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Como a RNAse pode degradar qualquer RNA?

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Cada RNA possui uma sequência única. Visto que a RNAse é uma enzima e os substratos reagem ao seu sítio ativo em um mecanismo de chave, como a RNAse é capaz de degradar qualquer tipo de RNA?


As enzimas variam na especificidade do substrato

Isso é abordado na maioria dos livros de bioquímica, mas você pode encontrar explicações na web, por exemplo, aqui. No que diz respeito às ribonucleases, pode haver alta especificidade (por exemplo, reconhecimento de um RNA com uma sequência de base específica), especificidade mais baixa (3'- ou 5'-exonucleases - agem a partir dessas respectivas extremidades) ou especificidade limitada à ligação particular a ser quebrada (por exemplo, a ribonuclease pancreática digere qualquer ligação fosfodiéster de RNA - mas não DNA). (Há também especificidade de fita - entre RNA de fita dupla e simples.)

O que determina essa especificidade variável?

Evidentemente, a especificidade do substrato é determinada pela extensão da estrutura do substrato que a enzima tem que reconhecer - isto é, ligar-se a uma 'fechadura e chave', referida na pergunta. Isso requer familiaridade com a química do substrato, neste caso o RNA:

No diagrama acima (modificado de Berg et al.) a ligação fosfodiéster que deve ser clivada é destacada. Podemos deduzir a partir deste diagrama que, para ser específico para RNA - mas não mais - uma ribonuclease precisa ser capaz de reconhecer a ribose 2'OH (ou seja, distingui-la de 2'-desoxirribose), bem como reconhecer a ligação fosfodiéster. Não há necessidade de reconhecer as bases.

O mecanismo de ação da ribonuclease pancreática bovina

O mecanismo da RNase pancreática foi estabelecido na década de 1960, muito antes de qualquer RNase que reconhecesse sequências particulares, embora tenha sido refinado posteriormente. Um diagrama do artigo de Roberts et al. (1969) é mostrado abaixo.

O diagrama mostra uma 'bolsa' para uma das bases adjacentes à ligação fosfodiéster, mas isso só precisa ser geralmente hidrofóbico, capaz de acomodar qualquer uma das quatro bases.

Para estudar a interação das bases com a RNAase, é necessário obter estruturas cristalinas de RNAase complexadas a pseudo-substratos ou inibidores (o verdadeiro substrato hidrolisa, é claro). A literatura aqui é complexa e não posso fornecer uma revisão conveniente do tópico. Parece que a ligação do RNA é estabilizada pela interação de bases particulares com a proteína, mas o ponto chave é que tais interações não são um requisito para a ligação do substrato. Como ponto de partida para a literatura, sugiro a página da Protopédia na RNase A e um artigo de Birdsall e McPherson.


Manuseio de RNA - Como evitar a contaminação por RNase - (24 / nov / 2009)

Oi susanna, Você pode autoclave o pilão metálico e limpar todas as superfícies que entram em contato com o tecido com RNaseZap. Não se preocupe Se você não tiver RNaseZap no laboratório, certifique-se de homogeneizar o tecido logo e sempre mantê-lo frio e adicionar o tampão de lise o mais rápido possível após a trituração. Isso deve fazer o trabalho & # 33

TENHO UMA PERGUNTA A RESPEITO DA EXTRAÇÃO DE RNA COM O REAGENTE TRIZOL. POR QUE EU AQUECO O TRIZOL? É BOM AQUECER OU ISSO IMPORTA?

Esteja preocupado com RNases no tecido - trabalhe rapidamente, no gelo, se possível.

Se você estiver usando um tampão com alto teor de sal para homogeneizar o tecido, isso deve inibir um pouco as RNases.
Eu homogeneizo meu tecido já em Trizol, que desnatura todas as proteínas, incluindo RNases.

Para descontaminar, você pode usar SDS a 0,5% e limpar tudo com etanol 70% feito com DEPC & # 39d H2O.
Mais importante ainda, eu limpo tudo que toco, incluindo minhas luvas, com SDS a 0,5% e limpo com EtOH a 70% para evitar qualquer contaminação por RNase.

Eu não autoclave, é difícil para o equipamento e não é 100% eficaz em RNases.

Pode ser um pouco tarde para postar uma resposta a este tópico devido à sua idade, mas já que está fixado.

Normalmente preparamos 4 tubos de 50 mL. Encha três com 40 mL de água tratada DEPC e um com etanol 100%.
Um dos tubos de água tratada com DEPC recebe de 5 a 10 jatos de RNase Zap.
Entre cada amostra, o homogeneizador é mergulhado em etanol 100%, água RNase Zap e 2x DEPC água tratada por sua vez.
Cada vez que ligar o homogeneizador por cerca de 15-30s.

Isso é bastante rápido e parece funcionar bem para nós.

Comparado ao RNase que será liberado do tecido, o RNase possivelmente trazido pela ponta é realmente insignificante. O tampão de lise geralmente contém alta concentração de sal de guanidina, supostamente desnaturaria toda a RNase, independentemente das fontes. No entanto, o RNA ainda sofre degradação contínua nos lisados, por isso, uma vez homogeneizadas, as amostras precisam ser processadas imediatamente. Alternativamente, o reagente RNASound da Metammune pode ser adicionado na Lise para aumentar a estabilidade do RNA nos lisados.

algo que você pode considerar para extração de RNA é o uso de nitrogênio líquido:

-Em um almofariz, onde previamente flambado 100% etanol, lavado com RNAse equivalente Zap, congelar rapidamente o tecido.
Em seguida, esmague o tecido com o pilão (também tratado com RNAse Zap) em pó.
- despeje o pó em um tubo onde você adiciona o trizol.
-siga o protocolo normal (trizol-clorofórmio).

Eu geralmente continuo adicionando um pouco de nitrogênio líquido na argamassa enquanto esmaga para garantir que minha amostra de tecido permaneça congelada. Essa técnica é verdadeiramente eficiente, pois o tecido está bem preservado.
Espero que isso ajude alguns de vocês

Dodger na terça-feira, 23 de novembro, 00:20:46 de 2010 disse:

Pode ser um pouco tarde para postar uma resposta a este tópico devido à sua idade, mas já que está fixado.

