Em formação

A senescência celular em cultura é comparável à in vivo?

A senescência celular em cultura é comparável à in vivo?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Uma célula é 'senescente' quando deixou permanentemente o ciclo celular. Isso pode ser causado por tensões ou por atingir o 'limite de Hayflick' (a célula atingiu seu tempo de vida replicativo, conforme definido por seus telômeros).

Células cultivadas em vitro podem ser usados ​​como modelos para estudar a senescência (ou às vezes o 'envelhecimento', embora a distinção não esteja necessariamente no escopo desta questão) pelo crescimento da mesma população de células por um longo tempo (muitas passagens). Um método comum para identificar uma população de células senescentes é usar a coloração com beta-galactosidase.

Eu queria saber em que grau as células senescentes em cultura (identificadas por coloração beta-gal) são realmente comparáveis ​​àquelas que você poderia esperar na Vivo. Eu pergunto porque me parece que uma célula senescente terminal pode não sobreviver muito tempo em um organismo, então o que chamamos de células senescentes na Vivo são realmente células pré-senescentes? Não tenho base para isso, apenas um sentimento. (Muito científico eu sei).


A senescência não é igual à morte celular, mas é simplesmente um estado parado no qual a célula ainda permanece viável (1). Tem sido demonstrado em toda a literatura que este estado corresponde a um perfil alterado do ciclo celular diferente da inibição de contato ou parada induzida por dano (2). Isso corresponde a um tamanho de célula aumentado, expressão gênica alterada (3, 4) e a expressão dependente do pH de β-galactosidase (5). Isso foi demonstrado tanto em células em cultura quanto em modelos animais (6, 7).

  1. Goldstein, S. (1990) Ciência 249, 1129-1133.
  2. Sherwood, S. W. et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. , EUA 85, 9086-9090.
  3. Cristofalo, V. J. et al. (1998) Crit. Rev. Eukaryot Gene Expr. 8, 43-80.
  4. Linskens, M. H. et al. (1995) Nucleic Acid Res. 23, 3244-3251.
  5. Dimri, G. et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci., EUA 92, 9363-9367.
  6. Swarbrick, A. et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci., EUA 105, 5402-7.
  7. Efeyan, A. et al. (2009) PLoS One 4, e5475.

A senescência celular em cultura é comparável à in vivo? - Biologia

A senescência celular em rins de ratos in vivo aumenta com o crescimento e a idade, apesar da falta de encurtamento dos telômeros.

Fundo

As células somáticas in vitro têm uma expectativa de vida finita antes de entrar em um estado de senescência, mas não está claro se esse estado ocorre in vivo no desenvolvimento, crescimento e envelhecimento dos rins. Anteriormente, mostramos que o córtex renal humano apresenta encurtamento dos telômeros com a idade. Neste estudo, comparamos as mudanças estruturais e funcionais no rim de ratos com a idade aos fenômenos associados à senescência celular in vitro.

Métodos

Avaliamos as mudanças nos rins de ratos Fischer 344 de 1 a 9 meses de idade para definir o crescimento e o desenvolvimento e de 9 a 24 meses para definir o envelhecimento.

Resultados

Os telômeros de rim de rato tinham aproximadamente 35 a 40 kb de comprimento e não encurtaram significativamente. A expressão de mRNA para p16 INK4a, um gene de senescência característico in vitro, era indetectável na maioria dos ratos jovens, mas aumentou 27 vezes durante o crescimento e mais 72 vezes durante o envelhecimento. A proteína p16 INK4a foi localizada no núcleo e aumentou com a idade. O mRNA de p16 INK4a também aumentou em outros tecidos. A lipofuscina e a β-galactosidase associada à senescência aumentaram no epitélio com o crescimento e o envelhecimento e sua ocorrência foi significativamente associada entre si. A lipofuscina foi particularmente encontrada em néfrons atróficos.

Conclusão

Concluímos que a senescência celular ocorre tanto no crescimento quanto no envelhecimento no rim de ratos e pode contribuir para a patologia relacionada à idade. Essas mudanças não são devidas ao encurtamento do telômero, mas podem refletir o estresse ambiental cumulativo.


Análise de senescência celular em cultura in vivo: o ensaio de β-galactosidase associado à senescência

A senescência replicativa, um processo descrito pela primeira vez há quase 40 anos, acarreta uma parada irreversível do crescimento com funções metabólicas sustentadas e também está associada ao aumento da resistência aos sinais apoptóticos. O interesse por esse processo aumentou muito nos últimos 10 anos, pois foi demonstrado que a senescência pode funcionar como um potente mecanismo supressor de tumor. Embora a evidência crescente sugira que o fenótipo senescente está associado a uma matriz extraordinariamente complexa de padrões de expressão gênica e interações com o microambiente, há apenas um marcador amplamente aceito para distinguir tais células in vitro e in vivo. Este marcador é a expressão associada à senescência de uma β-galactosidase de pH 6 (SA-β-gal). Aqui, um método para analisar a expressão de SA-β-gal em células cultivadas e em tecidos humanos e animais é descrito, e parâmetros importantes a serem considerados ao realizar tais ensaios também são destacados.


Uma análise comparativa da biologia celular da senescência e do envelhecimento

Várias organelas intracelulares, como lisossomos, mitocôndrias, núcleos e citoesqueletos, mudam durante a senescência replicativa, mas a utilidade dessas mudanças como marcadores gerais de senescência e seu significado em relação às alterações funcionais não foram revisados ​​de forma abrangente. Além disso, a relevância dessas alterações para as mudanças celulares e funcionais em animais envelhecidos é pouco compreendida. Neste artigo, revisamos os estudos que relatam essas mudanças associadas à senescência em várias células de envelhecimento e seus mecanismos subjacentes. Mudanças associadas a lisossomos e mitocôndrias são encontradas não apenas em células em senescência replicativa ou induzida, mas também em células pós-mitóticas isoladas de organismos envelhecidos. Em contraste, outras alterações ocorrem principalmente em células em senescência in vitro. A comparação das mudanças relacionadas à idade e seus mecanismos subjacentes em células senescentes in vitro e células pós-mitóticas envelhecidas revelaria a relevância da senescência replicativa para os processos fisiológicos que ocorrem nas células pós-mitóticas conforme os indivíduos envelhecem.

Esta é uma prévia do conteúdo da assinatura, acesso por meio de sua instituição.


