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Curva padrão em tempo real

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Ao realizar uma curva padrão para alguns novos primers para testar a alteração da dobra, é necessário executar a curva padrão? Quer dizer, caso seu experimento tenha vários genótipos para o mesmo fundo de ecótipo, com controle e tratamentos correspondentes, devo executar as curvas padrão para todos esses cenários, ou melhor, posso escolher, apenas para dizer um genótipo aleatório dos tratados, ver que R = 0,99 é ou superior e eficiência 2? É para não desperdiçar material.


Faça a curva padrão uma vez para cada par de primer para determinar a eficiência. Você pode usar os valores de eficiência para qualquer número de réplicas com qualquer modelo.

Acho que discutimos um pouco esse assunto em seu post anterior.


Efeito do modelo na geração de uma curva padrão para quantificação absoluta de um vírus de RNA por reação em cadeia da polimerase-transcriptase reversa em tempo real

O efeito de diferentes modelos na geração de curvas padrão que são necessárias para a quantificação absoluta de um vírus de RNA por transcriptase reversa em tempo real-PCR (RT-PCR) foi avaliado. Usamos o vírus da necrose pancreática infecciosa (IPNV), um importante patógeno viral do salmão selvagem e cultivado, como um exemplo de vírus de RNA para o estudo. Uma série de diluição de quatro modelos diferentes que representam o gene da protease de IPNV (dois RNAs transcritos in vitro de 100 bases e 500 bases de comprimento, um DNA de plasmídeo e um oligo de DNA) foram usados ​​como modelo para produzir curvas padrão para quantificar a carga de IPNV em truta arco-íris . A inclinação, a qualidade do ajuste (r (2)) e a eficiência (e) da PCR foram estatisticamente equivalentes, independentemente da natureza do modelo usado na PCR. Usando uma ANOVA fatorial, nenhuma diferença significativa no número de cópias do IPNV foi observada usando as quatro curvas padrão diferentes para quantificação absoluta do IPNV em truta arco-íris experimentalmente desafiada. No entanto, quando a abundância do transcrito IPNV era inferior a 100 cópias por reação e quando o tamanho do modelo era maior do que o tamanho do amplicon, a amplificação era mais variável. Os dados sugerem que o tamanho do modelo usado para gerar a curva padrão deve ser muito semelhante ao tamanho do amplicon. Um molde de oligo de DNA sintético seria ideal para esse propósito, pois pode ser feito sob medida e requer apenas as informações da sequência para sua síntese. No entanto, se a curva padrão for gerada com o número de cópias do modelo em excesso de 100 cópias por reação, a natureza do modelo não tem efeito sobre a curva padrão e, portanto, o modelo mais barato seria a escolha preferida de modelo sobre os outros mais opções caras.


Um método baseado em curva padrão para processamento de dados de PCR em tempo real relativo

Fundo: Atualmente, a PCR em tempo real é o método mais preciso para medir a expressão gênica. O método gera uma grande quantidade de dados numéricos brutos e o processamento pode influenciar notavelmente os resultados finais. O processamento de dados é baseado em curvas padrão ou na avaliação da eficiência do PCR. No momento, a abordagem de eficiência de PCR é preferida em PCR relativa, enquanto a curva padrão é frequentemente usada para PCR absoluta. No entanto, não há barreiras para empregar curvas padrão para PCR relativa. Este artigo fornece uma implementação do método da curva padrão e discute suas vantagens e limitações na PCR em tempo real relativo.

Resultados: Projetamos um procedimento para processamento de dados em PCR em tempo real relativo. O procedimento evita completamente a avaliação da eficiência da PCR, minimiza o envolvimento do operador e fornece uma avaliação estatística da variação intra-ensaio. O procedimento inclui as seguintes etapas. (I) O ruído é filtrado das leituras de fluorescência bruta por suavização, subtração da linha de base e normalização da amplitude. (II) O limite ideal é selecionado automaticamente a partir dos parâmetros de regressão da curva padrão. (III) Os pontos de cruzamento (CPs) são derivados diretamente das coordenadas dos pontos onde a linha de limiar cruza os gráficos de fluorescência obtidos após a filtragem de ruído. (IV) As médias e suas variâncias são calculadas para CPs em réplicas de PCR. (V) Os resultados finais são derivados das médias dos PCs. As variações dos CPs são atribuídas aos resultados pela lei de propagação do erro. Uma descrição detalhada e uma análise desse processamento de dados são fornecidas. As limitações associadas ao uso de métodos estatísticos paramétricos e normalização de amplitude são analisadas especificamente e consideradas adequadas à prática laboratorial de rotina. Diferentes opções são discutidas para agregação de dados obtidos de vários genes de referência.

Conclusão: Um procedimento baseado em curva padrão para processamento de dados PCR foi compilado e validado. Ele ilustra que o design da curva padrão permanece uma alternativa confiável e simples para os cálculos baseados na eficiência de PCR em PCR em tempo real relativo.


9 Exemplos de Distribuição Normal da Vida Real

A distribuição normal é amplamente usada para compreender as distribuições de fatores na população. Como a distribuição normal se aproxima tão bem de muitos fenômenos naturais, ela se tornou um padrão de referência para muitos problemas de probabilidade.

A distribuição normal / gaussiana é um gráfico em forma de sino que engloba dois termos básicos - média e desvio padrão. É um arranjo simétrico de um conjunto de dados em que a maioria dos valores se agrupa na média e o restante diminui simetricamente em direção a qualquer um dos extremos. Vários fatores genéticos e ambientais influenciam a característica.

Teorema do limite central

A distribuição normal segue a teoria do limite central, que afirma que vários fatores independentes influenciam um traço particular. Quando todos esses fatores independentes contribuem para um fenômeno, sua soma normalizada tende a resultar em uma distribuição gaussiana.

Curva Normal

A média da distribuição determina a localização do centro do gráfico, e o desvio padrão determina a altura e largura do gráfico e a área total sob a curva normal é igual a 1.

Vamos entender os exemplos de distribuição normal da vida diária.