Normalmente preparamos 4 tubos de 50 mL. Encha três com 40 mL de água tratada com DEPC e um com etanol 100%.
Um dos tubos de água tratada com DEPC recebe de 5 a 10 jatos de RNase Zap.
Entre cada amostra, o homogeneizador é mergulhado em etanol 100%, água RNase Zap e 2x DEPC água tratada por sua vez.
Cada vez que ligar o homogeneizador por cerca de 15-30s.

Isso é bastante rápido e parece funcionar bem para nós.

Eu faço exatamente assim. A diferença é que um enche um tubo (2ml) com etanol 100%, um com água tratada e esguicho RNAzap e outro apenas com água tratada. Eu preparo esses três tubos para cada amostra. Assim, após a homogeneização lavo a ponta do homogeneizador nesses tubos nessa sequência. Na próxima amostra, troco os tubos e uso outros novos. Minha preocupação é evitar a contaminação cruzada. Como eles disseram antes, o tecido está cheio de RNAse & # 33


Sondas Biofísicas, Químicas e Funcionais da Estrutura, Interações e Enrolamento do RNA: Parte B

Francis E. Reyes,. Robert T. Batey, em Methods in Enzymology, 2009

4.4 Analisar o cristal para clivagem de RNA

A degradação do RNA por meio da hidrólise da estrutura fosfodiéster é geralmente vista como um impedimento à cristalização, particularmente na etapa de preparação do RNA, onde a hidrólise descontrolada de um RNA leva à heterogeneidade química. No entanto, a hidrólise controlada da estrutura do RNA durante a cristalização, também conhecida como "digestão em queda", pode ser vantajosa. Isso é análogo à degradação proteolítica limitada em vários esforços de cristalização que levam a cristais de um produto de degradação (Campbell et al., 2002 Sawaya et al., 1994). A hidrólise do RNA é controlada por causa das restrições estereoquímicas da reação de hidrólise: o grupo 2′-hidroxila do açúcar ribose ataca o grupo fosfato em uma configuração em linha para produzir uma clivagem da espinha dorsal imediatamente 3 ′ da hidroxila de ataque grupo. O ataque não ocorre com bases em uma hélice em forma de A ou em uma conformação restrita (já que a hidroxila deve ser capaz de amostrar a configuração em linha) e, portanto, ocorre em regiões que são conformacionalmente flexíveis. Os locais de clivagem do esqueleto podem ser prontamente resolvidos por P rotulando o RNA cristalizado e separação dos produtos em um gel de poliacrilamida desnaturante. O isolamento de cada produto de clivagem e o sequenciamento enzimático revelam a localização do evento de clivagem.

Gerenciar locais de flexibilidade conformacional, conforme revelado pela hidrólise limitada, pode levar a cristais de melhor difração como resultado da desordem reduzida da área flexível ou criando um local conformacionalmente homogêneo de um contato de rede. Uma abordagem popular é projetar um sistema de RNA de duas peças definido pela posição de clivagem. As peças separadas são recozidas pós-purificação e submetidas a testes de cristalografia. Golden e Cech perceberam que o domínio P4-P6 continha clivagens devido à cristalização e usaram um sistema de duas peças como um meio para introduzir derivados de nucleotídeos de átomos pesados ​​sintetizando quimicamente um pequeno oligonucleotídeo com 5-iodouridina (Golden et al., 1996). o glmS ribozima (Klein e Ferré-D & # x27Amaré, 2009) e o riboswitch FMN (Serganov et al., 2009) usaram especificamente sistemas de duas peças para melhorar a cristalização e a resolução de difração. No caso do FMN, a perda da hélice de cobertura de loop 4 permitiu contatos de rede melhorados. Em ambos os casos, o uso de um sistema de duas peças pode ter aliviado a restrição do backbone e permitido uma conformação alternativa que era necessária para estabelecer um enchimento de cristal mais apertado.


Reguladores de sinalização de proteína G, parte B

Patrizia Tosetti, Kathleen Dunlap, em Methods in Enzymology, 2004

Extração total de RNA de DRGs de pintinhos.

Para evitar a degradação do RNA por ribonucleases exógenas, luvas e material livre de RNase devem ser usados ​​durante o processo de extração. O RNA total de neurônios DRG de embriões de galinha de 11 ou 12 dias de idade (Charles River SPAFAS, North Franklin, CT) é extraído em uma única etapa usando uma solução ácida de fenol / tiocianato de guanidínio (reagente STAT-60, Tel-Test Inc ., Friendswood, TX). Para uma descrição detalhada da dissecção DRG de pintinhos embrionários, consulte Anantharam e Diversé-Pierluissi (2002). DRGs de quatro embriões de galinha são coletados em um tubo Eppendorf livre de RNase e 1 ml de STAT-60 é adicionado. A mistura é completamente homogeneizada em um homogeneizador de vidro-Teflon, acionado por motor e bem ajustado, e é então deixada em temperatura ambiente por 5 minutos para permitir a dissociação completa dos complexos de nucleoproteína. O tiocianato de guanidínio, um poderoso desnaturante de proteína, inativa todas as ribonucleases endógenas liberadas durante a homogeneização do tecido. Após a adição de 200 μl de CH3Cl, a mistura é agitada vigorosamente durante 15 s, deixada à temperatura ambiente durante 3 min e depois centrifugada durante 15 min a 4 °. Sob as condições ácidas ditadas por STAT-60 (pH 4), o RNA permanece na fase aquosa superior, enquanto as proteínas e o DNA se localizam na interface entre as duas fases e na fase orgânica inferior, e os detritos celulares são insolúveis. A fase superior é transferida para um novo tubo livre de RNase, com muita atenção para evitar a interface, e 0,5 ml de isopropanol é adicionado ao tubo. Depois de deixar a mistura em temperatura ambiente por 10 min para permitir a precipitação do RNA, o processo é completado por centrifugação do tubo a 13.000g por 15 min a 4 °. O sobrenadante é descartado e o pellet é lavado com 1 ml de 75% de EtOH para eliminar guanidínio contaminante residual, submetido a vórtice e centrifugado a 7500g por 5 min a 4 °. Depois de retirar o sobrenadante, o pellet é parcialmente seco ao ar por 10-15 min, evitando a desidratação completa, o que diminuiria muito a solubilidade do pellet. O RNA é finalmente dissolvido em água tratada com dietilpirocarbonato livre de RNase, e sua concentração e pureza são determinadas por análise espectrofotométrica.