Avaliação da senescência celular em tecidos e na Vivo

Apesar dos avanços significativos no estudo da senescência celular, detectando e avaliando essas células na Vivo com altos níveis de confiança permanecem desafiadores. Ao contrário das culturas de células, a grande maioria das células dentro do corpo são quiescentes ou diferenciadas terminalmente, o que significa que alguns dos marcadores usados ​​para identificar células senescentes em vitro, como a falta de síntese ou proliferação de DNA, geralmente não são válidos. Características adicionais prontamente observadas em culturas, como alterações morfológicas ou aumento do tamanho das células, raramente são preservadas na Vivo, devido a restrições estruturais e arquitetônicas. Outros marcadores, incluindo proteínas associadas ao ciclo celular, também podem ser expressos em tipos de células e processos específicos, como inflamação, o que restringe ainda mais sua confiabilidade. Além disso, as células senescentes são geralmente baixas em número dentro de um organismo, mesmo em animais idosos [[67, 90]]. Esses fatores, juntamente com a heterogeneidade do programa senescente e a complexidade intrínseca de um organismo vivo, dificultam a avaliação da senescência celular. na Vivo. É por esta razão que esforços substanciais estão sendo feitos atualmente para fornecer estratégias mais robustas e confiáveis ​​para a detecção e avaliação da senescência em tecidos fixos e animais vivos.

Detecção imunohistoquímica de senescência ex vivo

Identificar a senescência celular na análise histológica tem sido fundamental para a interpretação e compreensão deste mecanismo dentro das estruturas e arquitetura do tecido preservadas. Apesar das desvantagens óbvias devido à inespecificidade ou falta de confiabilidade dos marcadores, este método convencional tem sido historicamente instrumental para o exame da senescência. no locale a International Cellular Senescence Association recentemente sugeriram um fluxo de trabalho simplificado para seu reconhecimento dentro dos tecidos [[28]]. Em consonância com essas diretrizes, recomendamos a confirmação da presença de senescência celular no local com segurança pela detecção imunoquímica concomitante de pelo menos três marcadores diferentes dentro da mesma célula, representando diferentes marcas do fenótipo senescente. Uma avaliação válida pode incluir, por exemplo, a presença de atividade SA-β-gal juntamente com uma p16 INK4a e co-coloração HP1-positiva. Um fluxo de trabalho representativo para esta detecção ex vivo é exemplificado na Fig. 2B.

Aumento da massa lisossomal e conteúdo

A atividade de SA-β-gal não é apenas útil em vitro marcador conforme descrito acima, mas também amplamente utilizado para o ex vivo avaliação da senescência também. Em 1995, a atividade de SA-β-gal foi relatada pela primeira vez para detectar senescência em amostras de pele humana de indivíduos idosos [[42]], e desde então tem sido considerada como o padrão ouro para a detecção de células senescentes putativas em tecidos. No entanto, é importante considerar que, como acontece com qualquer outro biomarcador de senescência, essa atividade enzimática não é exclusiva das células senescentes em um organismo vivo. A Β-galactosidase é particularmente enriquecida em alguns tipos de células altamente secretoras, como macrófagos e osteoclastos residentes em tecidos, células que sofrem aumento da atividade lisossomal durante a autofagia e em algumas células cancerosas [[91-93]]. A coloração também apresenta outras limitações, pois só pode ser realizada em tecido fresco, transmitindo possíveis incompatibilidades com outros fixadores e métodos de preparo de amostras.

Digno de nota, o conteúdo lisossomal aumentado das células senescentes também as torna positivas para a coloração histoquímica de Sudan Black-B (SBB), que se acumula na lipofuscina devido à sua natureza apolar, um grânulo de pigmento composto de resíduos de lipídios que também é considerado uma marca registrada de envelhecimento [[94]]. Uma versão biotinilada do SBB, conhecida como GL13, foi desenvolvida posteriormente e demonstrou maior especificidade imunohistoquímica e sinal de fundo diminuído. É importante ressaltar que seu desempenho não se limita ao processamento de tecido fresco, como é o caso do SA-β-gal, e pode ser usado para corar amostras arquivadas, o que apresenta uma vantagem notável sobre a coloração clássica [46, 95].

Apesar dessas limitações, SA-β-gal continua a ser um dos biomarcadores mais amplamente usados ​​para a detecção citológica ou histológica de senescência celular em tecidos. Uma série de novas estratégias foram desenvolvidas explorando esta atividade enzimática, incluindo sondas para o na Vivo rastreamento de senescência e ferramentas baseadas em fluorescência para microscopia e metodologias baseadas em citometria de fluxo, que serão discutidas posteriormente.

Ciclo celular e marcadores moleculares de proliferação

Conforme apresentado anteriormente, a pesquisa em vitro definiu a parada do ciclo celular como uma das características mais marcantes da senescência celular. A expressão do inibidor de CDK p16 INK4a, codificado pelo CDKN2A gene, é provavelmente o marcador genético mais utilizado de senescência celular na Vivo [[90, 96]]. Ao contrário de SA-β-gal, p16 INK4a desempenha papéis mecanicistas cruciais na implementação do programa senescente, interrompendo o ciclo celular através da via de p16 INK4a / Rb. No entanto, sua coloração em tecidos deve ser interpretada com cautela, pois também pode ser expressa em linfócitos envelhecidos, células com RB inativado, como células tumorais, e durante certas condições fisiológicas, como inflamação, exposição ao clastogênio ou cicatrização de feridas [[8, 97-99]]. Além disso, os anticorpos atualmente disponíveis para a detecção histoquímica de p16 INK4a murino são fracos e não confiáveis. A fim de contornar isso, vários modelos de camundongos foram desenvolvidos nos quais um gene repórter é expresso sob o controle do promotor p16 INK4a, que também forneceram evidências adicionais da expressão deste inibidor de CDK em contextos fisiológicos diferentes da senescência celular.

Digno de nota, o CDKN2A O gene também codifica para o inibidor de CDK humano p14 ARF e seu homólogo de camundongo p19 ARF por meio de uma estrutura de leitura alternativa (ARF). Apesar de serem expressos apenas em tipos específicos de células senescentes, p14 ARF e p19 ARF também têm sido usados ​​para a detecção histoquímica de senescência em tecidos [100]. Além disso, p15 INK4B, codificado por CDKN2B, também pode detectar a senescência celular em tecidos na ausência de p16 INK4A [[101]].

Conforme descrito anteriormente, a rede p53 / p21 é um segundo regulador principal do ciclo celular e indutor da parada proliferativa. No entanto, é importante notar que um insulto prejudicial transitório pode ativar o p53 para ativar os processos de reparo do DNA durante os estados quiescentes. na Vivo [[67]], bem como também é um dos principais fatores de apoptose. O papel do inibidor de CDK p21 CIP1, induzido pela ativação de p53, é considerado importante durante o início da senescência e também pode ser útil na detecção de células senescentes em tecidos. No entanto, a expressão de p21 CIP1 geralmente não é mantida uma vez que o programa de senescência foi estabelecido [[102]], e, portanto, marcadores moleculares envolvidos no eixo p16 / p15 / Rb são considerados mais confiáveis ​​na detecção de senescência ex vivo.