1. Altura

A altura da população é um exemplo de distribuição normal. A maioria das pessoas em uma população específica tem altura média. O número de pessoas mais altas e mais baixas do que a média de pessoas é quase igual, e um número muito pequeno de pessoas é extremamente alto ou extremamente baixo. No entanto, a altura não é uma característica única, vários fatores genéticos e ambientais influenciam a altura. Portanto, segue a distribuição normal.

2. Lançamento de dados

Um lançamento justo de dados também é um bom exemplo de distribuição normal. Em um experimento, descobriu-se que quando um dado é lançado 100 vezes, as chances de obter & # 82161 & # 8217 são de 15-18% e se jogarmos os dados 1000 vezes, a chance de obter & # 82161 & # 8217 é, novamente, o mesmo, que é em média 16,7% (1/6). Se lançarmos dois dados simultaneamente, existem 36 combinações possíveis. A probabilidade de rolar & # 82161 & # 8217 (com seis combinações possíveis) novamente é em média em torno de 16,7%, ou seja, (6/36). Mais o número de dados mais elaborado será o gráfico de distribuição normal.

3. Jogando uma moeda

Jogar uma moeda é um dos métodos mais antigos de resolução de disputas. Todos nós jogamos uma moeda antes de uma partida ou jogo. A justiça percebida em jogar uma moeda reside no fato de que ela tem chances iguais de chegar a qualquer um dos resultados. As chances de obter cara são 1/2, e o mesmo é para coroa. Quando adicionamos ambos, é igual a um. Se jogarmos moedas várias vezes, a soma da probabilidade de obter cara e coroa sempre permanecerá 1.

4. QI

Nesse cenário de competição crescente, a maioria dos pais, assim como dos filhos, deseja analisar o nível do Quociente Inteligente. Bem, o QI de uma determinada população é uma curva de distribuição normal, onde o QI da maioria das pessoas da população está na faixa normal, enquanto o QI do resto da população está na faixa desviada.

5. Mercado de Ações Técnico

A maioria de nós já ouviu falar da alta e da queda dos preços das ações na bolsa de valores.

nossos pais ou nas notícias sobre queda e aumento no preço das ações. Essas mudanças nos valores de log das taxas de câmbio, índices de preços e retornos dos preços das ações costumam formar uma curva em forma de sino. Para os retornos das ações, o desvio padrão costuma ser chamado de volatilidade. Se os retornos forem normalmente distribuídos, espera-se que mais de 99% dos retornos caiam dentro dos desvios do valor médio. Essas características da distribuição normal em forma de sino permitem que analistas e investidores façam inferências estatísticas sobre o retorno esperado e o risco das ações.

6. Distribuição de renda na economia

A renda de um país está nas mãos de políticos e governos duradouros. Depende deles como distribuem a renda entre a comunidade rica e pobre. Todos nós sabemos muito bem que a população de classe média é um pouco maior do que a população rica e pobre. Portanto, os salários da população de classe média constituem a média na curva de distribuição normal.

7. Tamanho do sapato

Você já se perguntou o que teria acontecido se o sapatinho de cristal deixado por Cinderela na casa do príncipe # 8217 se encaixasse nos pés de outra mulher? Ele teria acabado se casando com outra mulher. Tem sido uma das suposições divertidas com que todos nós já nos deparamos. De acordo com os dados coletados nos EUA, as vendas de calçados femininos por tamanho são normalmente distribuídas porque a composição física da maioria das mulheres é quase a mesma.

8. Peso ao Nascer

O peso normal ao nascer de um recém-nascido varia de 2,5 a 3,5 kg. A maioria dos recém-nascidos tem peso normal ao nascer, enquanto apenas uma pequena porcentagem de recém-nascidos tem peso maior ou menor do que o normal. Assim, o peso ao nascer também segue a curva de distribuição normal.

9. Relatório de média do aluno e # 8217s

Hoje, as escolas estão divulgando suas apresentações nas redes sociais e na TV. Eles apresentam o resultado médio de sua escola e atraem os pais para que seus filhos sejam matriculados nessa escola. As autoridades escolares calculam o desempenho acadêmico médio de todos os alunos e, na maioria dos casos, segue a curva de distribuição normal. O número de alunos inteligentes médios é maior do que a maioria dos outros alunos.


SYBR Green qPCR com protocolo de curva padrão

Este protocolo é baseado em experiências usando a máquina StepOnePlus e tem como objetivo ajudar os usuários a gerar resultados qPCR significativos.

Procedimento

Passo 1: Purificação de RNA

Use o kit apropriado disponível no mercado dependendo da espécie e tipo de amostra (células / tecido / sangue de mamíferos, levedura, planta). Siga o protocolo cuidadosamente, sendo ultra cauteloso quanto à contaminação com RNAses. Não toque em nada com as mãos desprotegidas, troque de luvas com frequência, limpe a bancada e o equipamento com spray de remoção de RNAse disponível no mercado (por exemplo, RNAse Away # 038184, MBP). Todos os plásticos de desgaste (pontas de pipeta, tubos de polipropileno de 1,5 mL, etc.) devem ser adquiridos "sem RNAse". Não autoclave tubos de plástico antes de usar. Em geral, é uma boa ideia ter um bom suprimento de água livre de RNAse antes de começar.

Etapa 2: Avalie a quantidade e qualidade do RNA purificado

Após a etapa final de purificação de RNA usando um dos kits acima, pegue uma pequena alíquota (5-10ul) de RNA para teste de qualidade. Transfira esta alíquota para um novo tubo livre de RNAse e armazene o resto da amostra a -80C. Determine a concentração (ng / ul) de seu RNA purificado usando uma máquina de nanogotas ou equivalente. Você terá que limpar a máquina com a mesma solução (geralmente água sem RNAse) que você usou para eluir o RNA na etapa final do procedimento de purificação do RNA. Em geral, você estará interessado principalmente na concentração da máquina de nanogotas, mas alguns dos outros valores podem fornecer algumas informações sobre a contaminação com proteínas ou solventes que podem ser úteis. Por exemplo, uma razão de 260 nm para 280 nm de pelo menos 2,0 é considerada relativamente livre de proteínas e solventes. Da mesma forma, a proporção de 260 nm para 230 nm é geralmente de 2,0 a 2,2 e valores mais baixos podem indicar a presença de carboidratos ou solventes.