Protegendo os genomas de picornavírus da degradação de RNAse nos endossomos

O artigo de pesquisa, O RNA do picornavírus é protegido da clivagem pela ribonuclease durante a remoção do vírion e a transferência através das membranas celulares e modelo, 1 descreve os resultados de um estudo que investigou como o RNA de Picornavírus é transferido do vírion para o citoplasma da célula hospedeira sem degradação por ribonucleases. A pesquisa se concentra especificamente no conhecido poliovírus, pertencente ao gênero enterovírus. Este resumo inclui informações básicas sobre os picornavírus e sua entrada nas células hospedeiras, uma revisão das questões e modelos apresentados pelo estudo e uma discussão dos resultados apresentados no artigo.

Os picornavírus pertencem à família, Picornaviridae, que contém seis gêneros diferentes. Os picornavírus são pequenos vírus icosaédricos. Seus diâmetros de vírion medem 18-30 nm de comprimento. Os vírus não são envelopados, o que significa que as cápsides do vírion não estão envolvidas por uma membrana protetora. Os genomas dos Picornavírus são constituídos por RNA de fita simples de sentido positivo (+ ssRNA). O + ssRNA atua como mRNA em células hospedeiras para codificar uma única poliproteína que mais tarde é clivada em proteínas funcionais menores após a transcrição. 2

Os picornavírus sem envelope, como o poliovírus, entram na célula hospedeira por meio de endocitose mediada por receptor. Este processo ocorre pela fixação do vírion em proteínas receptoras específicas localizadas nas membranas celulares das células hospedeiras. Os poliovírus ligam-se aos Receptores de Poliovírus CD155 (PVR) de suas células hospedeiras. É importante mencionar que os PVRs alteram o tamanho dos vírions de 160S para 135S após a fixação, resultando em um aumento de 4%. 1 Uma vez ligado à membrana celular externa do hospedeiro, o vírion é levado para dentro da célula por uma inversão da membrana celular para criar uma vesícula para o vírion, denominado “endossomo” pelos autores.

Durante o processo endocitótico, o vírion não é a única partícula trazida para a célula hospedeira. O soro dentro do qual o vírion estava viajando antes da fixação da célula hospedeira, e as enzimas dentro do soro também são envolvidas pelo endossomo e entregues na célula. Uma das enzimas normalmente incluídas é a ribonuclease A (RNase A). Ribonucleases são enzimas que catalisam a quebra e degradação de moléculas de RNA. 3 O papel das RNases é regular a expressão do mRNA e proteger as células de ácidos nucléicos estranhos.

É importante notar a importância da RNase A à medida que é introduzida nas células hospedeiras junto com os vírus que transportam RNA. Este estudo tem como objetivo responder a quatro questões envolvendo as possíveis interações entre o endossomo, vírion e RNases durante a transferência de RNA para o citoplasma:

“A) o RNA é liberado de posições aleatórias na partícula, apenas & lt10% dos quais são adjacentes à membrana?

  1. b) o processo de fixação induz uma polarização da partícula de forma que o RNA só seja liberado de uma posição adjacente à membrana?
  2. c) o RNA liberado no lúmen endossomal atravessa a membrana para atingir o citoplasma?
  3. d) o RNA é protegido durante a transmissão através da membrana de RNases que podem estar presentes no lúmen endossomal? ” 1

As respostas a essas perguntas têm o potencial de lançar luz sobre o mecanismo pouco claro de como o RNA viral do Picornavírus entra no citoplasma da célula hospedeira sem degradação pelas ribonucleases.

O artigo apresenta três possibilidades para a translocação de RNA. O primeiro modelo possível envolve a ruptura da membrana endossômica para liberar o conteúdo da vesícula no citoplasma da célula. O segundo modelo envolve a ruptura da membrana endossomal causada pela inserção de peptídeos virais. O terceiro modelo sugere que os peptídeos interagem com a membrana do endossomo e o vírion para criar um canal através do qual o RNA viaja. 1 Os resultados deste estudo sugerem que os dois primeiros modelos são improváveis, enquanto o terceiro modelo fornece uma explicação provável para a transferência de RNA do picornavírus.

O estudo primeiro testou a capacidade do RNA viral de ser translocado para uma vesícula por meio da remoção do vírus. Imagens tomográficas de crioelétrons foram usadas para capturar a inserção viral + ssRNA em um em vitro lipossoma (imitando um na Vivo endossomo). 1

Os lipossomas continham receptores de poliovírus em suas membranas externas para facilitar a fixação do vírus. A entrada do RNA viral nos lipossomas decorados com receptor apóia a ideia de que o RNA é capaz de viajar através de canais ou poros, e que a ruptura da membrana não é uma etapa necessária na translocação do RNA.

O estudo de pesquisa também descobriu que o RNA translocado nos lipossomas era insensível à RNase A. 1 fluorescência YoPro-1 foi usada para monitorar a ligação do ácido nucleico dentro e fora dos lipossomas, enquanto a RNase A foi adicionada apenas ao exterior dos lipossomas. A microscopia de fluorescência foi usada para observar a sobrevivência do RNA na presença de RNase A.

A preservação do RNA viral através da membrana do lipossoma na presença de RNase A sustenta ainda que os poliovírus são capazes de transferir seus genomas através de uma membrana lipídica sem degradação pelas ribonucleases. Os canais através dos quais o RNA viral viaja são capazes de proteger o ácido nucleico de ambientes potencialmente fatais.

