e −1,66 × 10 6, respectivamente (Figura 11). O resultado da análise de energia revela que todos os sistemas de simulação são estáveis ​​durante 5000 ps. Na análise de flutuação de resíduos, medimos o valor RMSF de todos os resíduos para os três complexos (Figura 12). Na validação RMSF do complexo CDK1-Ki67, existem flutuações significativas observadas nos resíduos de 38 a 43 de CDK1, que apresenta grande alteração durante a simulação MD (Figura 12 (a)). Também houve variação significativa observada nos resíduos de 25 a 40 na estrutura da proteína p27 durante a simulação MD, o que denota as grandes mudanças nesta região. Pelo contrário, há menos variação de RMSF nos resíduos de 100 a 200 na estrutura da proteína PCNA durante a simulação MD. Portanto, houve menos alteração de RMSF durante a simulação de MD em PCNA do que Ki-67 e p27.


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(c) O raio de giração dos complexos de CDK1 com (a) Ki-67, (b) p27 e (c) PCNA durante tempos de simulação de 5000 ps. Os baixos valores do raio de giração indicam os complexos compactados entre duas estruturas de proteínas.


A análise SASA (área de solvente) de todas as conformações de complexos para definição hidrofóbica durante 5000 ps a flutuação estável não indicou nenhuma mudança distinta entre as interações proteína-proteína.

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(c) Cálculo da energia total dos sistemas MD de (a) Ki-67, (b) p27 e (c) PCNA durante os tempos de simulação de 5000 ps, ​​cada uma das flutuações médias são −9,27 × 10 5, −9,30 × 10 5 e −1,66 × 10 5, respectivamente.

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(c) Análise de RMSF de resíduos de proteína em (a) CDK1 e Ki-67, (b) CDK1 e p27, e (c) CDK1 e PCNA durante o tempo de simulação de 5000 ps. O alto valor da flutuação de RMSF denota uma forte variação da estrutura da proteína em todas as simulações de MD.

No entanto, a análise de migração revelou que o PCNA tinha uma grande distância entre o CDK1 em comparação com o Ki-67 e o p27 durante a pesquisa de simulação de MD de 5000 ps. Embora tenhamos encontrado a maior distância entre o PCNA e o CDK1 (Figura 13 (a)), sua ligação estável foi mostrada na Figura 12 por análise de RMSF. Além disso, o deslocamento quadrático médio (MSD) do PCNA tem menor migração (Figura 13 (b)). Analisamos ainda os resíduos-chave de CDK1 para ligação de Ki-67 e p27. O resíduo de ligação chave inclui Gly9, Ser10, Ile11, Leu12, Lys13, Lys14 e Val15 no ângulo dos diédricos da estrutura da proteína Ki67-CDK1 durante o tempo de simulação de 5000 ps. Todos os resíduos de ligação são estáveis ​​durante toda a simulação MD. No entanto, havia apenas ângulos diédricos estáveis ​​em Gly9, Ser10, Leu12 e Val15 em complexos de proteína p27-CDK1 ao longo de todo o tempo de simulação MD. Finalmente, descobrimos que todos os resíduos de ligação chave, incluindo Gly9, Ser10, Ile11, Leu12, Lys13, Lys14 e Val15 na estrutura da proteína PCNA-CDK1 tinham ângulo de diedro de ligação estável durante toda a simulação de MD, nenhuma mudança maior foi encontrada durante o processo de Ligação de PCNA a CDK1 (Figura 14). As análises de cluster foram usadas para selecionar a estrutura representativa entre todos os quadros MD. Para o ensaio de comparação instantâneo, a estrutura representada selecionada a partir dos últimos grupos de agrupamento para todos os quadros MD de complexos CDK1 de Ki67, P27 e PCNA deslocados em 4860 ps, ​​2740 ps e 3880 ps, ​​respectivamente, durante o tempo de simulação de 5000 ps (Figura 15). O estudo de comparação instantâneo para CDK1 e proteínas alvo para Ki-67, p27 e PCNA são mostrados na Figura 16.Descobrimos que os resíduos de CDK1 de 38 a 43 em CDK1 estão se aproximando de Ki-67 de 0 ps a 4860 ps (Figura 16 (a)). O resultado é correlacionado à análise de RMSF devido às altas flutuações nos resíduos de 38 a 43 de ligações de CDK1 para Ki-67. Para a análise de instantâneo CDK1-p27, o p27 está se aproximando do CDK1 de 0 ps a 2740 ps. As descobertas também estão correlacionadas com a análise de RMSF por causa das grandes variações nos resíduos de 25 a 40 de ligação de p27 para CDK1 (Figura 16 (b)). Nós só pudemos encontrar a pequena mudança de um loop de PCNA (azul) se afastando de CDK1 (verde) em 3880 ps nos resíduos de 100 a 200 na interação de PCNA e CDK1 (Figura 16 (c)). Este resultado também está correlacionado com a análise de RMSF para pequenas flutuações nos resíduos de 100 a 200 de ligações de PCNA para CDK1.