Para testes de qualidade, você pode executar um gel de RNA ou usar um Agilent Bioanalyzer ou máquina equivalente para calcular quantitativamente a proporção entre 28S e 18S RNA para determinar se houve degradação (ou contaminação por RNAse).

Mesmo que seu software de aquisição de imagem não permita o cálculo de intensidades de banda, você pode gerar valores 28S: 18S razoavelmente bons usando o software ImageJ. Para fazer isso, abra seu arquivo de imagem com ImageJ, desenhe uma caixa retangular em uma área vazia / preta e clique em Analisar-Medir. Este é o seu valor de fundo que você subtrairá dos valores 28S e 18S. Em seguida, arraste a caixa para a banda 28S, clique em Analisar-Medir e repita para a banda 18S (Figura 2).

Você também pode usar a função de perfil ImageJ Analyze-Plot para gerar um histograma mostrando as quantidades 28S e 18S relativas e a degradação (Figura 3).

Se estiver usando o Agilent Bioanalyzer, você contará com a proporção 28S: 18S e seu número de integridade de RNA (RIN). Eles descrevem as duas medidas neste documento:

O Agilent Bioanalyzer usa uma abordagem microfluídica para avaliar a qualidade do RNA, mas o princípio é razoavelmente semelhante ao descrito acima. A Figura 4 mostra alguns resultados de amostra.

Para muitas aplicações, é melhor usar apenas RNA com 28S: 18S & gt1.5 e RIN & gt8.0.

Etapa 3: Síntese da primeira cadeia (produção de cDNA)

Começando com o RNA que você tem armazenado a -80 ° C (Etapa 2), siga o protocolo do kit de síntese de cDNA de sua escolha. Esses kits geralmente requerem de 1 ng a 5ug de RNA. Consulte as concentrações de nanogotas obtidas na Etapa 2 e execute a síntese da primeira cadeia em quantidades iguais (ng) de RNA para todas as suas amostras. Você precisará equalizar os volumes com água livre de RNAse.

Depois de concluir o protocolo associado ao kit escolhido, é recomendável limpar o cDNA com um kit disponível comercialmente (por exemplo. Qiaquick PCR clean-up da Qiagen ou NucleoSpin Gel e PCR Clean-up da MACHEREY-NAGEL para remover oligômeros residuais e a transcriptase reversa. Dilua suas amostras de cDNA pelo menos 1: 5 em água livre de RNAse, pegue uma pequena alíquota (10ul-20ul) de cada uma e armazene as amostras de cDNA restantes a -20C ou -80C até precisar delas.

Passo 4: Testando seus primers qPCR

Se você comprou primers disponíveis comercialmente ou criou seus próprios usando nosso protocolo Projete seus próprios primers qPCR, é importante testar os primers usando suas amostras, seu SYBR Green Master Mix e sua máquina qPCR para ter certeza de que está amplificando um único amplicon e que é a sequência adequada para o mRNA que você está tentando medir.

* Observe sempre confirmar se o master mix qPCR é compatível com a máquina qPCR que você usará

Procedimento para preparar a placa qPCR para o teste inicial de primers qPCR

1) Começando com as pequenas alíquotas de 10-20ul que você tirou no final da Etapa 3 acima, crie um único pool de todas as suas amostras de cDNA para este propósito de teste do Primer qPCR. Faça uma série de diluições (1: 5) a partir deste pool de modo que você possa ver onde seus valores de Ct estão na faixa mensurável. Deve ser suficiente ter as seguintes concentrações:

2) A solução estoque do par de primers (Forward and Reverse) deve estar na concentração de 10 uM.

3) Prepare uma master mix de SYBR Green Master Mix (2X) e primers (0,4uM).

4) Misture brevemente e pipete 10ul em cada poço da placa qPCR. Para evitar bolhas, empurre o êmbolo do pipetador para a posição de ejeção antes de coletar a mistura. A ponta da pipeta agora conterá mais de 10ul, mas só ejetará 10ul (e sem bolhas) se você parar no primeiro ponto de resistência e ejetar diretamente para o fundo do poço. Adicione 10ul a todos os poços que usará.

5) Use uma ponta de pipeta separada para cada poço e adicione 10ul de amostra (devidamente diluída com água) diretamente na SYBR Green Master Mix contendo os primers. Misture pipetando para cima e para baixo uma ou duas vezes. Não use a função de ejeção do pipetador para esta etapa. Sempre execute também um controle negativo (master mix, primers e água) para que você possa testar a presença, temperatura de fusão, etc. de dímeros de primer.

6) Sele seu prato com vedações ópticas qPCR e inicie a execução do qPCR em sua máquina qPCR. Se o software da sua máquina permite que você escolha, você deve indicar que está usando reagentes SYBR Green (não Taqman), que deseja o protocolo longo (não o protocolo Fast), que está usando um método delta-delta Ct e que você deseja incluir a determinação da curva de fusão. Se você for forçado a escolher um gene de referência e uma amostra de referência, escolha qualquer um, pois você está apenas testando seus primers qPCR.

Após a execução do qPCR, use o software para avaliar os resultados, mas guarde a placa a 4C para a etapa 5.

Curvas de fusão (especificidade de teste)

Usando o software da máquina qPCR, observe as curvas de fusão para cada par de primer sendo testado para ver se há um único pico de temperatura. A Figura 5 mostra alguns exemplos de curvas de fusão boas e ruins.

Gráficos de amplificação (encontrando o intervalo linear)

Em seguida, usando o software da máquina qPCR, observe as curvas de amplificação para cada uma das diluições 1: 1, 1: 5, 1:25, 1: 125 preparadas acima, juntamente com a do controle negativo. Cada alteração de 1 unidade no Ct deve representar uma diferença de 2 vezes no material inicial, então você deve ver uma mudança em direção a valores de Ct mais altos com amostras mais diluídas. O que você precisa observar aqui é a forma da curva. As amostras muito concentradas podem ter uma curva de amplificação em forma de S, enquanto as amostras muito diluídas podem não ter nenhuma curva ou ter valores de Ct muito altos (Figura 6).

Com base nos resultados desta análise, você saberá em que grau (1: 1, 1: 5, 1:25 ou 1: 125) você precisará diluir seu cDNA antes de usar este par de primer para ver estes C- curvas em forma quando você executa a Etapa 7.