Apesar da grande maioria das células dentro dos tecidos serem diferenciadas terminalmente, analisar a ausência de proliferação em alguns contextos, como em amostras de tumor, onde p16 ou outros marcadores moleculares podem ser expressos de forma aberrante, pode ser relevante para a identificação da senescência celular. No caso de espécimes de camundongo, os animais podem ser administrados, antes da coleta de tecido, com análogos de nucleosídeos que são incorporados durante a síntese de DNA ativo e, portanto, marcam células em divisão, nomeadamente EdU ou BrdU. Alternativamente, o uso de anticorpos monoclonais contra antígenos como PCNA e Ki-67 são amplamente utilizados como indicadores de proliferação e podem detectar células nas fases G1, S, G2 e M, distinguindo de forma confiável células em proliferação de não-divisão em amostras histológicas sem a necessidade de anterior na Vivo preparação.

Recursos nucleares relevantes ex vivo

As marcas epigenéticas e outras alterações e rearranjos estruturais do DNA são geralmente considerados alguns dos biomarcadores de senescência celular mais proeminentes. Como introduzido anteriormente, os SAHFs, que estão diretamente ligados ao silenciamento de genes relacionados à proliferação [[103]], têm um papel causal fundamental e são normalmente avaliados em tecidos por imunocitoquímica contra manchas de HP1, bem como, embora com menos frequência, contra marcas epigenéticas de histona H2A variante mH2A, H3K9Me2 e H3K9Me3. No entanto, esses focos de heterocromatina são mais comumente encontrados em OIS e podem estar ausentes dependendo do tipo de célula e de outros fatores de senescência e, portanto, geralmente não são considerados um marcador confiável em tecidos [54]. Digno de nota, os SAHFs não foram identificados em células de camundongo até agora e, portanto, não são usados ​​para a detecção de senescência em tecido murino.

Marcas nucleares adicionais incluem quebras de fita dupla de DNA, também conhecidas como DNA-SCARS, que são uma característica comum da senescência induzida por dano [[56]]. Estes são geralmente detectados em tecidos por imunorreatividade γH2AX ou, menos frequentemente, por proteínas relacionadas com DDR acumuladas, como ATR, ATM ou imunorreatividade p53. No entanto, marcadores de dano ao DNA também apresentam baixa especificidade para o fenótipo senescente em tecidos, não apenas porque podem ser limitados a subtipos de dano ao DNA da senescência celular, mas também porque também podem ser detectados em células quiescentes e apoptóticas. Como um marcador da integridade do envelope nuclear interrompido, a falta de lamina B1 também pode ser usada para detectar e quantificar a senescência celular em tecidos [[104, 105]], embora este não seja um método amplamente estabelecido.

No geral, a coloração de marcadores de dano nuclear ou de DNA em combinação com outras proteínas relacionadas ao ciclo celular e SA-β-gal fornecem uma estratégia confiável para confirmar o fenótipo em tecidos fixados.

Detectando senescência em animais vivos e células vivas

O desenvolvimento de novos métodos para a detecção de senescência em tecidos vivos e organismos tem se tornado cada vez mais atraente devido à possibilidade de rastrear a senescência em contextos fisiológicos e patológicos relevantes sem danificar as células, bem como rastreá-los ao longo do tempo para obter maiores insights sobre o papéis e efeitos dentro do tecido (Fig. 2C). No entanto, essas estratégias às vezes podem ser mais restritivas, dada a dificuldade de implementar uma abordagem multimarcador, e a interpretação de algumas delas deve ser tomada com cautela.

Citometria de fluxo

Os ensaios baseados na citometria de fluxo têm o potencial de remodelar a avaliação da senescência celular, pois permitem a análise e quantificação rápida das características físicas e do imunofenótipo de populações heterogêneas simultaneamente. Em virtude de sua versatilidade, vários ensaios baseados nesta técnica foram desenvolvidos para examinar a senescência celular em suspensões de amostras de tecido homogeneizadas, empregando diferentes marcas e parâmetros do fenótipo senescente.

Conforme discutido anteriormente, SA-β-gal tem permitido o desenvolvimento de compostos fluorogênicos funcionalizados como substratos que permitem a marcação de células senescentes quando clivadas por esta atividade enzimática. Isso inclui C12FGD [[45]] e SPiDER-βgal [[106]], que foram usados ​​com sucesso para detectar β-gal Alto -expressando células em tecidos vivos [[107-109]]. No entanto, para maior confiança, recomenda-se que sejam testados em conjunto com outros marcadores que podem ser detectados simultaneamente com o uso de filtros adicionais. Conforme apresentado acima, o aumento da produção de ROS derivado da disfunção mitocondrial também pode ser analisado por citometria de fluxo com o uso de corantes fluorescentes [[78]]. Em tecidos vivos, no entanto, detectar ROS pode ser desafiador e os resultados podem ser inespecíficos, e é de utilidade limitada para medir a senescência com segurança. A citometria de fluxo também permite a análise do tamanho relativo das células e da granularidade por meio de dispersões frontais e laterais, o que tem se mostrado útil para culturas de células, dado o aumento geral do volume celular, vacuolização e compartimento lisossomal que caracterizam a senescência. em vitro. No entanto, há evidências limitadas de células senescentes apresentando um tamanho aumentado na Vivo, provavelmente devido às restrições da arquitetura do tecido, o que significa que não é amplamente utilizado na citometria de fluxo. A exclusão da proliferação com o uso de anticorpos Ki-67 ou corantes do ciclo celular também apresenta valor limitado na maioria dos contextos, dado o fato de que a maioria das células nos tecidos são quiescentes ou diferenciadas terminalmente.

O uso de anticorpos intracelulares contra biomarcadores nucleares relevantes em combinação com a análise SA-β-gal pode ser uma estratégia eficaz. Um método desenvolvido recentemente com base nesta combinação, denominado ImageStreamX, foi usado para detectar simultaneamente SA-β-gal, receptores específicos de tecido e a perda de HMGB1 como um marcador adicional de senescência em pulmões fibróticos murinos, xenoenxertos tratados com doxorrubicina e vários órgãos colhidos de animais idosos [[36]]. No entanto, os marcadores intracelulares são mais difíceis de medir em tecido vivo e geralmente requerem a alteração da membrana plasmática para penetrar na célula, potencialmente prejudicando a viabilidade celular. Nesse sentido, os antígenos de membrana são de maior utilidade, pois podem permitir o isolamento viável de tipos específicos de células, seguindo o que se conhece como códigos combinatórios.

