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Como identificar o gene GPD quando a sequência varia entre os organismos?

Como identificar o gene GPD quando a sequência varia entre os organismos?


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Estou lendo um artigo sobre a transformação genética de um fungo e o plasmídeo usado no artigo usa duas formas do mesmo promotor GPD (gliceraldeído3-fosfato desidrogenase) para conduzir um gene GFP, um de Agaricus bisporus e um de Lentinula edodes (GenBank : GQ457137.1).

No entanto, notei que as sequências para os promotores de GPD mencionados acima não correspondem à sequência de referência no GenBank (NC_007251.2), que por sua vez é derivada de outro organismo.

Por que existem sequências diferentes para o mesmo promotor? Além disso, como eu identificaria o gene GPD em outro organismo se não pudesse compará-lo com uma sequência conhecida?

O organismo que desejo transformar teve seu genoma completo sequenciado e minha transformação seria muito mais eficaz se eu pudesse usar um promotor nativo como o GPD.


Eu posso estar te entendendo mal aqui, mas deduzo de seus links acima que você deseja combinar as regiões do promotor GPD de dois fungos (relacionados distantemente) Agaricus bisporus e Lentinula edodes, para o promotor GPD de Leishmania major, que pertence a um Reino completamente diferente!

As regiões promotoras tendem a ser relativamente mal conservadas entre as espécies em comparação com as regiões codificadoras de proteínas, mesmo para espécies intimamente relacionadas. Dada a distância evolutiva entre as espécies que você está mencionando, a chance de encontrar qualquer homologia entre suas regiões promotoras é provavelmente zero.

Além disso, como eu identificaria o gene GPD em outro organismo se não pudesse compará-lo com uma sequência conhecida?

O que eu faria é pegar a sequência da proteína GPD traduzida, que para Lentinula edodes seria GenBank BAA83550.1. Eu então usaria isso para pesquisar correspondências de proteínas usando explosão, especificamente subsetting para Leishmania major; e usar o resultado para localizar o gene codificador no genoma. Você também pode fazer isso em uma única etapa com tblastn, que procura correspondências em um banco de dados de nucleotídeos traduzido (veja este exemplo de consulta tblastn).

Você pode então simplesmente pegar 1000 bp ou mais a montante da região de codificação para representar seu promotor GPD.


9: Conservação de Proteínas

  • Contribuição de Clare M. O & rsquoConnor
  • Professor Associado Emérito (Biologia) no Boston College

No final deste laboratório, os alunos deverão ser capazes de:

  • identificar aminoácidos por seu código de 1 letra.
  • explicar as diferenças entre pontuações altas e baixas na matriz BLOSUM 62.
  • use o algoritmo BLASTP para comparar sequências de proteínas.
  • identificar regiões conservadas em um alinhamento de sequência múltipla.

Conforme as espécies evoluem, suas proteínas mudam. A taxa na qual uma sequência de proteína individual muda varia amplamente, refletindo as pressões evolutivas que os organismos experimentam e o papel fisiológico da proteína. Nosso objetivo neste semestre é determinar se as proteínas envolvidas na biossíntese de Met e Cys foram funcionalmente conservadas entre S. pombe eS. cerevisiae, espécies que estão separadas por quase um bilhão de anos de evolução. Neste laboratório, você pesquisará bancos de dados de homólogos de S. cerevisiae sequências em várias espécies, incluindo S. pombe. Homólogos são sequências de DNA semelhantes que descendem de um gene comum. Quando homólogos são encontrados em espécies diferentes, eles são referidos como ortólogos.

Homólogos dentro do mesmo genoma são chamados de parálogos. Paralogs surgem por duplicação de genes, mas se diversificam ao longo do tempo e assumem funções distintas. Embora toda uma duplicação do genoma tenha ocorrido durante a evolução de S. cerevisiae (Kellis et al., 2004), apenas alguns genes no supercurso da metionina têm parálogos. Interessantemente, MET17 é semelhante a três genes envolvidos na transferência de enxofre: STR1 (CYS3), STR2 e STR4, refletindo múltiplas duplicações de genes. A presença dessas quatro enzimas distintas confere flexibilidade incomum para S. cerevisiae no uso de fontes de enxofre. o SAM1 e SAM2 os genes também são parálogos, mas suas sequências permaneceram quase idênticas, fornecendo redundância funcional se um gene for inativado (Capítulo 6).

Nossos experimentos neste semestre irão testar se os genes envolvidos na síntese de Met e Cys foram funcionalmente conservados durante a divergência evolutiva de S. cerevisiae e S. pombe . Uma variedade de algoritmos oferece aos pesquisadores ferramentas para estudar a evolução das sequências de proteínas. Nesta representação gráfica de sequências Sam2p alinhadas de nove organismos modelo divergentes, a altura da letra reflete a frequência de um determinado aminoácido naquela posição.

A função da proteína está intimamente relacionada à sua estrutura. Você deve se lembrar que a forma dobrada final de uma proteína é determinada por sua sequência primária, a sequência de aminoácidos. A funcionalidade da proteína muda menos rapidamente durante a evolução quando as substituições de aminoácidos são conservativas. As substituições conservativas ocorrem quando o tamanho e a química de uma nova cadeia lateral de aminoácido é semelhante àquela que está substituindo. Neste laboratório, começaremos com uma discussão sobre as cadeias laterais de aminoácidos. Em seguida, você usará o algoritmo BLASTP para identificar ortólogos em vários organismos modelo. Você executará um alinhamento de sequência múltipla que distinguirá regiões que são mais conservadas do que outras.

Conforme você trabalha nos exercícios, notará que as sequências de proteínas nos bancos de dados são escritas no código de uma letra. A familiaridade com o código de uma letra é uma habilidade essencial para os biólogos moleculares de hoje.


Fundo

Agrupadas repetições palindrômicas curtas regularmente espaçadas (CRISPRs) são estruturas repetitivas em Bacteria e Archaea compostas de sequências de repetição exatas de 24 a 48 bases de comprimento (aqui chamadas de repetições) separadas por espaçadores únicos de comprimento semelhante (aqui chamados de espaçadores) [1, 2]. As sequências CRISPR parecem estar entre os elementos de evolução mais rápida no genoma, a ponto de espécies e cepas intimamente relacionadas, às vezes mais de 99% idênticas no nível de DNA, diferirem em sua composição CRISPR [3, 4].