Etapa 5: Sequenciamento Sanger do Produto e Geração da Curva Padrão

Agora, começando com a placa qPCR completa / selada que você armazenou a 4C, purifique o DNA com um kit disponível comercialmente (por exemplo. Qiaquick PCR clean-up da Qiagen ou NucleoSpin Gel e PCR Clean-up da MACHEREY-NAGEL). Determine a concentração (ng / ul) de seu DNA purificado usando uma máquina de nanogotas ou equivalente. Você terá que limpar a máquina com a mesma solução (geralmente água sem DNAse) usada para eluir o DNA na etapa final do procedimento de purificação do DNA.Registre esta concentração, que será muito importante para você saber a verdadeira abundância (ng) do produto de PCR que você está usando ao gerar sua curva padrão. Envie uma pequena alíquota do produto de PCR purificado e o primer direto ou reverso para uma empresa que realiza o sequenciamento Sanger como um serviço, seguindo cuidadosamente as instruções relativas à amostra e concentração do primer. Os custos são geralmente de 5 EUR / sequência. Quando eles lhe enviam, os resultados confirmam que o produto amplificado é de fato o gene de interesse. Você também pode olhar para o produto purificado em um gel de DNA de agarose corado com EtBr para ter certeza de que há uma única banda no peso molecular previsto, mas o sequenciamento geralmente é suficiente.

Para gerar a curva padrão, diluir o produto de PCR sequenciado acima de 1: 100 em tampão TE 1X, pH 7,5 com DNA de espermatozóide de salmão cortado 10ug / ml. Por exemplo, adicione 10 ul do produto de PCR purificado a 990 ul de tampão. Em seguida, execute uma série de diluições 1:10 no mesmo tampão para preparar os padrões: 1:10 3, 1:10 4, 1:10 5, 1:10 6 e 1:10 7. Recomenda-se fazer pelo menos 500ul de cada padrão e armazená-los a -20C ou -80C para uso futuro.

* Nota: Ao manusear estes produtos de PCR amplificados, é muito provável que você contamine o seu pipetador. Use pontas de filtro e considere pedir emprestado o pipetador de seu vizinho para esta etapa.

Etapa 6: Avaliando a eficiência de seu qPCR

Agora que você gerou sua curva padrão, pode testar essas amostras usando sua máquina qPCR. Usando exatamente o mesmo procedimento da etapa 4, execute qPCR em seus padrões, cada um em triplicado. Sua máquina pode permitir que você insira as quantidades reais (ng) de cada padrão, que você deve saber com base nos resultados da nanodrop na etapa 5.

Uma boa curva padrão é mostrada na Figura 7.

Ao avaliar seus padrões (1:10 3, 1:10 4, 1:10 5, 1:10 6 e 1:10 7), você pode descobrir que alguns não estão em linha com os outros porque são muito diluídos ou muito concentrado. Você pode eliminá-los da análise e encontrar os melhores 3 ou 4 padrões para o seu ensaio. Em geral, os padrões não sofrem com o fenômeno da curva em forma de S descrito na Figura 6, e uma faixa linear pode até se estender em valores Ct em torno de 10 (Figura 7). Se depois de descartar esses outliers sua curva padrão ainda tiver um valor de R 2 inaceitável, você provavelmente precisará refazer a curva padrão, tomando mais cuidado para misturar bem cada diluição antes de passar para a próxima diluição. Uma eficiência com mais de 100% pode indicar problemas mais significativos, no entanto, e pode exigir que você projete um novo par de primer.

Etapa 7: Executando qPCR em suas amostras

Agora você está pronto para executar qPCR nas amostras de cDNA que armazenou congeladas desde o final da Etapa 3.

Procedimento para preparar a placa qPCR para qPCR em suas amostras

1) Começando com o cDNA diluído 1: 5 que você congelou no final da Etapa 3 acima, dilua todas as amostras apropriadamente (1: 1, 1: 5, 1:25 ou 1: 125) de acordo com os resultados obtidos na Etapa 4. Você pode pré-diluir todo o seu cDNA restante para esta diluição, mas você deve estar ciente de que alguns pares de primers fornecerão curvas de amplificação significativamente diferentes do que outros. Se você estiver trabalhando com uma transcrição muito abundante (por exemplo, a de GAPDH), por exemplo, você pode diluir demais seu cDNA, de modo que não será capaz de detectar transcrições menos abundantes.

2) A solução estoque do par de primers (Forward and Reverse) deve estar na concentração de 10 uM.

3) Prepare uma master mix de SYBR Green Master Mix (2X) e primers (0,4uM).

4) Misture brevemente e pipete 10ul em cada poço da placa qPCR. Para evitar bolhas, empurre o êmbolo do pipetador para a posição de ejeção antes de coletar a mistura. A ponta da pipeta agora conterá mais de 10ul, mas só ejetará 10ul (e sem bolhas) se você parar no primeiro ponto de resistência e ejetar diretamente para o fundo do poço. Adicione 10ul a todos os poços que usará.

5) Use uma ponta de pipeta separada para cada poço e adicione 10ul de amostra (devidamente diluída com água) diretamente na SYBR Green Master Mix contendo os primers. Misture pipetando para cima e para baixo uma ou duas vezes. Não use a função de ejeção do pipetador para esta etapa. As amostras devem ser analisadas em pelo menos triplicado. Sempre execute também um controle negativo (master mix, primers e água) para que você possa testar a presença, temperatura de fusão, etc. de dímeros de primer. Na mesma placa também carregue sua curva padrão em duplicata ou triplicata.

6) Sele seu prato com vedações ópticas qPCR e inicie a execução do qPCR em sua máquina qPCR. Se o software da sua máquina permite que você escolha, você deve indicar que está usando reagentes SYBR Green (não Taqman), que deseja o protocolo longo (não o protocolo Rápido), que está usando um método de curva padrão e que você deseja incluir a determinação da curva de fusão.

A máquina qPCR produzirá resultados de PCR quantitativos significativos e informará as quantidades reais (ng) de sua transcrição em cada amostra. Você terá certeza da sequência, especificidade e linearidade do ensaio.