Apesar de marcadores de membrana universais ou mais específicos de senescência celular ainda não serem definidos, estudos recentes forneceram informações significativas sobre o chamado surfaceome de células senescentes [[110-115]]. Na verdade, protocolos para a detecção de senescência celular usando uma combinação de marcadores extracelulares foram disponibilizados, embora apenas com o uso de culturas de células [[112]]. No entanto, alguns desses receptores de superfície relatados, nomeadamente ICAM-1, NOTCH1, NOTCH3, DEP1, B2M, DPP4 STX4, NTAL e mais recentemente uPAR, provaram servir como marcadores confiáveis ​​de senescência em diferentes tecidos murinos por meio de coloração histológica combinatória convencional [ [110-112, 116-118]] e, portanto, apresentam o potencial a ser empregado para análise de citometria de fluxo. É importante notar que a expressão desses receptores nem sempre é específica, mas predominantemente superexpressa no fenótipo senescente em relação às contrapartes não senescentes, como é o caso de outros marcadores, e eles exigirão validação adicional em tipos adicionais de senescência celular, tecidos e modelos.

Na Vivo modelos de mouse

O uso do chamado ratos repórter senescência tem sido fundamental para o monitoramento em tempo real desse mecanismo em tecidos intactos. Sendo p16 Ink4a o marcador genético de senescência celular mais amplamente utilizado, os modelos desenvolvidos até o momento projetaram a expressão de um repórter de uma forma dependente de p16 por meio de abordagens transgênicas ou knock-in.

O primeiro desses modelos foi gerado em 2011, quando Baker e colegas desenvolveram o INK-ATTAC (Ink4a apoptose através da ativação direcionada de caspase) linha transgênica, na qual células que expressam p16 INK4a ativam a expressão de EGFP juntamente com uma proteína de fusão projetada (FKBP-Casp8), que resulta na ablação seletiva das células após o tratamento com fosfatase alcalina [[98] ]]. Essa estratégia permitiu não apenas a detecção e coleta de tais células, mas também sua remoção específica, o que retardou notavelmente o início e atenuou a progressão dos distúrbios relacionados à idade, demonstrando pela primeira vez o papel causal das células senescentes durante o envelhecimento na vida. organismo [[98]]. Em 2013, o primeiro modelo knock-in com a expressão de luciferase sob o promotor p16 INK4a foi gerado, por meio do qual os autores observaram aumento da luminescência com a idade e durante os primeiros eventos neoplásicos [[99]]. Um ano depois, a cepa de camundongo p16-3MR foi projetada conduzindo a expressão da proteína de fusão trimodal sob o mesmo promotor, o que permitiu a detecção e análise de células senescentes putativas em tecidos envelhecidos e durante a cicatrização de feridas [8]. Esta proteína de fusão contém três domínios, dois dos quais permitem o rastreamento e detecção de células que expressam p16 graças à expressão de luciferase e um monômero de proteína fluorescente vermelha, enquanto o terceiro conduz a eliminação de tais células através da atividade de um HSV truncado -1 quinase, após administração de ganciclovir [[8]]. Por último, uma estratégia recente resultou na geração de um novo p16 INK4a modelo repórter denominado p16-Cre / R26-mTmG. Para gerar isso, os autores introduziram um cassete Cre-recombinase dentro do exon 3 do endógeno Cdkn2a gene e cruzou a linha de knock-in resultante com uma cepa Rosa26-mTmG. Esta abordagem elegante torna todas as células dentro do animal positivas para tdTomato e permite a marcação contínua de células senescentes putativas sobre a expressão de recombinase Cre conduzida por p16, que muda o sinal fluorescente vermelho para EGFP [[119]].

Embora esses modelos tenham sido extremamente importantes para analisar a expressão aumentada do p16 Ink4a no envelhecimento, inflamação e tumorigênese, os estudos no nível de uma única célula permaneceram mais desafiadores. Por meio de uma abordagem muito recente, no entanto, Lui et al. foram capazes de isolar, enumerar e caracterizar células individuais que expressam p16 por meio de um alelo repórter baseado em fluorescência com dímero em tandem de tomate batido no Cdkn2a locus [[120]]. Embora a única expressão de p16 Ink4a nem sempre seja uma indicação fiel de senescência celular, o isolamento de tais células e posterior caracterização por meio de estratégias de citometria de fluxo podem adicionar robustez a essas estratégias repórter, tornando-as ferramentas muito valiosas para o estudo da senescência celular em vida organismos.

Sondas para rastreamento ao vivo

Um grande número de moléculas e marcadores cromogênicos e fluorescentes foram desenvolvidos por meio da exploração dos níveis geralmente aumentados de SA-β-gal de células senescentes. No entanto, os comprimentos de onda curtos da maioria dessas sondas resultam na dispersão da emissão de fluorescência, levando a uma penetração tecidual limitada. Além disso, os tecidos apresentam alto sinal de fundo autofluorescente, o que dificulta ainda mais sua detecção por técnicas de bioimagem em organismos vivos. Para superar isso, estudos recentes utilizaram estratégias NIR para novas sondas, que permitem uma penetração mais profunda graças a comprimentos de onda de emissão mais longos [[121]]. Sondas de dois fótons, que requerem a excitação simultânea por dois fótons com comprimentos de onda mais longos, também surgiram como uma alternativa que, além disso, minimiza o potencial fotodano ao tecido. Exemplos de sondas de dois fótons e NIR incluem AHGa e NIR-BG, que foram usados ​​com sucesso para detectar senescência induzida por quimioterapia na Vivo [[47, 49]]. Outros relevantes, como SG1 e HMRef-β gal, foram desenvolvidos e demonstraram detectar β-gal Alto -expressando células na Vivo, apesar de não estar no contexto da senescência celular [[48, 122, 123]]. Sondas adicionais foram desenvolvidas para a enzima β-galactosidase traduzida do lacZ gene, que é codificado pela bactéria Escherichia coli operon da lactose. No entanto, esta enzima e a β-galactosidase eucariótica lisossomal endógena compartilham apenas 33% das semelhanças no nível de aminoácidos [[124]] e, portanto, desencorajamos o uso dessas para a detecção de senescência.

As técnicas de imagem usadas rotineiramente na clínica, como a imagem PET, estão ganhando atenção no desenvolvimento de ferramentas direcionadas à senescência. Como o PET permite a detecção de alterações bioquímicas em tecidos por meio de traçadores radioativos, o aumento de SA-β-gal das células senescentes é de uso particular. Notavelmente, um rastreador PET recentemente desenvolvido, denominado FPyGal, mostrou uma correlação entre a atividade β-gal e a captação do rastreador em tumores tratados com quimioterapia na Vivo [[125, 126]]. Essas estratégias são de particular interesse graças à sua potencial tradução para ambientes humanos.

Esforços substanciais estão sendo feitos atualmente para gerar sondas de nova geração para diminuir vazamentos e fotodanos, bem como melhorar sua retenção dentro das células senescentes. Apesar dessas ferramentas ainda não estarem disponíveis comercialmente, é certo que se tornarão extremamente populares nos próximos anos. Eles não só permitem o monitoramento longitudinal de longo prazo de células presumivelmente senescentes em condições fisiológicas relevantes, sem encerrar experimentos, mas também têm o potencial de serem traduzidos como ferramentas de diagnóstico na clínica.