O estudo expandiu a pesquisa, tentando na Vivo experimentos para determinar se o RNA viral foi ou não translocado com sucesso em células de cultura e protegido de RNase A de maneiras semelhantes observadas no em vitro experimentos. As células HeLa Ohio foram infectadas com poliovírus na presença de RNase A. O líquido extracelular foi marcado com dextrans, um marcador fluorescente vermelho. Os poliovírus foram marcados com corante fluorescente Cy2 que apresenta fluorescência verde. Quando sobrepostos, os dois marcadores apresentam uma fluorescência amarela. Os resultados do experimento foram vistos com microscopia fluorescente.

Os resultados do na Vivo experimentos indicam que o fluido extracelular e o material são levados para dentro da célula junto com o poliovírus durante a endocitose. Assumindo que as RNases podem estar presentes no fluido extracelular e podem ser levadas para a célula com os vírus, a possibilidade de um portal protegido através do qual o RNA viral pode viajar para evitar a degradação é ainda mais provável.

Finalmente, a infectividade do poliovírus foi testada enquanto as partículas do vírus foram covalentemente ligadas à RNase A. 1 A ligação do vírus à ribonuclease garantiu que a RNase seria levada para a célula hospedeira com o vírus. O poliovírus foi marcado fluorescentemente com o marcador Cy2. A RNase foi marcada por fluorescência com o marcador DyLight-594. Microscopia de fluorescência foi usada para mostrar a interação entre o poliovírus e as enzimas RNase A dentro de uma célula hospedeira. Os resultados indicam que os poliovírus não foram afetados pela RNase A e ainda eram capazes de infectar a célula hospedeira. Este resultado suporta ainda a hipótese de que a inserção de RNA viral é protegida da degradação de RNase A.

Os resultados do estudo sugerem respostas plausíveis para as quatro questões colocadas sobre a translocação de RNA. O experimento sugere que a liberação de RNA pode ter certa direcionalidade, a qual poderia ser resultado da partícula viral alterada interagindo bioquimicamente com a membrana celular. As questões a) eb) não podem ser totalmente respondidas de acordo com esses resultados, mas fornecem uma base sólida para pesquisas futuras. A resposta à questão c) é que o RNA pode viajar através do lúmen endossomal, mas na presença de ribonucleases, precisa ser protegido. A resposta à pergunta d) é sim, o RNA é protegido durante a transmissão para o citoplasma. Os experimentos indicam que enquanto a RNase A está presente e é capaz de catalisar a degradação do RNA, o poliovírus permanece viável dentro da célula hospedeira e continua com a infecção. Neste ponto, a infecção só pode ser possível se o RNA viral estiver protegido das RNases.

Embora os resultados do estudo não tenham sido capazes de responder a todas as questões colocadas com total clareza, o modelo em que os Picornavírus inserem seu + ssRNA no citoplasma da célula hospedeira foi reduzido de forma bastante clara para o terceiro modelo: que os canais são formados para permitir o RNA viral para translocar com segurança para o citoplasma. 1 A Figura 1 descreve uma previsão simplificada deste modelo de formação de canal.

Fig. 1. Modelo simplificado de translocação de RNA de poliovírus dentro da célula hospedeira. À medida que o poliovírus se liga ao receptor do poliovírus CD155 na membrana celular, a endocitose incorpora o vírus junto com a RNase As no soro extracelular. Um canal se forma entre a membrana do endossomo e a partícula do vírus para permitir que o + ssRNA deixe o endossomo e entre no citoplasma.

Os outros dois modelos envolvendo ruptura de membrana podem ser descartados neste caso, pois os resultados mostram que a RNase A é capaz de degradar o RNA viral. Se a ruptura da membrana ocorresse, as RNases seriam liberadas junto com o RNA viral no citoplasma, e haveria degradação do RNA antes que a transcrição pudesse prosseguir. Com base nos resultados deste estudo, o RNA do picornavírus deve ser protegido em todos os momentos da RNase A para infectar com sucesso seus hospedeiros celulares.

O estudo admite que ainda há debate sobre como os canais de proteínas poderiam se formar entre as partículas do vírus e a membrana endossômica. No entanto, esta pesquisa fornece alguma clareza sobre como os Picornavírus translocam seu + ssRNA para infectar seus hospedeiros. Este estudo lançou as bases para novas pesquisas a serem feitas para tentar determinar os mecanismos de proteção do RNA viral quando ele é transferido para o citoplasma da célula hospedeira.


Dados suplementares

Este arquivo contém Métodos Suplementares, Tabelas Suplementares 1–5, Figuras Suplementares 1–11 e Referências Suplementares. (PDF 1486 kb)

Filme Complementar 1

Este filme mostra uma visão global da molécula de RNA de 13 nucleotídeos ligada ao mutante RNase II D209N, com RNA em bastões coloridos de azul a vermelho de acordo com seus parâmetros de deslocamento atômico crescentes, e com o desenho da enzima colorido por domínios, nomeadamente CSD1 em amarelo, CSD2 em laranja, RNB em ciano e S1 em verde. (MPG 6702 kb)

Filme Complementar 2

Este filme mostra uma visão global da molécula de RNA de 13 nucleotídeos ligada ao mutante RNase II D209N, com RNA em bastões coloridos de azul a vermelho de acordo com seu deslocamento atômico crescente. Este filme mostra visualizações ampliadas das interações entre RNase II e a molécula de RNA ligada , nomeadamente na região de ancoragem, através dos nucleótidos intermediários flexíveis, e nos 5 nucleótidos de ARN terminais fixados entre resíduos aromáticos conservados, na cavidade catalítica. (MOV 6291 kb)