Notas legais:

StepOnePlus é uma marca registrada da Applied Biosystems. NanoDrop é uma marca registrada da NanoDrop Technologies, Inc. TaqMan é uma marca comercial da Roche Molecular Systems, Inc. RNase AWAY é uma marca comercial registrada da Molecular Bio-Products, Inc. Qiaquick é uma marca comercial registrada do Grupo QIAGEN. NucleoSpin & reg é uma marca registrada da MACHEREY-NAGEL. SYBR é uma marca registrada da Molecular Probes, Inc. As marcas registradas de outras partes são propriedade de seus respectivos proprietários e devem ser tratadas como tal.

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Recursos do software CFX Maestro

Todos os sistemas de detecção de PCR em tempo real da Bio-Rad incluem o software CFX Maestro poderoso e fácil de usar. Com um software para todos os quatro sistemas, você pode facilmente abrir e ler arquivos de qualquer um dos instrumentos, colaborar com outros pesquisadores e mudar para outro sistema sem aprender a usar um novo software.

Semelhante a outro software de PCR em tempo real, o software CFX Maestro oferece vários módulos de análise, incluindo quantificação, curva de fusão, expressão gênica, discriminação alélica e análises de ponto final. Um exemplo de como analisar um experimento de expressão gênica no software CFX Maestro é mostrado abaixo.

Prepare o prato & mdash indicam a posição do desconhecido, nenhum controle de modelo (NTCs) e amostras da curva padrão na placa (Figura 1). Isso pode ser feito antes, durante ou depois de uma corrida.

Fig. 1. Configuração da placa na janela Editor de placas.

Analise os dados & mdash, um arquivo de dados é gerado automaticamente após uma execução com o módulo de expressão genética. Visualize facilmente até seis gráficos ou tabelas diferentes, como gráfico de amplificação, curva padrão, gráfico de expressão gênica, layout de placa ou pico de fusão com a guia Visualização de dados personalizados (Figura 2). Verifique a eficiência e R 2 da curva padrão. A eficiência deve estar dentro de 90 & ndash110% e o R 2 deve ser & gt0.990. Se esses valores estiverem fora do intervalo, você precisará solucionar o problema do seu experimento.

Fig. 2. Janela Custom Data View.

Exportar resultados para publicação & mdash Exporte rapidamente quaisquer gráficos ou tabelas clicando com o botão direito na janela e selecionando Salvar imagem como (Figura 3) ou Exportar para Excel (Figura 4). Você também pode criar relatórios ou arquivos de linguagem de marcação de dados PCR em tempo real (RDML) para importação rápida para o software qbase +.

Fig. 3. Selecione Salvar imagem como na janela de análise de dados.

Fig. 4. Selecione Exportar para Excel na janela de análise de dados.


Cy0 - Um novo método de quantificação qPCR

Fundo: A PCR em tempo real tornou-se recentemente a técnica de escolha para quantificação absoluta e relativa de ácidos nucléicos. O método de quantificação do padrão ouro em PCR em tempo real assume que as amostras comparadas têm eficiência de PCR semelhante. No entanto, muitos fatores presentes nas amostras biológicas afetam a cinética da PCR, confundindo a análise de quantificação. Neste trabalho propomos uma nova estratégia para detectar amostras outlier, chamada SOD.
Resultados: A função de Richards foi ajustada em leituras de fluorescência para parametrizar as curvas de amplificação. Não houve uma correlação significativa entre os parâmetros de amplificação calculados (platô, inclinação e coordenada y do ponto de inflexão) e o Log de DNA de entrada, demonstrando que esta abordagem pode ser usada para obter uma "impressão digital" para cada curva de amplificação. Para identificar as execuções atípicas, os parâmetros calculados de cada amostra desconhecida foram comparados aos das amostras padrão. Quando uma subestimação significativa das moléculas de DNA iniciais foi encontrada, devido à presença de inibidores biológicos, como ácido tânico, IgG ou quercitina, SOD marcou de forma eficiente esses perfis de amplificação como outliers. O SOD foi subsequentemente comparado com o KOD, a abordagem atual baseada na estimativa da eficiência do PCR. Os dados obtidos mostraram que SOD foi mais sensível que KOD, enquanto SOD e KOD foram igualmente específicos.

Conclusão: Nossos resultados demonstraram, pela primeira vez, essa detecção de outlier pode ser baseada na forma de amplificação em vez da eficiência de PCR. SOD representa uma melhoria na análise de PCR em tempo real porque diminui a variância dos dados, aumentando assim a confiabilidade da quantificação.