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(b) A análise de migração de complexos durante o tempo de simulação de 5000 ps: (a) a distância entre CDK1 e as proteínas acopladas ao longo de todo o tempo de MD e (b) a análise de deslocamento quadrático médio (MSD) para todos os complexos de CDK1, o alto valor de MSD denota o grande distância da migração da proteína da posição inicial.


O ângulo diedro dos resíduos de ligação da chave: (a) Gly9, (b) Ser10, (c) Ile11, (d) Leu12, (e) Lys13, (f) Lys14 e (g) Val15 na estrutura da proteína CDK1 durante o tempo de simulação de 5000 ps. Os ângulos diédricos foram calculados para complexos de CDK1 com proteínas de ligação alvo: Ki-67, p27 e PCNA ao longo de todo o tempo de simulação MD.

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(c) Análises de cluster de todas as CDK1 e as proteínas de ligação: (a) Ki-67, (b) p27, e (c) PCNA durante o tempo de simulação de 5000 ps, ​​as estruturas representadas foram selecionadas a partir dos últimos grupos de agrupamento para todos os quadros MD de complexos de CDK1 . A estrutura representada do complexo Ki-67, p27 e PCNA deslocada em 4860 ps, ​​2740 ps e 3880 ps, ​​respectivamente.

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(c) Comparação entre o instantâneo inicial (0 ps) e a conformação representada para todos os complexos CDK1. (a) Um dos loops CDK1 (verde) moveu a abordagem para Ki-67 (azul) a 4860 ps. (b) A estrutura da proteína de p27 (azul) se ligou a CDK1 (verde) mais fortemente a 2740 ps. (c) Um dos laços PCNA (azul) se afastou de CDK1 (verde) a 3880 ps.

Para resumir os resultados em nosso estudo e revisões de literatura, o mecanismo molecular de Ki-67, p27 e PCNA interagindo com CDK1 para proliferação de células e transformação maligna em pacientes com IP nasossinusal é mostrado na Figura 17.


4. Discussão

Embora os papilomas invertidos raramente ocorram no trato nasossinusal, a natureza recorrente fácil e a transformação maligna freqüentemente incomodam pacientes e médicos. O acompanhamento regular ao longo da vida é necessário para a detecção precoce de recorrência ou alteração maligna e pode levar a um melhor controle da doença para pacientes com IPs [9, 20].

O Ki-67 promoveu o início da fase G1 a partir do G0 em células IPs, e persistiu a expressão para o ciclo celular em fase de proliferação. Ki-67 é uma proteína que afeta o ciclo celular na fase de proliferação de G1-S-G2-M exceto a fase G0 [8, 11, 14]. Na literatura relatando que as mutações p53, p63, p21 e p27 induziram IP nasossinusal com transformação de SCC, ainda havia debates [6, 11, 14]. Ki-67 foi recentemente relatado para a ocorrência de neoplasia nasossinusal [21], o comportamento agressivo do tumor correlacionou-se com o índice Ki-67 mais alto e causou o epitélio nasal a displasia grave e até carcinoma de células escamosas [22]. O Ki-67 elevado pode até ser encontrado nos carcinomas de células escamosas contidos em IPs sincronicamente. Ki-67 também afetará p21, p27 e CDKs [8, 11, 12, 14]. No entanto, não podemos concluir se a diminuição do p27 é causada pela expressão elevada de Ki-67 em tecidos nasossinusais IPs. Mais estudos são necessários para elucidar a relação entre Ki-67 e P27.

A função de supressão tumoral do p53 está relacionada a muitos cânceres relatados por Katori et al. e Gujrathi et al. [22, 23]. Eles sugeriram que o teste de p53 pode ajudar a rastrear lesões de papiloma com potencial para displasia ou carcinoma; no entanto, não encontramos significância na análise multivariada. Isso se deve ao número limitado de pacientes em nosso estudo. No entanto, não apenas o p53, mas também o p63 é elevado expresso em IPs com transformação maligna [11].

A atividade proliferativa aumentada com expressão elevada de Ki-67 de células tumorais foi relatada como um importante marcador de prognóstico em muitos tumores humanos, também é importante na recorrência de IPs e cancerização. Especialmente, o suspeito de Ki-67 afeta diretamente o ciclo celular durante a fase de proliferação e poderia interagir com os genes supressores de tumor p53, p21 e p27 e modula o ciclo celular afetando o ponto de verificação da fase G1 [8, 24, 25]. O Ki-67 recentemente descobriu ter interação entre CDK1 na estrutura da natureza e biologia molecular [26] e CDK1 tem o papel principal na proliferação celular e até mesmo na transformação maligna [10]. Suspeitamos que o Ki-67 não apenas iniciou a entrada das células IPs na fase G1 do ciclo celular, mas também causou a transformação maligna em núcleos celulares ao afetar o CDK1.