Até 45 famílias de genes, chamadas sequências associadas a CRISPR (CASs), aparecem em conjunto com essas repetições e são hipotetizadas como responsáveis ​​pela propagação e funcionamento de CRISPR [2, 5, 6]. Tem sido proposto que os CASs podem ser divididos em sete ou oito subtipos, de acordo com a organização do operon e a filogenia do gene [5, 6]. A análise filogenética indica adicionalmente que os CASs foram submetidos a uma extensa transferência horizontal de genes, já que genes CAS muito semelhantes são encontrados em organismos distantemente relacionados [6, 7]. CRISPRs e CASs foram encontrados em elementos genéticos móveis, como plasmídeos, pele elementos móveis, e mesmo profagos, sugerindo um possível mecanismo de distribuição para o sistema [7–9].

Foi sugerido que os CRISPRs desempenham papéis na partição do replicon [1], reparo do DNA [10], regulação [5] e rearranjo cromossômico [11]. Foi relatado recentemente que os espaçadores são frequentemente muito semelhantes a fragmentos de DNA extracromossômico, como fago ou DNA de plasmídeo [3, 12]. Foi sugerido que o sistema CRISPR / CAS participa de uma resposta antiviral, provavelmente por um mecanismo semelhante a interferência de RNA. O mecanismo proposto para esta função CRISPR envolve a amostragem e manutenção de um registro dos elementos invasivos do DNA e a inibição das funções do gene necessárias para a invasão [12]. De fato, foi recentemente demonstrado que os CRISPRs fornecem resistência adquirida contra vírus em procariotos [13].

Apesar das análises aprofundadas dos CASs, a natureza das sequências de repetição não foi examinada de perto. Presumivelmente, isso ocorre porque as repetições, como sequências curtas de DNA, têm menos potencial comparativo do que os genes codificadores de proteínas. Estudos anteriores observaram apenas que as repetições são altamente variáveis ​​e não parecem ser semelhantes entre os organismos [2, 7]. No entanto, mostramos que repetições de diversos organismos podem ser agrupadas em grupos com base na similaridade de sequência, e que alguns grupos têm estruturas secundárias pronunciadas com mudanças de base compensatórias. Mostramos ainda que há uma correspondência clara entre subtipos CAS e clusters de repetição. Nossos resultados têm implicações importantes para a função e diversidade CRISPR.


Considerações Especiais

Anotação de vários conjuntos

Quando vários conjuntos de boa qualidade estão disponíveis para um determinado organismo, a anotação de todos é feita em coordenação. Para garantir que as regiões correspondentes nas montagens sejam anotadas da mesma maneira, as montagens são alinhadas entre si antes da anotação.

  • Os resultados do alinhamento montagem-montagem são usados ​​para classificar a transcrição e os alinhamentos genômicos selecionados: para uma determinada sequência de consulta, os alinhamentos às regiões correspondentes de duas montagens recebem a mesma classificação.
  • Os loci correspondentes de vários conjuntos são atribuídos ao mesmo GeneID e tipo de locus.

Os alinhamentos montagem-montagem estão disponíveis através do NCBI Genome Remapping Service.

Re-anotação

Os organismos são re-anotados periodicamente quando novas evidências estão disponíveis (por exemplo, RNA-Seq) ou quando um novo conjunto é liberado. Atenção especial é dada ao rastreamento de modelos e genes de uma versão da anotação para a próxima. Os modelos anteriores e atuais anotados em localizações genômicas sobrepostas são identificados e o tipo de locus e GeneID dos modelos anteriores são levados em consideração ao atribuir GeneIDs aos novos modelos. Se a montagem foi atualizada entre as duas rodadas de anotação, as montagens são alinhadas entre si e os alinhamentos usados ​​para corresponder aos modelos anteriores e atuais nas regiões mapeadas.


Resultados

Fluxo de trabalho bioinformático para a caracterização molecular de eventos de arroz GM

Muitos pesquisadores têm dificuldade em lidar com grandes quantidades de dados bioinformáticos. Desenvolvemos um método amigável para detectar junções de T-DNA inseridas usando dados NGS no lugar de métodos de detecção convencionais. Um diagrama do fluxo de trabalho bioinformático é mostrado na Fig. 1. Na primeira etapa, leituras de extremidades pareadas brutas qualificadas foram alinhadas contra um vetor de plasmídeo de transformação usando o software Aligner Burrows-Wheeler com correspondências exatas máximas (BWA-MEM) [22] . Como a estrutura do vetor do plasmídeo de transformação é circular, fizemos uma sequência de referência do vetor linearizada (pPZP200), onde as sequências das bordas esquerda e direita continham 150 pb da extremidade oposta da sequência do plasmídeo. Para selecionar essas leituras abrangendo junções, leituras mapeadas foram subtraídas de acordo com suas posições mapeadas, com base na localização do T-DNA (de 6392 a 10,291 bp). Essas leituras coletadas foram usadas como consultas para análise BLASTN para classificar leituras falso-positivas contra um genoma de arroz de referência (O. sativa versão 7.0) [23]. Como o T-DNA inserido é projetado para conter elementos endógenos, lê-se que continha a sequência do promotor endógeno RbcS3 foram cuidadosamente removidos com base na pontuação de similaridade de sequência (para a sequência de arroz nativa) para reduzir o alinhamento ambíguo. As leituras restantes foram alinhadas contra o vetor transgênico e visualizadas usando IGV com leituras emparelhadas. A partir dos resultados, selecionamos leituras de junção que correspondiam parcialmente a ambas as extremidades do T-DNA (ou seja, leituras que abrangiam tanto o T-DNA quanto o genoma do arroz) e extraímos sequências FASTA para identificar o T-DNA inserido na região de junção do genoma (Fig. 1).

Localização do T-DNA e número da cópia

Aproximadamente 28 GB de dados de sequência bruta, correspondendo a 72 × profundidade de sequenciamento, foram obtidos a partir do cultivo parental de controle “Illmi”. Além disso, 30 GB, 21 GB e 26 GB de dados brutos foram obtidos de SNU-Bt9–5, SNU-Bt9–30 e SNU-Bt9–109, respectivamente, representando aproximadamente 78 ×, 54 × e 68 × cobertura do genoma, respectivamente (Tabela 1).