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Nos últimos anos, a reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (PCR em tempo real) tornou-se a técnica de escolha para quantificação absoluta ou relativa da expressão gênica devido à sua rapidez, precisão e sensibilidade [1-3].
Além disso, avanços recentes no sequenciamento do genoma humano, perfil de expressão de mRNA e miRNA de vários tipos de câncer, identificação de polimorfismo associado a doenças e a expansão da disponibilidade de informações de sequência genômica para patógenos humanos levaram a um crescimento acentuado no diagnóstico molecular [4-6 ]
O método de quantificação do padrão ouro (método Ct) em PCR em tempo real assume que as amostras comparadas têm eficiências de PCR semelhantes. No entanto, a quantificação por PCR em tempo real é muito sensível a pequenas diferenças na eficiência da PCR entre as amostras. De fato, uma pequena diferença de 5% na eficiência da PCR resultará em uma diferença de três vezes na quantidade de DNA após 25 ciclos de amplificação exponencial. Muitos fatores presentes nas amostras, bem como contaminantes co-extraídos, podem inibir a PCR, confundindo a amplificação e análise do modelo [7-10]. Este é um grande problema ao trabalhar com amostras biológicas. A inibição severa levará a resultados falso-negativos, enquanto uma inibição leve a moderada pode resultar em uma subestimação da concentração de DNA da amostra afetada [11]. Além disso, a eficiência da amplificação pode oscilar em função do desenho do ensaio não ideal, da instabilidade da enzima ou da presença de inibidores [12]. Embora uma variedade de métodos tenham sido desenvolvidos para quantificar o DNA modelo [11, 13-17], muito poucos permitem a avaliação simultânea da quantidade e qualidade do modelo sem a adição de um controle interno positivo que é co-amplificado com o alvo de interesse. Assim, Bar e colaboradores propuseram um método (denominado KOD) baseado no cálculo da eficiência da amplificação para a detecção precoce de condições de ensaio não ótimas [18, 19]. Essa abordagem é extremamente direta e eficaz, mas é baseada em um cálculo de eficiência de amplificação por PCR para o qual ainda não existe um método totalmente aceito pela comunidade científica. Um grande número de estudos tentou calcular a eficiência da amplificação, assumindo que a PCR é inerentemente exponencial por natureza. Com base na suposição da região de log-linearidade, a eficiência de amplificação constante é calculada a partir da inclinação da regressão linear nessa janela [20, 23]. Uma abordagem alternativa é baseada na observação de que a trajetória do PCR pode ser modelada de forma eficaz pela função sigmóide [14, 24], permitindo que a eficiência do PCR seja estimada usando o ajuste de regressão não linear [15, 25, 26]. Recentemente, uma abordagem simplificada chamada "regressão linear de eficiência" nos permitiu estimar a eficiência da amplificação aplicando a análise de regressão linear às leituras de fluorescência na região central do perfil de amplificação [27]. Notavelmente, foi demonstrado que as estimativas de eficiência de PCR variam amplamente de acordo com a abordagem que foi adotada [28].
Muito recentemente, Tichopad et al. [29] introduziram um novo teste de controle de qualidade para PCR quantitativo neste procedimento, o máximo da primeira derivada e o máximo da segunda derivada foram estimados usando um ajuste logístico na trajetória da PCR. Esta abordagem permitiu monitorar a primeira metade da curva usando dois parâmetros. Nosso estudo tem como objetivo desenvolver uma ferramenta de teste de qualidade, que não se baseie na estimativa da eficiência de amplificação, a fim de detectar amostras que não apresentem uma cinética de amplificação semelhante à das amostras padrão. Neste trabalho, um ajuste não linear da equação de Richards foi usado para parametrizar perfis de amplificação de PCR a partir de um grande conjunto de amostras. O cálculo subsequente da variância dos parâmetros estimados e o desenvolvimento de uma medida estatística baseada na distância de Mahalanobis nos permitiu desenvolver o método SOD (Scinética baseada em hape Omais completo Detecção). A análise SOD de amplificações inibidas e a comparação deste método com KOD foram investigadas em detalhes.

PCR quantitativo em tempo real

O padrão de DNA consistia em um plasmídeo pGEM-T (Promega) contendo um fragmento de 104 pb do gene mitocondrial NADH desidrogenase 1 (MT-ND1) como inserção. Este fragmento de DNA foi produzido pelo par de primer ND1 / ND2 (ND1 direto: 5'-ACGCCATAAAACTCTTCACCAAAG- 3 'e ND2 reverso: 5'-TAGTAGAAGAGCGATGGTGAGAGCTA- 3'). Este plasmídeo foi purificado usando o Plasmid Midi Kit (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. A concentração final do plasmídeo padrão foi estimada espectofotometricamente pela média de três réplicas de A260 determinações de absorbância.
As amplificações de PCR em tempo real foram conduzidas usando LightCycler e # 174 480 SYBR Green I Master (Roche) de acordo com as instruções do fabricante, com iniciadores de 500 nM e uma quantidade variável de padrão de DNA em um volume de reação final de 20 & # 181l. A termociclagem foi conduzida usando um LightCycler & # 174 480 (Roche) iniciada por uma incubação de 10 min a 95 & # 176C, seguido por 40 ciclos (95 & # 176C para 5 s 60 & # 176C para 5 s 72 & # 176C por 20 s) com uma única leitura fluorescente feita no final de cada ciclo .
Cada combinação de reação, nomeadamente DNA inicial e percentagem da mistura de amplificação, foi conduzida em triplicado e repetida em quatro execuções de amplificação separadas. Todas as execuções foram concluídas com uma análise da curva de fusão para confirmar a especificidade da amplificação e a falta de dímeros de primer. Ct (método do ponto de ajuste) e Cp (método da segunda derivada) os valores foram determinados pelo LightCycler & # 174 480 versão 1.2 do software e exportado para uma planilha de dados do MS Excel (Microsoft) para análise após a subtração do fundo (disponível como arquivo adicional 1). Para Ct (método de ponto de ajuste) avaliação um limiar de fluorescência manualmente definido para 0,4 foi usado para todas as execuções.

Estimativa de eficiência de PCR

Os dados de PCR brutos foram usados ​​para calcular a eficiência da amplificação. A eficiência do PCR para cada amostra individual foi derivada da inclinação da linha de regressão na janela de linearidade [20]. A correção da linha de base e a janela de identificação da linearidade foram realizadas usando a última versão do LinRegPCR [23]. As eficiências de PCR foram estimadas a partir de quatro conjuntos de amostras: curvas de amplificação padrão, curvas de amplificação padrão adicionadas de leituras de ácido tânico, curvas de amplificação padrão adicionadas de leituras de IgG e curvas de amplificação padrão adicionadas de leituras de quercitina. A janela de linearidade calculada de todos os conjuntos de meandata abrangeu o limiar de fluorescência de 0,4 escolhido para a análise quantitativa.

Modelo matemático de KOD

O modelo matemático de KOD, baseado na eficiência, foi proposto por Bar et al. [18]. Resumidamente, isso foi feito comparando a eficiência de PCR de uma amostra (xefa) com as eficiências das amostras da curva padrão. Uma amostra de teste é classificada como outlier se |z| & gt 1,96 com > - mu _ < emph>> < sigma _ < emph> > > , Onde & microefa é a média de eficiência e σefa é o desvio padrão da eficiência das amostras da curva padrão. Alternativamente, deve-se considerar que a estatística < left ( frac ight )^2 > is distributed as a c ² with one degree of freedom if c ² > 3.84, we can reject the null hypothesis at a = 0.05. c IE7 Mozilla c ²Chrome c -->

Modelo matemático de SOD

A detecção cinética de outlier com base na forma (SOD) foi baseada nas formas das curvas de amplificação. A fim de ajustar os dados brutos de fluorescência, o ajuste de regressão não linear da função de Richards de 5 parâmetros, uma extensão da curva de crescimento logístico, foi usado [11, 25]:

Eq. 1
Onde x é o número do ciclo, Fx é a fluorescência da reação no ciclo x, Fmax é a fluorescência máxima da reação, Fb é a fluorescência da reação de fundo e b, c e d representa os coeficientes estimados. Regressões não lineares para funções de Richards de 5 parâmetros foram realizadas determinando estimativas de mínimos quadrados não ponderados de parâmetros usando o Levenberg-Marquardt método.
Os parâmetros de forma usados ​​foram o valor de platô da curva de amplificação (Fmax), inclinação da linha reta tangente no ponto de inflexão (m) e coordenada y do ponto de inflexão (Yf) (Arquivo adicional 2).
A coordenada y do ponto de inflexão (Yf) foi calculado da seguinte forma:
Eq. 2
e a inclinação da linha reta tangente (m) foi estimado como:
Eq. 3
Distribuição normal de Fmax, Yf e m parâmetros, obtidos a partir de amostras padrão, foram verificados usando o Kolmogorov-Smirnov teste de normalidade a significância da correlação entre esses parâmetros e as concentrações de DNA de entrada, expressas como Log (DNA) foi testado com um t teste da seguinte forma:
Eq. 4
Onde r é o coeficiente de Pearson e n o tamanho da amostra (n = 72). A normalidade multivariada do conjunto de referência adotado foi avaliada de acordo com Rencher AC [30] (arquivo adicional 3). Além disso, a assimetria (Asym) das curvas de amplificação foi estimado da seguinte forma:
Eq. 5
substituindo Yf e Fmax, Eq. 5 pode ser simplificado como:
Eq. 6
De acordo com esta equação, a curva é simétrica (ou seja, Asym = 0) quando d = 1, ou 2 * Yf = Fmax. Pelo contrário, quando d & gt 1 temos 2 * Yf & lt Fmax (a curva é assimétrica), portanto, Asym & gt 0.

Depois de desenvolver um método para estimar três parâmetros de forma diferentes (Fmax, yf e m), a próxima etapa foi definir um critério para identificar as amostras de teste que se desviaram dos valores esperados. Isso foi feito usando o vetor de amostra que pode ser calculado para cada amplificação experimental se y pertence a uma distribuição normal multivariada, com vetor médio e & # 931 a matriz de variância-covariância correspondente, o (y - Σ)' Σ -1 (y - Σ) valor (distância de Mahalanobis) tem distribuição assintótica c & # 178, com 3 graus de liberdade. A distância de Mahalanobis é baseada em correlações entre variáveis ​​através das quais diferentes padrões podem ser identificados e analisados. É uma maneira útil de determinar a similaridade de um conjunto de amostra multivariada desconhecido com um conhecido. Ele leva em consideração as correlações do conjunto de dados e não depende da escala de medições. O vetor médio e a matriz de variância-covariância foram calculados a partir dos parâmetros de forma das amostras da curva padrão. Então, se c & # 178 & gt 7,81, podemos rejeitar a hipótese nula (com a = 0,05) e estabelecer que a forma da curva de amplificação é diferente da forma das amostras da curva padrão, considerando todos os três parâmetros [30]. Todas as elaborações e gráficos foram obtidos no Excel (Microsoft), Statistica 6.0 (Statsoft) e Statistical Package for Social Sciences (SPSS 13.0).

Análise SOD da curva padrão

O modelo SOD parte do pressuposto de que, para obter uma quantificação confiável, as curvas de amplificação de amostras desconhecidas não devem ser significativamente diferentes daquelas da curva padrão. Introduzimos a ideia de que a cinética de amplificação pode ser monitorada pela forma da curva de amplificação. A forma das curvas de amplificação foi parametrizada usando o ajuste de regressão não linear da função de Richards nas leituras de fluorescência [11].
Este procedimento matemático nos permitiu obter os cinco parâmetros característicos da equação de Richards. Esses valores foram posteriormente usados ​​para calcular a inclinação da tangente no ponto de inflexão (m), a coordenada y do ponto de inflexão (yf) e o valor máximo de fluorescência (Fmax) de uma leitura. Finalmente, esses três parâmetros nos permitiram criar uma "impressão digital" para cada curva de amplificação.
Com base nesta suposição, os parâmetros m, yf e Fmax Uma das amplificações usadas para construir uma curva padrão não deve ser significativamente diferente uma da outra e não deve ser correlacionada com o DNA de entrada. Para verificar essa suposição, uma curva padrão foi gerada em uma ampla faixa de DNA de entrada (3,14x10 7 -3,14x10 2 Fig. 1 Arquivos adicionais 1).
A Tabela 1 mostra a média, o DP e o teste de Kolmogorov-Smirnov de um total de 72 execuções. Esses resultados demonstraram que m, yf e Fmax estavam normalmente distribuídos, embora apresentassem uma dispersão diferente. Posteriormente, a relação entre m, yf e Fmax e o Log do modelo de DNA inicial foi estudado. Conforme mostrado na Fig. 2, não houve uma correlação significativa entre o Log de entrada de DNA e esses parâmetros (Fmax: R 2 = 0.017 p = 0.28 yf : R 2 = 0.033 p = 0.12 m: R 2 = 0.030 p = 0,14). Na verdade, os coeficientes de determinação (R 2) quantificou apenas uma proporção muito baixa de variâncias de parâmetro inferior a 3,3%.
Para definir objetivamente um perfil de amplificação como um outlier, introduzimos a variável Log (Nob/ Nexp), que estima os erros da análise de quantificação usando o método Ct. Esta variável depende dos resíduos estimados como a diferença entre as moléculas calculadas, usando o método Ct (Log of Number of Observed Molecules, referido como LogNob), e moléculas de DNA de entrada (Log of Expected Molecules, referido como LogNexp na verdade LogNob- LogNexp = Log (Nob/ Nexp)). O log de proporção (Nob/ Nexp) mostrou uma distribuição normal satisfazendo a suposição de homocedasticidade (arquivo adicional 4). Assim, é possível determinar um intervalo de confiança de 95% (IC) para a variável Log (Nob/ Nexp) Esses resíduos mostraram uma distribuição normal independentemente do modelo de DNA inicial, com a média igual a zero e o desvio padrão constante (& # 963 = 0,041). Em nosso banco de dados, de um total de 72 execuções usadas para construir a curva padrão, 6 execuções mostraram a razão Log (Nob/ Nexp) fora do IC (arquivo adicional 5). Posteriormente, a eficiência da PCR (Eff) também foi estimada para cada curva de amplificação, o software Lin-RegPCR [20, 23] foi usado para ajustar os pontos de dados na faixa ótima da fase exponencial da PCR para obter uma avaliação automatizada de Eff (Tabela 1 )
Para determinar o quão bem as amostras discrepantes podem ser identificadas por KOD e SOD, aplicamos essas análises estatísticas às execuções da curva padrão, em particular, descobrimos que KOD identificou 2 execuções acima do valor limite c & # 178 de 3,84 enquanto SOD revelou 3 execuções fora do IC (arquivo adicional 5). Esses outliers são provavelmente falso-positivos devido à definição e às propriedades intrínsecas do IC de 95%.