Agradecimentos

Agradecemos aos membros de nossos laboratórios e a muitos colegas pelas discussões que ajudaram na preparação deste manuscrito.

F. Rodier é financiado por doações do Institut du Cancer de Montréal (Iniciativa René Malo para Pesquisa Inovadora) e da Cancer Research Society (CRS). J. Campisi é financiado por doações dos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos (Instituto Nacional do Envelhecimento, Instituto Nacional do Câncer) e do Departamento de Energia. Os autores declaram não haver afiliações comerciais e conflitos de interesse.


Uma espada de dois gumes

Não foi esquecido por um jovem Leonard Hayflick que, embora as células cancerosas pareçam se multiplicar pela eternidade em cultura, os fibroblastos humanos saudáveis ​​não o fazem. Em algum ponto após 50 divisões celulares, os fibroblastos tornam-se aumentados e achatados e se recusam a proliferar. Quando Hayflick, então no Instituto Wistar na Filadélfia, fez essa observação pela primeira vez no final da década de 1950, a maioria dos pesquisadores culpou as condições de cultura inadequadas pela aparente falta de crescimento das células. Mas, por meio de uma série de experimentos com o citogeneticista Paul Moorhead, Hayflick demonstrou que as células entraram em um estado que ele chamou de senescência devido a um fenômeno celular intrínseco, aparentemente uma resposta ao estresse replicativo prolongado. Ainda assim, o conceito foi inicialmente rejeitado pela comunidade científica, e mesmo com a senescência celular em cultura de células sendo gradualmente aceita ao longo da próxima década, os pesquisadores continuaram a supor que o fenômeno não era relevante para os organismos vivos.

Uma das primeiras dicas de que eles estavam errados veio na década de 1990 com o trabalho de Manuel Serrano, então um pós-doutorado no laboratório do biólogo celular David Beach no Cold Spring Harbor Laboratory em Nova York. Serrano observou a mesma morfologia ampliada e achatada que Hayflick havia descrito décadas antes - desta vez em resposta à superexpressão de uma forma oncogênica do gene regulador de crescimento celular Ras em fibroblastos murinos. Talvez as células estivessem envelhecendo como forma de evitar que se tornassem malignas, supôs Serrano. Quando as células são expostas a formas de estresse que normalmente desencadeariam o câncer - como danos ao DNA devido à replicação prolongada ou outras lesões celulares que ocorrem com a idade - elas podem sofrer senescência como forma de evitar a transmissão de danos às células-filhas.

Os pesquisadores argumentam que, embora muitos agentes alardeados como elixires da juventude tenham repetidamente falhado em mostrar benefícios em estudos clínicos, o conceito de senolítico resistirá ao teste do tempo.

“Este estudo e os posteriores deram uma 'razão biológica' para a existência de células senescentes, que era para proteger do câncer”, diz Bill Keyes, um biólogo celular que estuda a senescência no Instituto de Genética e Biologia Molecular e Celular na França. Desde então, essa ideia foi validada, enquanto Keyes e outros descobriram que as células senescentes podem afetar os processos biológicos da embriogênese à indução do parto e à cicatrização de feridas. (Veja “O lado bom da senescência” abaixo.)

No entanto, logo ficou claro que a senescência também tem um lado negativo. Intrigada com as observações do acúmulo de células senescentes em tecidos envelhecidos em humanos, a bióloga celular e molecular Judith Campisi, do Buck Institute for Research on Aging, na Califórnia, decidiu examinar mais de perto os genes e proteínas expressos pelas células senescentes. Em 2008, ela e seus colegas relataram que as secreções de células senescentes continham dezenas de proteínas, como citocinas inflamatórias e imunomoduladoras, que poderiam danificar as células vizinhas. Mais tarde, essas proteínas ajudariam a explicar muitos dos efeitos patológicos das células senescentes em tecidos envelhecidos.

Enquanto isso, o geneticista da Mayo Clinic Jan van Deursen investigava as altas concentrações de células senescentes que havia encontrado em uma linhagem mutante de camundongos que exibia envelhecimento acelerado, ou progéria. Depois que alguns experimentos sugeriram que as células poderiam ser a causa dos sintomas dos animais, van Deursen, Kirkland e outros desenvolveram uma técnica para desencadear a apoptose apenas em células que produziram a proteína p16 - um marcador imperfeito de senescência. Em 2011, a equipe relatou que o uso dessa abordagem para matar células senescentes atrasou o início das cataratas dos animais e outras patologias relacionadas à idade nos tecidos do corpo e manteve sua função muscular por mais tempo. Mais tarde, a equipe de van Deursen demonstrou que o tratamento teve um efeito semelhante em ratos que envelhecem naturalmente.

“Houve a principal demonstração de que, na verdade, se você limpar [as células senescentes], isso faria uma diferença significativa na saúde”, disse Paul Robbins, biólogo molecular da Universidade de Minnesota, sobre o estudo de van Deursen de 2011. Junto com a pesquisa de Campisi, "isso mudou o pensamento de todos" sobre a senescência celular, acrescenta Robbins.

O lado bom da senescência

Nas últimas décadas, os pesquisadores não apenas descobriram o lado negro da senescência, mas também seus aparentes efeitos positivos nos organismos vivos. Na década de 1990, o trabalho do biólogo celular Manuel Serrano sugeriu que a senescência pode atuar como um mecanismo para suprimir a formação de tumores. When cells are exposed to genetic or cellular damage that would normally trigger uncontrollable replication, the senescence program would be activated as a means of arresting growth entirely, Serrano and other researchers argue. This would save the cell from passing on damage to its progeny, and the organism from growing tumors. “Senescence protects us from cancer,” Serrano says.

Senescent cells may also be crucial in early development. Research led by Bill Keyes , a cell biologist at the Institute of Genetics and Molecular and Cellular Biology in France, suggests that senescent cells could guide development in chick embryos. In the limb, a senescent cell could “become secretory and start instructing and informing and telling the other cells . . . which cell type to become and how to pattern the limb,” Keyes explains. Waves of senescence also occur in mouse and human embryos, where they may similarly guide cell differentiation and tissue patterning of surrounding cells via the proteins they secrete. This proposed embryological mechanism may be the driver of senescence evolution, likely co-opted later as a cancer prevention feature in maturity, Serrano explains.

Other possible functions of senescence in development continue to emerge. Just last year, for instance, the University of Texas’s Ramkumar Menon , who studies fetomaternal communication, found that cells within the membranes surrounding human fetuses undergo senescence when the fetus is fully developed and generate inflammatory signals in the womb, which he proposes acts as a cue to the mother’s body to initiate labor.