A partir das etapas consecutivas aplicadas em nossa análise de detecção de junção (conforme descrito na seção 'análise do local de inserção do T-DNA' dos Métodos), 11.539 leituras foram obtidas do arroz GM SNU-Bt9-5, incluindo 2.790 leituras emparelhadas mapeadas. Além disso, 8371 e 9767 leituras foram mapeadas do arroz GM SNU-Bt9–30 e SNU-Bt9–109, respectivamente, incluindo 1792 e 2336 pares adequados de leituras, respectivamente (Tabela 2). Inesperadamente, 8125 leituras derivadas de "Illmi" de tipo selvagem foram mapeadas para as sequências de vetores transgênicos, incluindo apenas 648 pares de leituras adequados. As leituras pareadas restantes não pareadas foram consideradas devido a um recurso de sequências Illumina que pode ser causado pelo comprimento de sequência curta. Também digno de nota é que nossa construção de T-DNA usada neste estudo foi projetada para conter o gene promotor endógeno do arroz rbcS3 (Os12g0291100), que ocupa 1824 pb de T-DNA e é expresso no cromossomo 12 do arroz [24]. Para eliminar leituras falso-positivas enganosas originadas do genoma nativo (isto é, não do T-DNA), cada sequência mapeada foi comparada com a sequência de referência de arroz usando BLASTN. Um total de 915, 1019, 729 e 899 leituras correspondentes a arroz Illmi, SNU-Bt9–5, SNU-Bt9–30 e SNU-Bt9–109, respectivamente, todos alinhados ao cromossomo 12 e foram classificados como falsos positivos.

As leituras parcialmente alinhadas com ambas as extremidades da região de fronteira do transgene foram coletadas (Fig. 2a eb) com base em sua posição de mapeamento. Em seguida, as leituras selecionadas foram alinhadas a toda a sequência do T-DNA para identificar o sítio de flanco. Os resultados representaram junções de inserção em cromossomos de arroz (Fig. 2c). Leituras abrangendo regiões de junção entre o genoma do hospedeiro e o transgene obtido do arroz SNU-Bt9–5 mapeado perfeitamente para o cromossomo 10 do arroz de 22.498.218 a 22.498.279 pb com deleções de 79 pb. O evento de arroz SNU-Bt9-30 foi devidamente mapeado para o cromossomo 11 do arroz de 22.473.585 a 22.473.636 bp com deleções de 51 bp (Tabela 3 e Fig. 3). Ambos os eventos transgênicos detectaram com sucesso uma única cópia e um único locus dentro do genoma do arroz, e ambos os resultados foram idênticos aos obtidos pelo método de detecção baseado em Southern blot [21].

Caracterização molecular de arroz transgênico usando alinhamentos de leitura NGS. uma Ilustração do plasmídeo de transformação pPZP200 contendo T-DNA usado para Agrobacterium- transformação mediada para criar SNU-Bt9–5, SNU-Bt9–30 e SNU-Bt9–109. MCS, site de clonagem múltipla. b Exemplo detalhado de resultados IGV. As linhas horizontais na trilha da sequência (parte superior do painel) indicam a sequência de referência (ou seja, a sequência do vetor de plasmídeo de transformação inserida em T-DNA). As trilhas apresentadas exibem uma orientação emparelhada (painel superior = leitura 1, painel inferior = leitura 2). As caixas coloridas indicam a região de junção contendo leituras que abrangem a borda do T-DNA e a sequência de flanqueamento genômico. c Alinhamentos de sequência de leituras de abrangência de junção (superior = sequências de flanqueamento da borda esquerda, inferior = sequências de flanqueamento da borda direita). Nucleotídeos vermelho e preto indicam cromossomo de arroz e T-DNA, respectivamente

Representação de loci deduzidos de uma inserção de T-DNA em um cromossomo de arroz

Embora os locais de integração do arroz SNU-Bt9–109 não tenham sido identificados usando o método descrito aqui (Tabela 3 e Fig. 3), o local de integração próximo à borda direita (RB) foi encontrado no cromossomo 3 de 14.707.459 a 14.707.391 bp. As sequências de flanqueamento perto da região da borda esquerda (LB) não foram identificadas. A análise BLASTN (usando o banco de dados NCBI nr) mostrou que a junção entre a região LB e o genoma do hospedeiro mostrou alta similaridade com o "vetor de captura de genes Ds / T-DNA pDsG8 (valor e: 4e-28)" e o Solanum tuberosum gene inibidor de proteinase (valor e: 6e-28). No entanto, o S. tuberosum gene foi considerado um artefato devido à sua consulta curta e baixa especificidade.

Para validar os resultados acima, projetamos primers com base nas leituras de sequência de junção obtidas (Arquivo adicional 1: Tabela S1). Nossos resultados de PCR verificaram que a detecção de inserção dos dois eventos de arroz transgênico foi caracterizada com sucesso usando NGS. Além disso, a sequência de junção de SNU-Bt-109 também foi detectada por flanqueamento de PCR usando sequências LB próximas (arquivo adicional 1: Figura S2).

Determinando o rearranjo de T-DNA

Para determinar a sequência de T-DNA, calculamos as distribuições de tamanho de inserção usando leituras de pares mapeados contra o DNA do plasmídeo transgênico (arquivo adicional 1: Figura S3). Ao calcular o tamanho da inserção, é possível decidir se o DNA inserido foi reorganizado. Os tamanhos médios dos insertos foram 479, 469 e 535 bp para SNU-Bt9–5, SNU-Bt9–30 e SNU-Bt9–109, respectivamente, que correspondiam adequadamente aos tamanhos preparados na construção da biblioteca (Arquivo adicional 1: Figura S4 ) Ele assumiu que não havia rearranjos internos ou duplicações dentro do T-DNA. Os resultados correspondem aos da recuperação do T-DNA total por PCR de DNA genômico e análise de sequenciamento em nosso artigo anterior [21].

Possível presença de sequências de base em plantas transgênicas

Mudanças genômicas não intencionais podem ocorrer durante o desenvolvimento de novas plantas GM. É possível que as sequências do esqueleto do plasmídeo sejam integradas ao genoma de um hospedeiro durante Agrobacterium-transformação mediada [10]. Portanto, os alinhamentos de sequência foram visualizados com IGV para detectar possível contaminação das estruturas do plasmídeo. Nenhuma leitura foi mapeada para a estrutura do esqueleto do plasmídeo (arquivo adicional 1: Figura S5 e S6). Este achado demonstra que as sequências derivadas da estrutura principal não foram introduzidas nesses genomas transgênicos.