COMPARAÇÃO DE DETERIORAÇÃO DE ARNm E DEGRADAÇÃO DE ARN ESTÁVEL

Com base na discussão anterior, é evidente que o decaimento do mRNA e a degradação do RNA estável compartilham muitas características comuns. Assim, os processos globais, envolvendo clivagens endonucleolíticas iniciais seguidas por digestão exonucleolítica dos fragmentos resultantes são notavelmente semelhantes para mRNA e rRNA (ainda não se sabe se as clivagens endonucleolíticas desempenham qualquer papel no controle de qualidade de tRNA defeituoso) (Figura 2). O que difere nos dois processos é que o decaimento do mRNA é um aspecto contínuo do metabolismo celular, enquanto a degradação do rRNA ocorre apenas em condições especiais. O que estabiliza o rRNA durante o crescimento normal, em contraste com o mRNA, não está claro, mas é provável que seja devido à sua associação com proteínas ribossômicas em uma partícula RNP estável que impede a acessibilidade a RNases. No entanto, se um ribossomo for mal montado de forma que o rRNA não seja totalmente protegido, a degradação ocorreria, resultando no que chamamos de controle de qualidade (18). Isso forneceria um mecanismo simples para a remoção de ribossomos defeituosos. O processo durante a fome que leva à degradação do rRNA não é compreendido, mas é provavelmente devido a alguma alteração na estrutura do ribossomo que resulta em maior acessibilidade a um RNase. Nas situações em que a degradação do rRNA resulta da entrada da RNase I na célula, seu pequeno tamanho (27 kDa) presumivelmente permite que ele atue no rRNA dentro da estrutura do ribossomo, pois os ribossomos são sensíveis à RNase I em vitro ( 50 ).

Talvez a semelhança mais óbvia entre o decaimento do mRNA e a degradação do RNA estável é que as mesmas RNases participam de ambos os processos (Figura 2). Isso é mais aparente para as exoribonucleases, e não é surpreendente que os três principais participantes, PNPase, RNase II e RNase R, atuem de forma processual, pois esta seria a maneira mais eficiente de degradar fragmentos de RNA. Além disso, o que emergiu de vários estudos é que é a estrutura do RNA, não o tipo de RNA (mRNA ou RNA estável) que determina quais RNases serão usadas para degradação. Assim, PNPase e RNase R parecem ser os degradadores multifacetados de RNAs com estrutura secundária, sejam elementos mRNA REP (15), tRNAs defeituosos (32) ou fragmentos de rRNA (18), devido à sua capacidade de digerir tais moléculas. Quando longos trechos de RNA não estruturado precisam ser degradados, a RNase II provavelmente será o principal contribuinte no E.coli por sua rápida ação sobre tais moléculas e sua presença em células em níveis elevados (22). Da mesma forma, a oligoribonuclease é a principal enzima que remove os oligonucleotídeos residuais gerados durante a degradação do RNA porque é a única RNase que pode fazer isso de forma eficiente (29).

Outra semelhança entre o decaimento do mRNA e a degradação estável do RNA que foi inicialmente bastante surpreendente é o significado da poliadenilação para ambos os processos. A presença de caudas poli (A) em mRNAs, e também em fragmentos de mRNA, foi claramente estabelecida, e sua importância para o decaimento do mRNA na Vivo demonstrado (51). O que foi inesperado, no entanto, é que os precursores de RNA estáveis ​​também acumulam caudas poli (A) quando não podem amadurecer (52), e que a cauda poli (A) é necessária para a remoção eficiente de tRNA defeituoso na Vivo (32). Também é conhecido que rRNAs incompletos podem acumular caudas poli (A) (53), mas seu papel na degradação de rRNA ainda não foi demonstrado. No entanto, esse papel seria esperado porque agora é entendido que as caudas de poli (A) servem como um local de ligação de fita única necessário para cada uma das três exoribonucleases degradativas, PNPase, RNase II e RNase R (15). Nenhuma dessas enzimas é capaz de atuar sobre uma molécula de RNA de fita completamente dupla ou mesmo uma com cauda 3 ′ curta, presumivelmente devido à sua incapacidade de se ligar ao substrato (15). A importância de uma cauda de fita simples para a ligação da enzima foi agora confirmada diretamente para RNase R por experimentos de ligação de RNA (H. Vincent e M.P. Deutscher, dados não publicados).

Uma característica da degradação do RNA que precisa ser esclarecida para ser capaz de comparar totalmente o decaimento do mRNA e a degradação do RNA estável é identificar as endoribonucleases envolvidas na degradação do RNA estável e avaliar o papel do degradossoma em cada processo. Na ausência de PNPase e RNase R, as células acumulam grandes quantidades de fragmentos derivados de rRNA 16S e 23S (18). No entanto, a endoribonuclease responsável por gerar esses fragmentos não foi identificada. De forma semelhante, fragmentos derivados de mRNAs contendo elementos REP também se acumulam em células sem PNPase e RNase R (15). No entanto, sabe-se que esses fragmentos são gerados pela RNase E, como parte do degradossoma (11). Continuando a ideia de mecanismos comuns para toda a degradação de RNA, não seria surpreendente se RNase E ou RNase G desempenhassem um papel semelhante no início da degradação de rRNA. Na verdade, foi demonstrado que essas enzimas participam da degradação do ribossomo em um em vitro sistema (M. Zundel e M.P. Deutscher, dados não publicados).

Se a RNase E está envolvida na degradação estável do RNA, surge a questão de saber se ela o faz como parte do degradossoma, como na quebra do mRNA. Sabe-se que a RNase E pode funcionar quase normalmente para a maturação do rRNA 5S, mesmo na ausência de formação de degradossoma (10), indicando que o degradossoma não é necessário para todas as ações de RNase E. Por outro lado, mesmo uma pequena perda no processamento a eficiência pode ter efeitos profundos no crescimento em condições naturais. Considerando o papel do degradossoma na degradação estável do RNA, é interessante notar que a composição da proteína do E.coli alterações degradossomas sob pelo menos uma condição de estresse, choque frio, levando à substituição da helicase de RNA, RhlB, por outra helicase, CsdA (54). Visto que duas outras enzimas envolvidas na remoção de RNA estável, PNPase e RNase R, são muito elevadas durante o choque frio (25, 27, 28), esses dados sugerem que esta condição de estresse pode afetar a estabilidade do RNA. A alteração concomitante do degradossoma dá suporte à sua participação, assim como a capacidade dos degradossomas isolados de degradar o rRNA. em vitro (31). Nesse sentido, é intrigante que o degradante presente em Pseudomonas Syringae Lz4W contém RNase R em vez de PNPase (55). É também de interesse considerável que outro trabalho recente indica que o degradossoma pode variar em composição em resposta ao ambiente (9), e que a RNase E pode ser programada para decadência de RNAs específicos por associação com pequenos RNAs não codificantes (56). Todas essas informações sugerem que a RNase E pode fazer parte de vários complexos RNP, e que o degradossoma do RNA é apenas um deles.