Senescence appears to maintain its importance throughout life: studies indicate that in addition to the proinflammatory factors that senescent cells secrete, they also exude growth factors and enzymes that stimulate tissue repair. For this reason, “we need to be really intelligent about how we manipulate it in the elderly to improve [health later in life],” notes cell and molecular biologist Judith Campisi of the Buck Institute for Research on Aging in California. A major challenge she sees in developing senolytic drugs will be to find compounds that kill groups of senescent cells that are harmful to their environment while sparing beneficial ones. “I think that’s going to be the wave of the future,” she says, “drilling down and understanding this complexity so that the drugs can be more tailored to eliminate subpopulations as opposed to all of them.”

Many researchers now view senescence as a beneficial process that evolved as a developmental and cancer prevention mechanism, but one that came with a tradeoff of the damage senescent cells can cause as they accumulate with age. There are still many unanswered questions about how these cells function, but it is already clear to scientists in the field that senescent cells influence a range of age-related pathologies, at least in rodents. Genetic ablation of senescent cells reduces the number of atherosclerotic plaques in mice, improves cartilage development in mouse models of osteoarthritis, boosts bone strength in murine models of osteoporosis, and even staves off neurodegenerative symptoms in models of Alzheimer’s disease.

These findings have a number of scientists thinking: If clearing senescent cells had such beneficial effects on health, could drugs be developed to do just that?


Cellular senescence and markers

"Senescence" is simply defined as the process of detonation associated with ageing. As we know, nothing lasts forever, and the proliferative capacity of cells is no different. The Hayflick limit describes how cells growing in vitro enter a state called cellular senescence after approximately 60 cell divisions 1 (PMID: 13905658). This permanent arrest of the cell cycle leaves them viable but unable to grow, changing their phenotype. At first it seemed to be an artifact of culturing cells in a dish but after observing senescence in aging and its cancer lesions, it emerged that a similar phenomenon is also found in vivo, where cells enter a state of irreversible, non-proliferative senescence that has implications for the tissue and the organism.

Is senescence helpful or harmful?

While senescence ends the division of cells, it also divides opinion as to its purpose. One hypothesis suggests that cellular senescence is benéfico it evolved as an anti-cancer process to suppress tumor growth. Another hypothesis proposes that cellular senescence is detrimental, as the loss of cells’ regenerative capacity leads to ageing 2 (PMID: 24954210).

Decades later, neither hypothesis has prevailed. In fact, as research has developed, we consider that senescence may have both positive and negative effects, dependendo do contexto. When an organism is younger, the anti-tumor effect of senescence is useful but as the organism ages this same process becomes harmful – this occurs typically after reproduction, thus the process has persisted through generations. This is known as antagonistic pleiotropy.

Senescence is found in all tissues and may play a role in many diseases, meriting investigation across different fields of biology.

Is senescence relevant in disease?

No Câncer, senescence is interesting because it may have a protective or a causative efeito. Oncogene expression can induce the cell cycle arrest seen in early senescence, preventing the aberrant growth of malignant tissue. Interestingly, certain cancer therapies at low doses reduce toxicity and increase senescence 8 (PMID: 20078217), helping to lessen the side effects of these treatments. However, prolonged senescence and expression of the senescent-associated secretory phenotype (SASP) is known to alter the microenvironment 7 (PMID: 27797960). In fact, some factors expressed as part of the SASP, such as MMP-3, may even promote tumor metastasis. It is necessary to distinguish between the helpful and harmful outcomes of senescence in the context of cancer at a very basic level before it can be applied to treatments more effectively.

Cellular senescence is key in normal aging, but there is evidence to show that senescence may also play a role in neurodegenerative disease 9 (PMID: 30261683). Age is one of the key risk factors for Alzheimer’s disease (AD), Parkinson’s disease, and even for the transition in Multiple Sclerosis (MS) from relapsing-remitting to progressive. The accumulation of senescent cells through aging may contribute to the increased risk of developing these diseases. The SASP releases a number of pro-inflammatory factors, which aligns with the upregulation of similar molecules in the AD brain. o inability of older brains to repair damage, particularly in remyelination in MS, has been linked to the inability to replicate and so has been associated with senescence. There is evidence for the senescence markers in several brain cell types, and though this has not been fully elucidated it is an active area of research.

Which markers are used to identify senescence?

Studying senescence as researchers presents problems, as there is no single marker for use in identifying this state. Senescent cells are metabolically active but do not divide, and though they are distinct from cells in quiescence, as both are post-mitotic, it means that a lack of proliferation is not sufficient to call a cell senescent. Certain features can be used to distinguish these cells, but they must be used in a panel.

Intracellular stress leads to double-strand breaks and DNA damage, particularly in telomeres, which causes DDR in cells. This leads to a change in the expression of proteins such as H2AX that can be used as a marker of senescence. DDR can also be visualized by punctate staining of DAPI, which are known as senescence-associated heterochromatin foci 3 (PMID: 23140366).

Figure 1. Immunofluorescent analysis of (4% PFA) fixed HeLa cells using 10856-1-AP (Histone H2A.X antibody) at dilution of 1:50 and Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L).

Staining for p16ink4a is one of the best-acknowledged markers for senescence. Normally this tumor suppressor protein slows the cell cycle at the G1 phase to S phase checkpoint. Other cell cycle regulators that act at this checkpoint are p21 and p53, thus the presence of high concentrations of any of these proteins leads to cell cycle arrest and indicates senescence. If they are all expressed at high levels, there is greater confidence in the senescent phenotype 4 (PMID: 23416979).

Figure 2. Immunohistochemical analysis of paraffin-embedded human cervical cancer tissue slide using 10355-1-AP (P21 CDKN1A Antibody) at dilution of 1:400 (under 40x lens). Heat mediated antigen retrieved with Tris-EDTA buffer (pH9).

Senescence-associated beta-galactosidase (SA-β-gal) is uniquely found in senescent cells. This hydrolase normally converts β-galactosides into monosaccharides but accumulates in the lysosome in senescent cells. A simple assay that shows senescent cells in vitro uses the chromogenic galactose X-gal, where this substrate turns blue when cleaved by β-gal 5 (PMID: 20010931).

Figure 3. Immunofluorescent analysis of Hela cells, using 15518-1-AP (GLB1 antibody) at 1:25 dilution and Rhodamine-labeled goat anti-rabbit IgG (red).

Aggregates in the lysosomes of senescent cells are known as lipofuscin and consist of undigested lipids, proteins, and cations. They can be detected using a dye derived from Sudan Black-B in tissue and in vitro 6 (PMID: 24848057).

Figure 4. Immunohistochemical analysis of paraffin-embedded human liver tissue slide using 27102-1-AP (LIMPII Antibody) at dilution of 1:200 (under 40x lens).

The change in gene expression in senescence leads to a senescence-associated secretory phenotype, where there is an increase in the expression of a number of soluble factors, including interleukins like IL-6, chemokines like IL-8, and growth factors like VEGF 7 (PMID: 27797960). There is also an increase in certain non-soluble factors such as nitric oxide. The SASP affects surrounding tissue and may be able to induce senescence in nearby cells.