Usando o genoma canário para decifrar a evolução da regulação gênica sensível a hormônios em pássaros cantores sazonais

Fundo: Embora o canto de todos os pássaros canoros seja controlado pelo mesmo circuito neural, a dependência hormonal do comportamento do canto varia muito entre as espécies. Por essa razão, os pássaros canoros são organismos ideais para estudar os mecanismos finais e imediatos do comportamento dependente de hormônio e da plasticidade neuronal.

Resultados: Apresentamos a montagem e anotação de alta qualidade de um genoma canário feminino de 1,2 Gbp. Os alinhamentos do genoma inteiro entre o canário e os 13 genomas ao longo dos taxa de pássaros mostram uma sintaxe muito conservada, enquanto na resolução de base única há diferenças consideráveis ​​entre as espécies. Essas diferenças afetam motivos de sequência pequena, como locais de ligação de fatores de transcrição, como elementos de resposta de estrogênio e elementos de resposta de androgênio. Para relacionar esses elementos de resposta específicos da espécie à sensibilidade ao hormônio do comportamento do canto canário, identificamos os transcriptomas sensíveis à testosterona sazonais das principais regiões cerebrais relacionadas ao canto, HVC e RA, e encontramos as redes de genes sazonais relacionadas à diferenciação neuronal apenas em o HVC. Redes de genes regulados para cima e sensíveis à testosterona de HVC de cantores masculinos preocupam-se com a diferenciação neuronal. Entre os genes regulados por testosterona de HVC canário, 20% carecem de elementos de resposta de estrogênio e 4 a 8% carecem de elementos de resposta de androgênio em promotores ortólogos no tentilhão zebra.

Conclusões: A sequência do genoma canário e a análise de expressão complementar revelam mudanças evolutivas intra-regionais em um circuito neural multirregional que controla o comportamento do canto sazonal e identifica a evolução do gene relacionada à sensibilidade hormonal desse comportamento do canto sazonal. Esses genes que são sensíveis à testosterona e ao estrogênio especificamente no canário e que estão envolvidos na reconfiguração dos neurônios podem ser cruciais para a rediferenciação sazonal do HVC subjacente ao padrão musical sazonal.


Sorologia: Visão Geral

Outros fluidos corporais

O perfil de DNA foi realizado com sucesso em uma ampla gama de fluidos e tecidos corporais para os quais não existem testes comuns. Exemplos incluem pele (incluindo caspa), transpiração, muco nasal, pus, leite materno e cera de ouvido. Na maioria das vezes, a origem biológica nesses casos é inferida a partir da aparência do material ou de sua localização no item testado, por exemplo, transpiração de bandas de chapéu, muco nasal em tecidos e assim por diante. Há pouca necessidade de testes específicos para determinar a identidade celular desses materiais, no entanto, cada um tem uma bioquímica característica que pode ser explorada para desenvolver um teste de identificação, caso seja necessário.


Resultados e discussão

Escolhemos o 5 ′ -UTR do bem estudado S. cerevisiae CYC1 promotor [15, 16]. Nós fundimos pCYC1min (começando na posição −143) a uma proteína fluorescente verde intensificada por levedura (yEGFP) [17] e o CYC1 o Exterminador do Futuro. Comparado com o completo CYC1 promotor, pCYC1min contém duas das três caixas TATA e nenhuma sequência de ativação a montante. pCYC1min é um promotor moderadamente fraco e, por esta razão, parece ser um candidato ideal para detectar efeitos positivos e negativos de mutações pontuais na sequência líder na expressão da proteína repórter a jusante. o CYC1 o promotor 5 '-UTR tem 71 nucleotídeos de comprimento.

Na análise a seguir, nos referimos à parte de CYC1 5 ′ -UTR na posição −1 a −8 como o sequência Kozak estendida e que em -9 a -15 como o região a montante. Na sequência de Kozak estendida, a adenina é fortemente conservada em cinco posições, enquanto na região a montante nenhum nucleotídeo é fortemente conservado. No entanto, a adenina é a mais frequente em quase todos os locais (ver Antecedentes).

A sequência estendida de Kozak

O original CYC1 sequência das posições −15 a −1 é CACACTAAATTAATA (doravante referido como k 0) De acordo com Dvir et al. [9], a presença de uma adenina nas posições −1, −3 e −4, junto com a ausência de guanina na posição −2, deve tornar esta sequência líder quase ideal para alta expressão. No entanto, a timina na posição −2 e a citosina na posição −13 têm uma frequência inferior a 20 % e 10 %, respectivamente, entre os altamente expressos S. cerevisiae genes [8]. Nós construímos nosso primeiro sintético CYC1 sequência líder (k 1), colocando uma adenina em cada posição de -1 a 15.

O nível de fluorescência associado a k 1 era 6,5 % maior do que o medido com k 0. No entanto, nenhuma diferença estatisticamente significativa surgiu dos dados coletados nessas duas sequências líderes (p-valor = 0,13). Mantivemos k 1 (a sequência líder otimizada) como um modelo para nossos próximos construtos sintéticos e construiu mais 57 5 ′ -UTRs sintéticos por mutação de nucleotídeos únicos ou múltiplos em k 1.

O primeiro grupo de sequências líderes sintéticas foi feito por uma única mutação pontual da posição -1 para a posição 8 (consulte a Tabela 1). Portanto, modificamos a sequência Kozak estendida apenas, enquanto a região a montante foi mantida em uma configuração otimizada para alta expressão gênica com adeninas nas posições -9 a -15.

A maior fluorescência foi registrada para k 16 (onde uma guanina substituiu a adenina na posição −5) e a mais baixa por k 9 (onde uma timina substituiu a adenina na posição -3). Além disso, o nível de fluorescência de k 16 foi estatisticamente significativamente diferente daquele de k 0 e k 1. Um aumento na fluorescência devido a uma guanina na posição −5 foi um resultado surpreendente porque a guanina é o nucleotídeo menos frequente na levedura S. cerevisiae sequências de líderes. Além disso, nenhuma guanina jamais foi detectada nesta posição entre os genes altamente expressos [8] ou provocou qualquer aumento de fluorescência no trabalho de Dvir et al. [9].