Os papéis clínicos de p21 e p27 para a cancerização do CEC de cabeça e pescoço ainda são debates, mas descobrimos que o nível mais baixo de p27 também se revelou em IPs nasossinusais com transformação maligna em nosso estudo. Embora houvesse poucos estudos de p21 e p27 relatando a correlação de IPs humanos com cancerização, os debates ainda permaneceram. Alguns foram com Oncel et al. [11, 27] e alguns foram contra [25, 28] observado.

Além do Ki-67, também encontramos o PCNA, um preditor de transformação maligna de IPs na colaboração com CDK1. Em nossos IPs com transformação maligna, tanto PCNA quanto Ki-67 foram elevados por colorações de IHC.

Como a expressão elevada de PCNA mostrou em IP com transformação maligna de nossa pesquisa, suspeitamos que o PCNA seja um fator importante para induzir a cancerização para pacientes com IP nasossinusal. Recentemente, também é encontrado o PCNA elevado no IP em relação aos pólipos nasossinusais de Mumbuc et al. [3]. O PCNA poderia interagir com o CDK1 e promover a entrada da célula no ciclo celular para a conseqüente proliferação e cancerização.

Finalmente, pesquisamos o PLUNC para os IPs nasossinusais com cancerização, uma vez que é frequentemente relatado como causador da formação de câncer nasofaríngeo. Em nosso estudo anterior, a expressão de PLUNC estava diminuída na sinusite de pseudomonas em estado de doença crônica [29]. O PLUNC também foi correlacionado à rinossinusite crônica com colonização por múltiplas bactérias [17]. E, além disso, o PLUNC também deveria ter função antiinfecciosa e antibiofilme [30, 31]. Porque era suposto ter anticancerígeno de carcinoma nasofaríngeo [32], mas não encontramos correlação de PIs nasossinusais com transformação de CEC. Ao contrário, só pudemos encontrar a expressão elevada de PLUNC em pacientes com IPs nasossinusais com múltiplas recorrências e cirurgia de revisão dos seios da face. O mecanismo adicional e as razões para a expressão elevada de PLUNC e múltiplas recorrências devem ser pesquisados ​​no futuro.

O projeto de drogas auxiliado por computador (CADD) pode ser usado para investigar mais a pesquisa clínica ou de doenças, incluindo pesquisas de doenças [33], estudos de fatores de risco [34], relatos de casos e mecanismo molecular. Em nossos resultados de docking e dinâmica molecular de PCNA, Ki-67 e p27 para CDK1, descobrimos que todos os três tinham docking estável para CDK1. E o p27 deveria ter uma interação mais estável com o CDK1 para funcionar como um inibidor de IPs nasossinusais com cancerização. O PCNA e o Ki67 foram considerados promotores e promovem a proliferação e cancerização celular em IPs nasossinusais.

Em conclusão, este é um primeiro estudo mostrando que o Ki-67, PCNA e p27 são todos importantes nas recorrências de IPs e cancerização via CDK1. E também somos os primeiros a encontrar expressão elevada de PLUNC em múltiplos IPs nasossinusais de recorrência. No entanto, mais pesquisas sobre o mecanismo ainda se justificam no futuro. Os estudos computacionais atuais são todos compatíveis com nossos estudos de laboratório úmido, o que torna nosso estudo mais confiável e pode ser aplicado ao futuro tratamento de pacientes com essa doença. Portanto, pacientes com IP nasossinusal e expressaram Ki-67 elevado, PCNA e p27 diminuído devem ser considerados como tendo maiores possibilidades de transformação maligna e devem ser acompanhados mais de perto na prática clínica [35].

Conflito de interesses

Os autores declaram não haver conflito de interesses quanto à publicação deste artigo.

Agradecimentos

A pesquisa foi apoiada por doações do Conselho Nacional de Ciência de Taiwan (NSC101-2314-B-039-013-MY3, NSC102-2325-B039-001, NSC102-2221-E-468-027), da China Medical University ( CMU102-BC-3), da Asia University (ASIA100-CMU-2, ASIA101-CMU-2 e 102-ASIA-07) e do China Medical University Hospital (DMR-102-001, DMR-103-025, DMR-103-058, DMR-103-001 e DMR-103-096). Este estudo também é apoiado em parte pelo Centro de Excelência de Pesquisa e Testes Clínicos do Departamento de Saúde de Taiwan (DOH102-TD-B-111-004) e Centro de Excelência de Pesquisa do Departamento de Saúde de Taiwan (MOHW103-TD-B-111-03) ), e CMU sob o objetivo de Plano de Universidade Superior do Ministério da Educação, Taiwan.

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