MATERIAIS E MÉTODOS

Construção de vetor de expressão

O gene RNase R de comprimento total foi amplificado por PCR de E. coli BL21 (DE3) usando o iniciador direto: 5′-GGGATATCCATATGTCACAAGCTTTCCAG-3 ′ e o iniciador reverso: 5′-CCGGAATTCTCACTCTGCCACTTTTTTCT-3 ′. A RNase R ΔHTH-K truncada (resíduos 87 a 725) foi amplificada do gene de comprimento total usando o iniciador direto: 5′-GGGAATTCCATATGGGTACCGTTATTGGCCACC-3 ′ e o iniciador reverso: 5′-CCGCAATTCTCAGATCAGGCTAAAG-3TTCGATCAGATCAGGCTAAAG-3TTTCGATCAGATCAGGCTAAAG-3TTTTCGATCAGGCTAAAG-3. Os produtos de PCR foram inseridos em locais EcoRI / NdeI do vetor de expressão pET-28a (Invitrogen) para produzir proteínas com marcadores 6xHistidina N-terminais. Os mutantes em cunha RNase R Δ3H e 1H foram construídos por reação em cadeia da polimerase de extensão sobreposta (OE-PCR) (31). Para Δ3H, os fragmentos com os resíduos 487–545 foram excluídos usando os iniciadores 5′-TTCCGTATTCACGACGGCAGCCAGGCGATTTACGATCCACAAAACC-3 ′ e 5′-CTGCCGTCGTGAATACGGAACAGTGCCGGTTCTTTCGCTTT′CAGGTTTCTTTCGCTTT′CAGGTT. Para o mutante 1H, OE-PCR foi realizado em duas etapas primeiro, os resíduos 524-535 em RNase R foram substituídos pelos resíduos 458-465 de RNase II e, em seguida, os resíduos 536-545 em RNase R foram substituídos pelos resíduos 466-473 de RNase II. Os iniciadores utilizados para a primeira etapa foram 5'-GCGGAGCTGCTGGAGGCGCAACCAACTGGTTTCCTCGACCAGGCGATTTACGATCC-3 'e 5'-GGATCGTAAATCGCCTGGTCGAGGAAACCAGTTGGTTGCGCCTCCAGCAGCTCCGC-3', enquanto que os iniciadores utilizados para o segundo passo foram 5'-ACTGGTTTCCTCGACAGCCGCATTCGTCGCTTCCAGTCACAGGCGATTTACGATCCAG-3 'e 5'-CGGCTGTCGAGGAAACCAGTTGGTTGCGCCTCCAGCAGCTCCGC-3'.

Expressão e purificação de proteínas

Todos os construtos foram transformados em E. coli (BL21) células (Stratagene) incubadas a 37 ° C. Quando OD600 atingiu 0,6, a expressão da proteína foi induzida usando IPTG 1,0 mM e incubação durante a noite a 18 ° C. Após a centrifugação, as células foram coletadas e ressuspensas em tampão A (Tris-HCl 25 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM, imidazol 5–10 mM, beta-ME 5 mM, PMSF 1 mM) e, em seguida, rompidas por um microfluidificador (Microfluidics M-110P). O sobrenadante foi aplicado à coluna HisTrap HP (GE HealthCare) antes de ser equilibrado pelo tampão A. As proteínas ligadas foram eluídas usando um gradiente de imidazol entre o tampão A e o tampão B (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 500 mM NaCl, 300 imidazol mM). As frações de proteína eluída foram combinadas e (NH4)2TÃO4 foi adicionado até 1,5 M. As amostras de proteína foram carregadas em uma coluna de fenil de fase reversa (GE HealthCare) equilibrada pelo tampão de fenil (Tris-HCl 25 mM pH 8,0, 1,5 M (NH4)2TÃO4) As proteínas foram então eluídas com um gradiente de 1,5 a 0 M (NH4)2TÃO4. The purified RNase R was concentrated and applied to a gel filtration column (GE HealthCare, Superdex 200 Increase 10/300 GL) in a running buffer of 20 mM Tris–HCl, pH 7.5 and 400 mM NaCl. Collected protein samples were concentrated to ∼15 mg/ml and stored at –20°C.

Crystallization and structure determination

RNase R was crystallized by the hanging-drop vapor diffusion method at room temperature by mixing 1 μl of protein sample (15 mg/ml RNase R ΔHTH-K, 20 mM Tris–HCl, pH7.5 and 400 mM NaCl) and 1 μl reservoir solution (modified from Hampton PEG/Ion 2 Screen, number 14: 8% Tacsimate, pH6.0 and 15% Polyethylene glycol 3350). X-ray diffraction data were collected at BL-13C1 at the National Synchrotron Radiation Research Center (NSRRC), Hsinchu, Taiwan, and the collected data were processed and scaled by HKL2000 ( 32). The structure was solved by the molecular replacement method using yeast Rrp44 (PDB id: 2VNU) as the search model by the AutoMR function in the program Phenix ( 33). The structure model was built using Coot and refined by Phenix, containing two RNase R molecules in the asymmetric unit. Disordered regions not built in the model included residues 102–105, 132–136 and 428–431 in chain A molecule, and residues 101–105, 127–137 and 429–431 in chain B molecule.