Apesar da ausência de uma diferença estatisticamente significativa de k 1, as únicas construções além de k 16 que resultou em um aumento de & gt5 % no nível de fluorescência de k 1 estavam k 3, k 10, e k 24. Em particular, em k 3, uma timina substituiu uma adenina na posição -1, e em k 10 a adenina na posição -3 foi transformada em guanina. Conforme relatado acima, a adenina nas posições −1 e −3 deve garantir alta expressão gênica. No entanto, em tal fundo de adenina, nucleotídeos menos frequentes nas posições -1 ou -3 parecem ser necessários para aumentar ainda mais a expressão gênica. Em contraste, uma timina em vez de uma adenina na posição −3 (k 9) foi a única mutação que induziu um & gt5 % redução k 1 nível de fluorescência. Este resultado é consistente com a observação em [9] que uma timina na posição -3 é abundante em genes mal expressos (Fig. 1a).

Efeito de mutações pontuais na sequência de Kozak estendida na expressão de fluorescência. Os níveis de fluorescência são plotados em relação a k 1 (uma) e k 0 (b) O controle corresponde a uma cepa de levedura sem o gene yEGFP. O nucleotídeo que substituiu uma adenina em k 1 e a posição em que a mutação ocorreu são dados abaixo do nome de cada sequência líder sintética. Asteriscos, p-valor & lt0,05 vs. k 1 (uma) ou k 0 (b)

Em relação a k 0, todas as 25 novas sequências líderes sintéticas continham entre seis e oito mutações. Além de k 9, todos os 5 ′ -UTRs sintéticos mostraram um nível de fluorescência superior ao de k 0, cinco dos quais foram significativamente maiores. Isso incluiu as posições −1, −4 e −5. Como já observado na comparação com k 1, uma adenina logo a montante do códon START parecia não ter nenhuma vantagem particular para a expressão gênica. Aqui, uma citosina e uma timina (k 2 e k 3, respectivamente) teve um desempenho muito melhor do que uma adenina. No entanto, com respeito a k 0, havia mais sete mutações pontuais rio acima. Na posição −4, uma timina (k 12) resultou no maior incremento de fluorescência, enquanto na posição −5, ambas uma citosina (k 14) e uma guanina (k 16) fluorescência aprimorada para & gt10 % acima de k 0. Desde a k 0 tem uma timina nas posições −2, −5 e −6, cada um dos cinco 5 ′ -UTRs sintéticos que mostraram diferenças estatisticamente significativas de k 0 foram afetados por uma mutação pontual em dois ou mais locais adjacentes. Mais três sequências líderes sintéticas (k 10,k 17, e k 24) causou um & gt10 % aumento na fluorescência em comparação com k 0, embora essas diferenças não fossem significativas (p-valor & gt0.05). k 10 e k 17 também tinha mutações de ponto duplo em locais adjacentes (Fig. 1 b).

Múltiplas mutações para guanina

A análise de nossas primeiras 25 sequências 5 ′ -UTR sintéticas deu o resultado surpreendente de que uma única mutação de ponto para guanina - que está essencialmente ausente da sequência de Kozak estendida de altamente expressa S. cerevisiae genes - podem aumentar o nível de fluorescência de k 1, uma sequência líder otimizada para expressão gênica. Além disso, cinco de nossos 5 ′ -UTRs sintéticos inequivocamente (& gt9 %) aumentou o nível de fluorescência associado a pCYC1min.

De acordo com nossos dados, uma única mutação na guanina pode aumentar a expressão gênica. No entanto, dois artigos anteriores [18, 19] relataram que várias guaninas colocadas na frente de um códon START reduziriam consideravelmente a síntese de proteínas. Portanto, avaliamos como múltiplas mutações pontuais para guanina afetaram a eficiência de tradução de pCYC1min, para determinar se eles poderiam ser usados ​​para modular a expressão gênica.

De acordo com [8], entre os altamente expressos S. cerevisiae genes, a guanina é o nucleotídeo menos frequente entre as posições -1 e 15, com exceção da posição -7, em que o nucleotídeo menos frequente é a citosina. Construímos um 5 ′ -UTR sintético que reflete esta sequência (k 26 Mesa 2). Este desligou a expressão do gene, conforme mostrado pelo nível de fluorescência correspondente, não sendo significativamente diferente (p-valor = 0,21) do nosso controle negativo (um S. cerevisiae cepa que não continha o gene yEGFP).

Testamos se múltiplas mutações na guanina (citosina na posição −7) afetariam a expressão do gene de uma maneira diferente quando cobrissem toda a sequência estendida de Kozak (k 27) ou a região a montante (k 28) Uma vez que as mutações foram feitas em relação a k 1, todos os locais não mutados continham uma adenina. Surpreendentemente, descobrimos que as duas configurações eram equivalentes para a expressão do gene (p-valor & gt0,40) e reduzido k 1 nível de fluorescência por cerca de metade.

Começando de k 27, substituímos a guanina nas posições -1 (k 29), −2 (k 30), e −3 (k 31) com uma adenina para determinar se uma única adenina nas três posições imediatamente a montante do códon START aumentaria a expressão de fluorescência quando os outros locais da sequência de Kozak estendida fossem ocupados por uma guanina ou uma citosina. Na posição -1, uma adenina não mostrou melhora na fluorescência de k 27. Curiosamente, nas posições -2 e -3, uma adenina causou uma queda na expressão do gene para aproximadamente 7 % do k 1 nível de fluorescência. Estes resultados demonstram que uma adenina per se não pode melhorar a expressão do gene mesmo quando ocupa a posição -3 ou -1. De forma mais geral, podemos concluir que o efeito na expressão gênica de uma única mutação pontual na sequência líder é fortemente dependente do contexto.

Finalmente, para entender melhor a importância da região a montante para a expressão do gene, reduzimos progressivamente o número de guaninas de sete (k 28) para um (k 38) Começando da posição -9, substituímos uma guanina por uma adenina em cada etapa e vimos que o nível de fluorescência aumentou quase linearmente com o número de adeninas (Fig. 2 e Arquivo adicional 1). A última sequência em que o nível de fluorescência foi estatisticamente significativamente diferente daquele de k 1 era k 36, em que guaninas estiveram presentes nas posições −13 a −15. Uma guanina sozinha na posição −15 ou acompanhada por outra na posição −14 não resultou em uma diferença significativa no nível de fluorescência daquele de k 1. Portanto, mesmo na presença de uma sequência Kozak estendida otimizada para alta expressão gênica, múltiplas mutações na região a montante têm repercussões evidentes na síntese de proteínas e podem ser usadas como um meio de ajustar a abundância de proteínas. Uma explicação para esse resultado é apresentada na seção Análise Computacional, a seguir. Curiosamente, quatro guaninas misturadas com adeninas (k 33) na região a montante reduzido k 1 fluorescência em menor extensão do que quatro guaninas em uma fileira (k 32), fornecendo confirmação adicional de que o efeito na expressão gênica de mutações pontuais dentro do 5 '-UTR é altamente dependente do contexto nucleotídico (Fig. 2, consulte o arquivo adicional 1 para uma comparação com k 0 fluorescência).