Figure 5. Immunohistochemical analysis of paraffin-embedded human tonsillitis tissue slide using 21865-1-AP (IL-6 antibody) at dilution of 1:200 (under 40x lens). Heat mediated antigen retrieved with Tris-EDTA buffer (pH9).

Using a combination of different biomarkers alongside each other is the best way to demonstrate senescence, while investigating it in the context of diseases provides the opportunity to bring together the different roles of this process and unite the research in this area.


REVIEW article

Jing Liu 1,2† , Yue Ding 3† , Zhongmin Liu 1,2* and Xiaoting Liang 1,4*
  • 1 Research Center for Translational Medicine, Shanghai East Hospital, School of Medicine, Tongji University, Shanghai, China
  • 2 Department of Cardiovascular Surgery, Shanghai East Hospital, Tongji University School of Medicine, Shanghai, China
  • 3 Department of Organ Transplantation, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, China
  • 4 Institute for Regenerative Medicine, Shanghai East Hospital, School of Life Sciences and Technology, Tongji University, Shanghai, China

Mesenchymal stem cells (MSCs) are multipotent cells capable of self-renewal and differentiation. There is increasing evidence of the therapeutic value of MSCs in various clinical situations, however, these cells gradually lose their regenerative potential with age, with a concomitant increase in cellular dysfunction. Stem cell aging and replicative exhaustion are considered as hallmarks of aging and functional attrition in organisms. MSCs do not proliferate infinitely but undergo only a limited number of population doublings before becoming senescent. This greatly hinders their clinical application, given that cultures must be expanded to obtain a sufficient number of cells for cell-based therapy. Here, we review the current knowledge of the phenotypic and functional characteristics of senescent MSCs, molecular mechanisms underlying MSCs aging, and strategies to rejuvenate senescent MSCs, which can broaden their range of therapeutic applications.


Senescence and regeneration in salamanders

Cellular senescence is a state in which cells stop dividing but remain metabolically active. Moreover, they usually express a pro-inflammatory secretome, upregulate immune ligands and are positive for specific activities such as senescence-associated b-galactosidase (SA-bgal). Cells can enter senescence after DNA damage and activation of oncogenes, for example, to prevent cell proliferation. Recently, senescence has been linked to aging and aged-related pathologies, as in many species senescent cells accumulate with aging. In mammals, our limited regenerative abilities are further compromised with age. A recent report indicates that the decline in muscle regeneration with age could be related to an increase of cellular senescence. But what happens in those other vertebrates such as amphibians capable of regenerating repetitively over most part of their lifespan? Very few studies have addressed the regulation of senescence and its relationship with regeneration in those regeneration-competent species. Now, a recent paper from the laboratory of Maximina Yun (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25942455) reports on cellular senescence during amphibian limb regeneration.

First, the authors set up a system to identify senescent cells in cell culture and tissue sections in salamanders. As senescence stops the proliferation of damaged or dysfunctional cells they use UV irradiation to induce DNA damage leading to senescence. Twelve days after irradiation about 80% of newt A1 cells entered a senescent state characterized, among others, by high levels of SA-bgal activity, sustained production of reactive oxygen species (ROS) and extended mitochondrial and lysosomal networks. Also, they acquired a secretory phenotype. In contrast to quiescent cells, these senescence ones did not re-enter the cell cycle upon serum stimulation. All these traits observed in salamander senescent cells were comparable to those previously observed in mammalian cells.

Next the authors analysed cellular senescence in vivo in normal and regenerating newts. During regeneration they observed a significant induction of cellular senescence during the intermediate stages of this process. However, the number of senescent cells decreased at later stages. Senescent cells were found at the amputation plane and within the blastema and included different cell types such as cartilage, muscle, fibroblasts and epidermal glands. Similar results were observed in axolotls, another amphibian model for regeneration. Remarkably, this induction and posterior disappearance of senescent cells was specific of regeneration, as it was not observed during normal limb development.

Salamanders can go through multiple consecutive rounds of regeneration so the authors checked the senescence response over repetitive events of amputation and regeneration. Interestingly, no accumulation of senescent cells was observed after five regeneration cycles over a period of 1.5 years. These results indicate that senescent cells were effectively eliminated during each round of regeneration. Moreover, whereas in other species, including mammals, senescent cells accumulate with age the authors found that senescent cells in heart, spleen and liver did not accumulate in older salamanders. These results suggest that some mechanism of senescent cell clearance functions in both normal and regenerating salamanders. In order to determine whether such mechanism really exists, the authors implanted either senescent cells or normal cells labelled with GFP within newt limbs and followed them over time. Implanted normal cells persisted for at least 40 days and contributed to different structures. However, 80% of the implanted senescent cells were cleared after 2 weeks. These results suggest that salamanders have an active mechanism to get rid of senescent cells. A remarkable observation done by the authors was that when a mixture of 1:1 senescent and normal cells was implanted both cell populations were cleared with time. The reason for that is that these salamander senescent cells were capable to induce senescence in the neighbour cells (a property of the senescence cells seen in other systems). The authors showed here that this effect was mediated by a paracrine factor.

Finally, the authors tried to better characterize this clearance mechanism. Based on previous results on the role of the immune system in both the clearance of senescent cells in other systems as well as in amphibian regeneration, they analysed the role of macrophages in their system. First, they saw that, in vivo, macrophages and senescent cells are in close proximity during limb regeneration. The implantation of senescent cells triggers the recruitment of macrophages to their vicinity, which was not observed when normal cells were implanted. Then, after macrophage depletion, these implanted senescent cells remained over time and were not cleared. Therefore, these results indicate that macrophages were actively involved in the clearance of senescent cells during limb regeneration.

Overall, this study shows for the first time that salamanders possess a senescence surveillance mechanism that operates during regeneration. Remarkably, senescence is strongly induced in the regenerating blastema at mid stages of regeneration. Future experiments should try to determine the biological significance of this senescence upregulation for a successful regeneration.


Probing the depths of cellular senescence

Cellular senescence is a state of irreversible cell cycle arrest that has been documented to both suppress cancer and promote aging. Although not well understood, extensive nuclear changes, including the remodeling of chromatin, take place as cells become senescent. In this issue, Ivanov et al. (2013. J. Cell Biol. http://dx.doi.org/jcb.201212110) report that chromatin fragments are released from the nuclei of senescent cells and are subsequently targeted for processing through the autophagy/lysosomal pathway.