RNase activity assays

For the RNA degradation experiments shown in Figure 1C, RNase R proteins (100 nM), including the full-length RNase R, RNase R A131V, RNase R D280N, ΔHTH-K and ΔHTH-K A131V, were incubated with the dsRNA (2.5 nM) at 37°C for 0–60 min in a reaction buffer containing 20 mM Tris–HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl, 1 mM DTT and 0.25 mM MgCl2. The dsRNA was prepared by annealing a 5′-end 32 P-labeled 20-nucleotide RNA with a sequence of 5′-GUUGAGAGAGAGAGAGAGUUUG-3′ with a 10-nucleotide RNA with a sequence of 5′-CUCUCUCAAC-3′ to generate a 10-basepair dsRNA with a 10-nucleotide 3′ overhang. The RNA degradation reactions were stopped by adding 2× urea loading dye (Thermo) at different time points (0, 15 and 60 min) and the samples were loaded on a 20% TBE–urea denaturing gel for gel-eletctrophresis shown in Figure 1C.

For the RNA degradation experiments shown in Figure 3, the 5′-end 32 P-labeled single-stranded RNA (ssRNA_40, 2.5 nM, 5′-GCUGUCUAGAGACUAUCGAUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUU-3′) and the stem–loop RNA with a 20-nt 3′ overhang (slRNA_20, 2.5 nM, 5′-GGCCCGCGAAAGCGCGGGCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3′) were incubated respectively with RNase R proteins (100 nM) in 10 μl of a reaction buffer containing 20 mM Tris–HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl, 0.25 mM MgCl2 and 1 mM DTT at 37°C. The RNA degradation reactions were stopped by adding Novex® TBE-Urea Sample Buffer at the indicated times, 0–60 min. RNA degradation patterns were analyzed by 7.5 M urea/20% (w/v) polyacrylamide denaturing PAGE which was exposed on a FujiFilm Image plate and detected by Typhoon FLA 9000 (GE HealthCare).

RNA binding by fluorescence polarization assays

RNA binding by RNase R was determined by measuring the changes in fluorescence polarization using a Paradigm plate reader (Molecular Devices). The RNA with a sequence of 5′-Cy3-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3′, labeled at the 5′-hydroxyl group with Cyanine-3 (MD-Bio) at a 10 nM final concentration was titrated with the indicated concentrations of RNase R in binding buffer (50 mM Tris–HCl pH 7.5, 100 mM NaCl and 25 mM EDTA). Reactions were prepared at 37°C and incubated for 15 min, then read at 595 nm at an excitation of 535 nm. The RNA-binding affinities of different RNase R mutants were calculated by fitting the plot shown in Figure 4 to a one-site saturation-binding model using SigmaPlot ( 34).


Dance of the RNases: Coordinating the removal of RNA-DNA hybrids

Duas equipes de pesquisa lideradas pelos professores Brian Luke e Helle Ulrich do Instituto de Biologia Molecular decifraram como duas enzimas, RNase H2 e RNase H1, são coordenadas para remover estruturas híbridas de RNA-DNA dos cromossomos. Os híbridos de RNA-DNA são importantes para promover atividades celulares normais, como regulação de genes e reparo de DNA, mas ter muitos também é um risco de danos ao DNA e pode levar a doenças neurodegenerativas e câncer. Em seu artigo, que foi publicado hoje em Relatórios de Célula, Brian and Helle show that the enzyme RNase H2 removes RNA-DNA hybrids primarily after DNA replication. Quaisquer estruturas restantes de RNA-DNA são então removidas por RNase H1, que atua independentemente do ciclo celular.

O DNA é normalmente encontrado como uma estrutura de fita dupla estável. No entanto, às vezes o DNA também interage com o RNA para formar estruturas híbridas de RNA-DNA que regulam a expressão gênica e o reparo do DNA. R-loops são um tipo especial de híbrido de RNA-DNA no qual uma fita de RNA se liga a uma fita de uma molécula de DNA e empurra a outra fita de DNA para que seja exposta como uma fita de fita simples. R-loops podem regular a atividade do gene, mas também se tornam rapidamente perigosos porque a remoção incorreta pode danificar o DNA, podendo causar mutações. Therefore, excess R-loop formation can be toxic for cells -- indeed, mutations in R-loop removal proteins are known to contribute to neuroinflammatory diseases and cancer.

A remoção do R-loop é catalisada pelas enzimas RNase H1 e RNase H2, que degradam a fita de RNA. Além disso, a RNase H2 também tem uma capacidade secundária de excisar ribonucleotídeos únicos, que às vezes podem ser incorporados erroneamente ao DNA por polimerases em um processo conhecido como reparo por excisão de ribonucleotídeos (RER). Estudos anteriores mostraram que a mutação da RNase H2 interrompeu a estabilidade do genoma mais do que a mutação da RNase H1, sugerindo que a RNase H2 tem um papel mais importante na manutenção da estabilidade do genoma. No entanto, nunca foi totalmente compreendido como essas enzimas importantes são coordenadas.

Para dissecar os papéis distintos de RNase H1 e H2 na remoção de R-loop, o laboratório Luke projetou a levedura para expressar RNase H1 e H2 apenas durante fases específicas do ciclo celular e, em seguida, os expôs ao metanossulfonato de metila (MMS), um agente que aumenta Formação de R-loop. Apenas a levedura que pudesse remover efetivamente os laços R sobreviveria, enquanto aqueles com remoção do laço R prejudicada não sobreviveriam.

Com o apoio do laboratório Ulrich, eles descobriram que a levedura que expressa RNase H2 exclusivamente durante G2 (a 'fase de crescimento' do ciclo celular após a replicação do DNA) era resistente a MMS, enquanto a levedura que expressa RNase H2 apenas durante a fase S (a fase de replicação do DNA ) eram mais sensíveis. Isso sugeriu que RNase H2 atua principalmente para processar R-loops durante G2. Em contraste, a levedura que expressa RNase H1 na fase G2 ou S foram ambas capazes de sobreviver em MMS. Surpreendentemente, a expressão de RNase H2 na fase S induziu mais danos ao DNA, o que exigiu um tipo especial de reparo de DNA chamado recombinação homóloga para ser corrigido. Esta via não era conhecida anteriormente por atuar durante a fase S. Portanto, este estudo pode ter revelado uma via de reparo inexplorada que neutraliza os danos causados ​​pela atividade da RNase H2 durante a replicação do DNA.