Múltiplas mutações pontuais para guanina. A razão entre o nível de fluorescência dos 5 ′ -UTRs sintéticos de k 26 para k 38 e aquele de k 1 são relatados. O número de adeninas ou guaninas na região a montante é dado abaixo do nome da sequência líder (de k 27 para k 38) Os subscritos −1, −2 e −3 indicam que uma adenina está presente na sequência de Kozak estendida apenas na posição correspondente. Subscrito eu representa misturado (veja o texto principal). Asteriscos, p-valor & lt0,05 vs. k 1

A região upstream

A análise anterior confirmou que o efeito na expressão gênica devido a mutações únicas e múltiplas dentro do 5 '-UTR é fortemente dependente do contexto. Além disso, nossos dados mostraram claramente que as mudanças não apenas na sequência Kozak, mas também dentro da região a montante afetam marcadamente a expressão do gene. Portanto, realizamos mutações pontuais em k 1 entre as posições −9 e −15 (Tabela 3) para avaliar se um único nucleotídeo diferente da adenina pode alterar a taxa de tradução quando colocado na região a montante.

Todas as mutações pontuais (exceto aquela em k 38) resultou em um nível de fluorescência superior ao associado com k 1. Notavelmente, em oito casos, o aumento na fluorescência foi estatisticamente significativo (& gt10 % mais alto que k 1 fluorescência). Essas oito mutações incluíram quatro posições contíguas, de -11 a -14. Nada disso foi levado em consideração no trabalho de referência de Dvir et al. [9].

Na posição −11, uma guanina em vez de uma adenina (k 47) expressão de fluorescência aumentada por & gt15 %, enquanto a citosina e a timina não tiveram efeitos significativos. Cada mutação na posição −12 aumentou a fluorescência de k 1. A maior mudança (& gt15 %) foi devido a uma guanina (k 50) Mutações na posição −13 também aumentaram fortemente k 1 nível de fluorescência. Mutações de dois pontos - citosina (k 51) e guanina (k 53) - resultou em diferenças estatisticamente significativas na fluorescência de k 1, enquanto uma timina (k 52) aumentado k 1 fluorescência por cerca de 14 % mas isso não atingiu significância estatística. Deve-se notar que, entre todos os nossos 58 5 ′ -UTRs sintéticos, k 51 teve o nível de fluorescência mais alto - quase 17 % mais alto que o de k 1.

Finalmente, duas mutações pontuais diferentes na posição -14 levaram a um aumento na fluorescência: uma citosina (k 54) e uma timina (k 55) (Fig. 3, consulte o arquivo adicional 1 para uma comparação com k 0).

Efeito de mutações pontuais na região a montante na fluorescência em relação a k 1. The nucleotide that replaced an adenine in k 1 and the position at which the mutation took place are given below the name of each synthetic leader sequence. Asterisks, p-value <0.05 vs. k 1

Together, the results of this last analysis of the upstream region underline another surprising result: single point mutations upstream of the Kozak sequence, in particular at positions −12 and −13, were those that most enhanced gene expression from a context rich in adenines.

Computational analysis

We carried out simulations with RNAfold to investigate possible correlations between computed mRNA secondary structures, together with their corresponding minimum free energies (MFEs), and measured fluorescence levels. Our analysis provides an explanation for the drop in fluorescence due to multiple mutations from adenine to guanine (and cytosine) in the −15…−1 region. In contrast, no plausible justification for the effects of single point mutations on translational efficiency emerged from simulations with RNAfold.

As an input for RNAfold, we used mRNA sequences starting at the transcription start site of pCYC1min [16] and ending at the poly-A site of the CYC1 terminator [20]. Each sequence was 937 nucleotides long. From preliminary simulations, we observed that a poly-A chain with a variable length of 150–200 nucleotides had no significant effect on mRNA folding. All mRNA secondary structures were calculated at 30 °C (the temperature at which we grew S. cerevisiae cells for the FACS experiments).

k 0 e k 1 have the same MFE: −241.21 kcal/mol. This is the highest—and the most common—within the collection of 59 sequences analyzed in this work (see Additional file 1). The mRNA secondary structure corresponding to this MFE is characterized by the presence of a giant hairpin between positions −40 and +10. The hairpin loop goes from position −31 to position +1 and contains the whole 5 ′ -UTR portion we have targeted here. The hairpin stem is made of nine base-pairs, of which only one gave a “mismatch” because of an adenine at position −38 and +8 (see Fig. 4 a).

mRNA secondary structures. uma UMA giant hairpin is present in the mRNA secondary structure corresponding to the MFE of both k 0 e k 1. The hairpin loop contains the −15…−1 region. The portion of the 5 ′ -UTR in our analysis is free from any pairing interactions in its wild-type configuration (k 0) and in that theoretically optimized for high protein expression (k 1) The loop of the giant hairpin is reduced in k 4 owing to the base-pairing interaction between the guanine at position −1 and the cytosine at position −31. In every mRNA structure presented, a green arrow indicates position +1, and a red arrow indicates position −15. b The disruption of the giant hairpin induces a decrease in the MFE of the mRNA secondary structure. k 26 e k 31 are associated with the lowest MFEs computed in our analysis. The two sequences contain multiple guanines in the extended Kozak sequence involved in pairing interactions with the CDS. A similar pattern is also present in k 30. Here, however, a second mini-loop around the START codon provokes an increase in MFE. The MFE of k 26 is substantially lower than those of k 30 e k 31 because of the presence of another stem due to pairing interactions between the upstream region and the CYC1 o Exterminador do Futuro. Nevertheless, the fluorescence levels of k 30 e k 31 are only approximately 1.2-fold higher than that of k 26

Multiple mutations to guanines either in the upstream region or the extended Kozak sequence originate base-pairing interactions between, at least, a portion of the −15…−1 region and the CDS (yEGFP) or the CYC1 o Exterminador do Futuro. As a consequence, the giant hairpin is destroyed and replaced by one or two stems that lower the MFE of the mRNA secondary structure (Table 2). Most of the MFE values smaller than −241.21 kcal/mol were associated with fluorescence levels lower than that of k 1 (Fig. 5). This result is in agreement with the notion, supported also by [8, 9], that stable mRNA secondary structures in the 5 ′ -UTR reduce protein expression. However, the fluorescence levels we measured did not increase proportionally to increments in the MFE. Moreover, in two cases (k 32 e k 36) RNAfold predicted a giant hairpin in the mRNA structure, whereas the fluorescence levels from our experiments were significantly lower than that of k 1 (Fig. 5 and Additional file 1).