More than 50 years ago, Leonard Hayflick and Paul Moorhead observed that fibroblasts from healthy human donors had a finite proliferation capacity in cell culture. When these cells reached their “Hayflick limit” they became irreversibly arrested, or “replicatively senescent” (Hayflick and Moorhead, 1961). A similar irreversible cell cycle arrest, now designated as “cellular senescence,” can be induced by a variety of stresses, including (but not limited to) activation of oncogenes, telomere maintenance defects, oxidative stress, and excessive DNA damage (Campisi and d’Adda di Fagagna, 2007 Collado et al., 2007 Kuilman et al., 2010).

Senescent cells are believed to be very stable over long periods of time, both in culture as well as in tissues (although evidence for the latter is very limited). In this issue, Ivanov et al. are challenging this dogma by providing evidence that senescence may be a more dynamic process than we have previously appreciated. They show that some senescent cells contain cytoplasmic chromatin fragments (CCFs) that apparently bud off from the nuclei. CCFs were found to be devoid of lamin A/C, but were highly positive for the histone variant γ-H2AX (a mark of DNA double-strand breaks) and enriched for the histone H3 lysine 27 trimethyl modification (H3K27me3 a mark of heterochromatin). They also observed down-regulation of lamin B1 and a striking loss of nuclear envelope integrity features that they speculate may permit CCF formation and release. Once in the cytoplasm, CCFs were engaged by the autophagy pathway and ultimately proteolytically degraded in lysosomes. A decrease in the nuclear content of core histones was also noted, the obvious implication being that this is causally connected with the generation and destruction of CCFs. Taken together, these results represent a challenge to the classical view of cellular senescence as a single end point, and point to a more fluid situation where important changes take place after the initial cell cycle arrest, and in all likelihood progress and evolve over extended periods of time (Fig. 1).

The concepts of “deepening” and “late” senescence have been suggested by a number of previous studies. γ-H2AX–positive DNA damage foci become very abundant as cells approach and enter senescence, but greatly diminish as the cultures are maintained for extended periods of time (Chen and Ozanne, 2006). Passos et al. (2010) proposed that a persistent DNA damage response triggers continued production of reactive oxygen species, forming a dynamic feedback loop that actively maintains a deep senescent state. De Cecco et al. (2013) reported that after cells become fully senescent by all conventional criteria, the expression of the long interspersed nuclear element (LINE) retrotransposon L1 increased dramatically during extended culture, culminating in active transposition. This is consistent with previous observations that Alu retrotransposon expression also increases in senescent cells (Wang et al., 2011). Retrotransposon transcripts are assembled in the cytoplasm with reverse transcriptase and integrase (along other essential proteins) into ribonucleoprotein particles that subsequently have to enter the nucleus in order to insert into new genomic locations. The loss of nuclear integrity observed by Ivanov et al. (2013) could be one explanation why deeply senescent cells are supportive of retrotransposition.

Depletion of core histones, without concomitant loss of DNA, has been noted to accompany aging in yeast and nematodes (Feser et al., 2010 Ni et al., 2012), and a reduction in the biosynthesis of histones was reported in human fibroblasts during entry into senescence (O’Sullivan et al., 2010). Ivanov et al. (2013) observed that steady-state levels of all core histones progressively decreased as cells were maintained in a senescent state. As a consequence, one would anticipate a decompression of chromatin and a more “open” epigenome. This view is consistent with emerging literature from multiple species and model systems, suggesting that proper maintenance of heterochromatin has anti-aging effects (O’Sullivan and Karlseder, 2012).

The loss of histones in senescent cells is, however, complicated by the fact that total nuclear protein content actually increases (De Cecco et al., 2011). Histone loss during senescence is accompanied by recruitment of high mobility group (HMG) proteins to heterochromatic foci (Funayama et al., 2006 Narita et al., 2006). It is therefore likely that the chromatin of senescent cells undergoes a transition from being packed with histones to nonhistone proteins. It will be interesting to determine the identity of these nonhistone proteins in future studies.

One perplexing observation made by Ivanov et al. (2013) is that relatively few cells exhibit CCFs, even in fully senescent cultures. Furthermore, the number of CCFs formed is also quite low, usually less than two foci per cell. Hence, CCF formation alone would not appear to represent a robust biomarker for defining deeply senescent cells. The lysosomal processing of CCFs raises the interesting issue of whether these processes in any way reinforce other known senescence phenotypes. For example, one could ask whether the proteolytically cleaved products can serve as input material to promote the senescence-associated secretory phenotype (SASP Coppé et al., 2008). It would also be of great interest to know the in vivo occurrence of CCFs, examining a variety of tissues, ages, or pathological states.

It is currently unclear whether the low frequency of CCFs may be explained by a dynamic steady state, where cells continuously produce and turn over CCFs (like a conveyor belt), or if CCF formation occurs only in a distinct subpopulation of senescent cells. However, given that CCFs appear to contain DNA as well as histones, neither alternative readily explains the relative stability of nuclear DNA levels in the face of significantly declining levels of core histones. It may be that histones can also be depleted by a CCF-independent process. Further characterization of the CCFs, their content, and turnover should shed light on these issues.

Notwithstanding these uncertainties, the work of Ivanov et al. (2013) presents a picture of very substantial loss of nuclear composition and integrity, especially if extrapolated over long periods of time. It is hard to reconcile these degenerative changes with the many historical observations of the apparent long-term stability and viability of senescent cells. Recent studies have suggested that senescent cells can be manipulated to regain proliferative capacity by modulating the interaction with the extracellular matrix (Choi et al., 2011), or by reprogramming using induced pluripotent stem cell (iPSC) technologies (Lapasset et al., 2011). At face value, one would surely expect the processes described by Ivanov et al. (2013) to have profoundly negative effects on cell survival, and make cell cycle reentry unlikely for cells that have entered deeper stages of senescence.

It will also be important to develop a coherent nomenclature for describing the apparently dynamic state of cellular senescence. The classical criterion of irreversible proliferation arrest thus likely represents only an early, or “shallow” step in the process. These shallow steps may not even be necessary, given a recent report that differentiated, postmitotic cells can acquire some features of senescence (Jurk et al., 2012). It has been speculated that “senescent after differentiation” (SAD) cells may significantly affect the development of a variety of age-related diseases in humans (Naylor et al., 2013).

In a more mechanistic vein, it will be critically important to define the molecular and cellular markers of a deeply senescent cell versus an early senescent cell. Furthermore, it will be necessary to determine the chronology, and most importantly functional relevance, of these steps during the “deepening” process. Such knowledge would address the possibility of turning back cells, at specific points during the progression of senescence, into potentially normally functioning cells. It will also be relevant to compare these features in vitro and in vivo. For example, if “deepening” is observed in vivo, do the markers of this process vary between tissues and organisms? Do they vary between oncogene-induced senescence and other forms? There are obviously many, many interesting questions to investigate, but Ivanov et al. (2013) have provided us with an intriguing first look into where these paths may take us.


Assista o vídeo: VI Curso de Férias - Minicurso 2 Cultura Celular. Mileni Rodrigues (Dezembro 2022).