Esses resultados podem explicar por que as células desenvolveram duas enzimas H RNAse diferentes. Brian Luke clarifies: "We think that RNase H2 is the 'housekeeping' enzyme that repairs the majority of RNA-DNA hybrids, but it is strictly regulated by cell cycling and acts only in G2 phase, or after DNA replication." Brian and Helle speculate this may be because the additional RER activity of RNase H2 creates nicks in the DNA, which are a risk for double-strand breaks during DNA replication in S phase. Portanto, as células também podem ter desenvolvido uma enzima secundária, a RNase H1, que não possui atividade RER e pode atuar em todas as fases do ciclo celular, incluindo a fase S.

Essas descobertas nos ajudam a entender melhor como as células reparam os danos ao DNA associados aos híbridos de RNA-DNA e como o comprometimento desse processo contribui para a doença.


A autoclavagem é suficiente para se livrar de RNAses de pontas de pipetas e tubos eppendorf?

I & # x27m obtendo consistentemente resultados negativos com extrações de RNA e suspeito de contaminação por RNAse. Nosso espaço de trabalho é muito limpo, mas agora estou preocupado com nossos tubos e pontas. A autoclavagem é suficiente para eliminar RNAse desses, ou existem métodos adicionais para mantê-los livres de RNAse?

Não. Solicite pontas de pipetas e tubos sem RNAse. Limpe tudo, incluindo suas luvas, com RNAseZap, antes de alcançar os sacos para obter tubos / pontas. RNAse zap nas pipetas também. Não respire nem mesmo nos tubos / pontas. Mantenha-os em uma área especial livre de RNAse quando não estiverem em uso. RNAse está ligado tudo. Use também água tratada com DEPC.

EDITAR - Usar filtrado dicas também. Garanto que você está pulverizando RNAse em sua amostra, se não estiver.

Compramos tubos livres de RNase / DNase e ainda os autoclave. Eles são despejados do saco grande em recipientes e autoclavados. As pontas de filtro também são livres de RNase / DNase, mas não são autoclavadas.

Usamos kits Qiagen para extrair RNA. Os únicos tubos e água usados ​​neste protocolo vêm com o kit, então você não precisa se preocupar em ter certeza de que seus próprios tubos estão livres de RNase ou DEPC tratando sua água (pelo menos não para a extração. Se você estiver fazendo experimentos downstream

A única coisa que eu RNaseZap antes de extrair o RNA é a ponta do rotor-estator que realmente vai para o tubo com o tecido dentro. Eu sei que algumas pessoas borrifam suas mesas, luvas, têm uma bancada especial de RNA, etc. Nós não temos nada disso e não temos problemas.

Esse. Trabalhou com RNA nos últimos 2 anos. Quase sempre exigia todas as pontas novas, com filtros, pipetas especiais e uma área especial apenas para o manuseio de RNA. Tudo (pipetas, bancada, fórceps, etc.) a cada 2 semanas. Adicionados inibidores de RNase a qualquer coisa que estivesse sendo armazenada por qualquer período de tempo. Água tratada com DEPC também é boa, mas como o DEPC é meio perigoso, nós a salvamos para as etapas mais importantes.

Além disso, nunca esterilize em autoclave as pontas filtradas. Assim que forem usados, jogue-os.

interessante, nosso grupo trabalha quase exclusivamente com RNA, temos pipetas separadas para RNA e outros trabalhos, mas usamos exclusivamente pontas autoclavadas (sem filtro) e tubos de microcentrífuga. Água autoclavada também nunca provou ser um problema. Obtemos grandes rendimentos de RNA intacto.

E agora eu conheço a mais nova adição à parede atrás da máquina qPCR.

Eu descobri que etanol ou fenol residual é a causa mais comum de baixos rendimentos de RNA.

Eu concordo. RNase parece ser um bicho-papão e ao longo dos anos eu gradualmente diminuí minhas precauções anti-RNase a ponto de nem pensar duas vezes ao mudar do trabalho padrão de biologia molecular relacionado ao DNA para o trabalho de RNA. Eu nunca observei qualquer tipo de degradação de amostra misteriosa. Eu uso água que sai direto de um sistema do tipo MilliQ e pontas regulares, sem pipetas especiais, etc.

Não estou mais trabalhando em um laboratório de pesquisa, mas lembro que algumas pessoas na verdade autoclavaram seu RNase para esterilizá-lo e ele ainda funcionava depois. Portanto, não acho que esse método seja útil para realmente eliminar RNases. Existem alguns produtos para descontaminar o espaço de trabalho, embora não pareça que seja problema seu.

Um de nossos pós-doutorandos alemães uma vez me disse que não, alguns RNases podem sobreviver à autoclavagem (o que me deixa boquiaberto). Eu trabalho em um laboratório de RNA e está repugnantemente sujo, mas nós apenas usamos tubos / pontas de boa qualidade e aplicamos um spray de RNase aqui e ali. Nunca tivemos problemas de contaminação.

Se você ainda estiver tendo problemas, jogue tudo fora e comece do zero.

As pessoas estão falando muito sobre as fontes externas de contaminação por RNAse, mas isso é minúsculo em comparação com as RNAses já presentes no tecido do qual você está extraindo. Como você está extraindo o RNA? existem vários métodos, meu favorito é congelar o mais rápido possível em nitrogênio líquido e moer em uma pasta fina (mantendo-se abaixo do congelamento com N líquido) e misturar a pasta com tiocianato de guanadínio / tampão de extração de fenol (ou seja, algo como TriZol).

Se você não estiver usando um método semelhante, o que seu tampão de extração contém para inibir / desnaturar os RNAses? os dois buffers que uso regularmente contêm SDS ou fenol - sendo o meu favorito fenol.

tldr: Sua maior fonte de RNAses não é você, sua bancada ou seu equipamento ao trabalhar a partir de uma fonte de RNA (a menos que você mesmo esteja transcrevendo-o, é claro). A maior fonte de RNAses é o tecido / animal do qual você está extraindo o RNA.