Low MFE values are associated with reduced fluorescence expression. Red bars, difference between MFEs of the corresponding 5 ′ -UTR and k 1 (ΔMFE). Blue bars, 10-fold magnified ratio between the fluorescence level of the indicated 5 ′ -UTR and that of k 1. Além de k 1, sequences are sorted by increasing ΔMFE. All sequences except k 4 contain multiple point mutations with respect to k 1. Asterisks above blue bars, p-value <0.05 vs. k 1

k 26 was designed by choosing the least frequent nucleotides between positions −15 and −1 among a set of highly expressed S. cerevisiae genes. The corresponding MFE (−261.39 kcal/mol) was the lowest within the ensemble of transcription units considered in this work. No giant hairpin was present in the MFE mRNA secondary structure as the −15…−1 region was sequestered into two different stems. The guanines between positions −1 and −6 were part of a long stem and paired with a hexamer at the beginning of the yEGFP sequence (positions +33 to +38). In contrast, positions −9 to −15 paired with a region of the CYC1 terminator, at positions +750 to +758 (Fig. 4 b).

A fluorescence level just above that of k 26 was registered for k 30 e k 31. Both differed from k 26 for the upstream region (made of seven adenines) and the presence of an adenine in the extended Kozak region (at positions −2 and −3, respectively). similarmente a k 26, the first five nucleotides of the extended Kozak region of k 30 and the first six of k 31 were sequestered into a stem with the CDS. However, differently from k 26, the upstream regions of k 30 e k 31 were entirely free from any pairing interactions (see Fig. 4 b). Their MFEs (−244.28 and −247.26 kcal/mol, respectively) were also significantly higher than that of k 26. These three sequences suggest that a condition for markedly lowering protein expression is to enclose the nucleotides at positions −1 to −5 in an mRNA secondary structure. Moreover, not all of these nucleotides have to participate in base-pairing interactions. Indeed, a guanine at position −1 (k 30) or −2 (k 26 e k 31) is “free” and responsible for the presence of a mini-loop in the mRNA structure.

However, this hypothesis is contradicted by k 29. The MFE of this sequence (−245.97 kcal/mol) is comparable to that of k 30 e k 31, and the corresponding mRNA secondary structure is very similar to that of k 31 (Fig. 6 a). Nevertheless, the fluorescence level associated with k 29 was more than 6-fold higher than that of k 31 and amounted to 45% of that of k 1.

mRNA secondary structures. uma k 27 é diferente de k 29 only by a guanine instead of an adenine at position −1. However, their mRNA secondary structures are dissimilar. No k 27, the extended Kozak sequence is involved in base-pairing interactions with the CYC1 terminator, whereas in k 29 the extended Kozak sequence is locked into a stem with the CDS. The MFE associated with k 27 is lower than that of k 29, but there is no difference between the fluorescence levels of the two sequences (p-value =0.20). b Multiple guanines in the upstream region give rise to mRNA structures characterized by base-pairing interactions between the 5 ′ -UTR and the CYC1 o Exterminador do Futuro. k 28 e k 34 have six guanines in a stem with the CYC1 terminator, whereas k 35 has only 5 guanines in an analogous structure. This causes an increase in MFE and consequently a higher fluorescence

k 27 shared with k 29k 31 an upstream region made only of adenines. However, unlike in these three sequences, the extended Kozak sequence of k 27 did not contain any adenine. The MFE of k 27 (−247.04 kcal/mol) was comparable to that of k 29k 31, but its corresponding mRNA secondary structure had a different configuration. Indeed, all nucleotides of the extended Kozak sequence (with the exception of the cytosine at position −7) were involved in base-pairing interaction not with the CDS but with the CYC1 terminator (positions +755 to +762 Fig. 6 a). The fluorescence level of k 27 was slightly higher than that of k 29, i.e. almost 7-fold greater than that of k 31.

The five sequences considered so far (k 26, k 27, k 29k 31) have in common an extended Kozak region rich in guanine that was sequestered into a stem in the MFE mRNA secondary structure. In four cases, the extended Kozak sequence paired (partially) with the CDS, and in one case (k 27) with the CYC1 o Exterminador do Futuro. The MFE of k 26 was the lowest, as its upstream region was also sequestered into a stem. The other four sequences showed very similar MFE values but rather different fluorescence levels.

The other group of sequences affected by multiple mutations with respect to k 1 had only adenines in the extended Kozak sequence and a variable number of guanines in the upstream region.

k 28, k 34, e k 35 had, respectively, 7, 6, and 5 guanines in a row from position −15 downstream. Although the MFE of k 35 was clearly higher than that of k 28 e k 34 (Table 2), the three sequences gave rise to similar mRNA structures where at least five guanines of the upstream region (plus the first adenine downstream) were locked into a stem due to base-pairing interactions with the CYC1 terminator (see Fig. 6 b).

Interestingly, both the MFE and fluorescence level of k 28 were comparable to those of k 27 e k 29. Hence, even if the Kozak sequence was free of pairing interactions, the sequestering of the upstream region into a stem was enough to guarantee a clear drop in protein expression. This is further confirmation of the role played by the nucleotides upstream of the Kozak sequence in tuning protein expression.

A different MFE mRNA secondary structure was obtained for k 33 (four guanines, intermixed with adenines), in which half of the extended Kozak sequence and almost the whole upstream region were involved in base-pairing interactions with the CDS, giving rise to a long stem. However, compared to k 35, where only five nucleotides of the upstream region were locked into a stem with the CYC1 terminator, k 33 showed a higher MFE as well as a higher fluorescence level (Fig. 5 and Additional file 1).

Finally, for k 32, k 36, e k 37 (with four, three, and two guanines in the upstream region, respectively) RNAfold returned the same MFE as for k 1. The corresponding mRNA secondary structures were all characterized by the presence of the the giant hairpin (see Additional file 1). Compared to our experimental data, this result was plausible only for k 37 but in apparent disagreement with the measurements for k 32 e k 36, whose fluorescence levels were significantly lower than that of k 1 (Fig. 5). In particular, the fluorescence of k 32 only corresponded to about 69% of that of k 1. Therefore, it can be argued that in vivo k 32 e k 1 share the same MFE and mRNA secondary structure, as suggested by the in silico simulations.

In contrast to the multiple point mutations, of the single point mutations on k 1, só k 4 caused a modification in the structure of the giant hairpin and a consequent decrease in the MFE. k 4 carries a guanine at position −1 that pairs with the cytosine at position −31 such that the length of the loop is reduced from 32 to 29 nucleotides and the MFE is lowered to −241.42 kcal/mol (Fig. 4 a). According to our data, this minimal change has no effect on fluorescence expression. All the other point mutations that induced a fluorescence level significantly higher than that of k 1 (namely, k 16, k 47k 51, e k 53k 55) were characterized by the same MFE and corresponding mRNA secondary structure as k 1, according to the RNAfold simulations.


The next steps: making new DNA

One of the original DNA strands is used as a template for the synthesis of new DNA. The primers anneal to the template strand, and the DNA polymerase enzyme makes a new strand of DNA by creating a complementary sequence of nucleotides drawn from the reaction mixture.

The new DNA strand is made by complementary base pairing with the original DNA template. Because all four ordinary DNA nucleotides are present in large amounts, the chain elongation continues normally – until by chance a dideoxynucleotide (terminator) is added in the place of a normal DNA nucleotide.

The dideoxynucleotides are just like ordinary DNA nucleotides except that one hydroxyl (OH) group has been chemically changed to a hydrogen (H). With normal DNA nucleotides, one nucleotide can be attached to another and so on, forming a chain. The chemical change in a dideoxynucleotide, however, means that no additional nucleotides can be added, hence the name ‘terminator nucleotides’.

The synthesis of new DNA is terminated when one of the dideoxynucleotides is added to the strand. Because there are many more ordinary nucleotides than dideoxynucleotides, some chains will be several hundred nucleotides long before a dideoxynucleotide is added. The end result is a whole lot of new DNA fragments, of varying length, all ending with a dideoxynucleotide.


How to identify the GPD gene when the sequence varies between organisms? - Biologia

Proteomics is the study of the entire set of proteins produced by a cell type in order to understand its structure and function.

Objetivos de aprendizado

Explain how the field of genomics led to the development of proteomics

Principais vantagens

Pontos chave

  • Proteomics investigates how proteins affect and are affected by cell processes or the external environment.
  • Within an individual organism, the genome is constant, but the proteome varies and is dynamic.
  • Every cell in an individual organism has the same set of genes, but the set of proteins produced in different tissues differ from one another and are dependent on gene expression.

Termos chave

  • proteômica: the branch of molecular biology that studies the set of proteins expressed by the genome of an organism
  • proteome: the complete set of proteins encoded by a particular genome
  • genômica: the study of the complete genome of an organism

Proteomics is a relatively-recent field the term was coined in 1994 while the science itself had its origins in electrophoresis techniques of the 1970’s and 1980’s. The study of proteins, however, has been a scientific focus for a much longer time. Studying proteins generates insight into how they affect cell processes. Conversely, this study also investigates how proteins themselves are affected by cell processes or the external environment. Proteins provide intricate control of cellular machinery they are, in many cases, components of that same machinery. They serve a variety of functions within the cell there are thousands of distinct proteins and peptides in almost every organism. The goal of proteomics is to analyze the varying proteomes of an organism at different times in order to highlight differences between them. Put more simply, proteomics analyzes the structure and function of biological systems. For example, the protein content of a cancerous cell is often different from that of a healthy cell. Certain proteins in the cancerous cell may not be present in the healthy cell, making these unique proteins good targets for anti-cancer drugs. The realization of this goal is difficult both purification and identification of proteins in any organism can be hindered by a multitude of biological and environmental factors.

O estudo da função dos proteomas é denominado proteômica. Um proteoma é o conjunto completo de proteínas produzidas por um tipo de célula. Genomics led to proteomics (via transcriptomics) as a logical step. Proteomes can be studied using the knowledge of genomes because genes code for mRNAs and the mRNAs encode proteins. Although mRNA analysis is a step in the right direction, not all mRNAs are translated into proteins. A proteômica complementa a genômica e é útil quando os cientistas desejam testar suas hipóteses baseadas em genes. Even though all cells of a multicellular organism have the same set of genes, the set of proteins produced in different tissues is different and dependent on gene expression. Assim, o genoma é constante, mas o proteoma varia e é dinâmico dentro de um organismo. In addition, RNAs can be alternately spliced (cut and pasted to create novel combinations and novel proteins) and many proteins are modified after translation by processes such as proteolytic cleavage, phosphorylation, glycosylation, and ubiquitination. There are also protein-protein interactions, which complicate the study of proteomes. Embora o genoma forneça um blueprint, a arquitetura final depende de vários fatores que podem alterar a progressão dos eventos que geram o proteoma.

Large-scale proteomics machinery: This machine is preparing to do a proteomic pattern analysis to identify specific cancers so that an accurate cancer prognosis can be made.


Few steps to find amino acid sequence

STEP 1 – Know which DNA strand is given. There are two strands: Coding strand or non-coding strand.

One can either read the coding strand from 3’ to 5’ or read the template strand from 5’ to 3’ when making the corresponding m-RNA strand.

STEP 2 – Write the corresponding m-RNA strand.

Using Coding strand: (A= U, T= A, G=C, C=G) Read from left to right

Using template strand: (T=U)Read from left to right

We can see that we achieve the same sequence irrespective of the strand used.

STEP 3 – Convert m-RNA as a sequence of codons. ALWAYS start from the codon AUG and NEVER count the same nucleotide twice!

STEP 4 – Use the below table to find the relevant amino acid sequence.

Also remember,
uma. Start codon AUG stands for Methionine.
b. If you come across a stop codon UAA, UGA, UAG you should stop sequencing.


Assista o vídeo: Single Gene vs. Multi-Gene Traits (Dezembro 2022).