Tabela 1: Teste de Kolmogorov-Smirnov de uma amostra da curva de calibração.

Média (desvio padrão) e valor de teste de Kolmogorov-Smirnov (K-S) (probabilidade) dos seguintes parâmetros: Eficiência de LineReg (Eff), valor ordenado do ponto de inflexão (yf), inclinação da linha reta tangente no ponto de inflexão (m) e valor de platô (Fmax).

Efeitos inibidores na amplificação em tempo real

O ácido tânico oxida para formar quinonas que se ligam covalentemente a Taq DNA polimerase inibindo sua atividade [31].
Foram obtidos gráficos de amplificação em tempo real de 3,5 x 10 4 moléculas de DNA na presença de concentrações crescentes (0-0,1 mg por mL) de ácidos tânicos. Todos os valores de quantificação foram obtidos usando o Ct método. As curvas de amplificação resultantes e as quantificações correspondentes demonstram os efeitos da inibição na análise em tempo real (Fig. 3A e 3B). Conforme a concentração de ácido tânico aumentou, o Ct os valores aumentaram constantemente, levando a uma subestimação das moléculas iniciais. Este erro de quantificação foi destacado quando Log (Nob/ Nexp) abandonou o IC correspondente (Figura 3B). A amplificação suprimida foi demonstrada pelos cálculos de eficiência usando o procedimento LinRegPCR (arquivo adicional 5). Os erros observados foram o resultado da redução progressiva do platô, comprimento de fase linear e inclinação das curvas inibidas juntos esses efeitos levaram ao aumento Ct valores (Fig. 3A) [19, 32].

Análises de SOD e KOD foram utilizadas para identificar amostras com cinética de PCR aberrante, devido à presença de inibidor, o que pode levar a quantificações errôneas. Fmax, m, e yf os valores calculados a partir de cada curva de amplificação, obtidos na presença de concentrações crescentes de ácido tânico, IgG ou quercitina, foram usados ​​para estimar as 2 execuções identificadas ao longo de c & # 178SOD valor. Portanto, se o c & # 178SOD valor de uma curva de amplificação foi superior ao valor limite 7,81, a quantificação foi definida como um outlier. Eficiências de PCR também foram estimadas e c & # 178KOD valores determinados a partir das mesmas amplificações. Curvas de quantificação com um c & # 178KOD valores acima de 3,84 foram rejeitados.
Portanto, os desempenhos de SOD e KOD foram avaliados de acordo com sua capacidade de identificar uma amplificação como um outlier quando o Log (Nob/ Nexp) proporção não está dentro do IC de 95%.
Os resultados obtidos por análises de SOD e KOD na presença de concentrações crescentes de ácido tânico são mostrados nas Fig. 6A e 6B. Quando as concentrações de ácido tânico variando de 0,1 - 0,0125 mg / mL, foram adicionadas, todas as curvas obtidas tiveram erros de quantificação significativos (Fig. 6A e 6B símbolos completos indicam amostras que mostraram a razão Log (Nob/ Nexp) abaixo do limite inferior do IC 95%).

Tabela 2: Sensibilidade e especificidade das análises KOD e SOD.

Um tópico de grande interesse é o desenvolvimento de ferramentas manuais para a detecção de perfis de amplificação aberrantes em análises de PCR em tempo real. A PCR em tempo real rapidamente se tornou a técnica mais amplamente usada na quantificação de ácido nucleico. Embora a análise de PCR em tempo real tenha ganhado considerável atenção em muitos campos da biologia molecular, ela ainda apresenta problemas técnicos significativos [34]. Portanto, o presente estudo se concentrou na investigação de uma nova abordagem de detecção de outliers que não é baseada na estimativa de eficiência de PCR, mas sim na forma do perfil de amplificação.
A natureza da amplificação do PCR o torna vulnerável a pequenas diferenças na eficiência das amostras comparadas [20]. Na verdade, o atual "padrão ouro" na análise de PCR em tempo real, o método de ciclo de limite (chamado Ct método), requer eficiências de PCR semelhantes entre as amostras comparadas.
No entanto, a diferença na eficiência da PCR resulta de diferentes fontes de material de partida, por exemplo, diferentes tipos de tecidos [9]. Essas diferenças também podem ser encontradas quando os inibidores de Taq A DNA polimerase está presente em amostras de cDNA [35] ou na presença de SYBR green e / ou dNTPs de baixa qualidade [36, 37]. Além disso, a frequência de inibição da PCR [38] e diferentes efeitos inibitórios mesmo entre as réplicas [39] destacam a necessidade de avaliação da qualidade cinética para cada amostra. Conseqüentemente, Bar et al. [18] propôs um método estatístico, denominado KOD, para detectar amostras com eficiências diferentes.
O KOD procura outliers com base na suposição principal de que, para obter uma quantificação confiável, as execuções de PCR devem mostrar eficiências que não sejam significativamente diferentes umas das outras. Esta condição é verificada comparando as inclinações da regressão linear calculada na janela de linearidade após a transformação do log de cada fluorescência de leitura. Em outras palavras, se retornarmos aos dados brutos, o perfil das curvas exponenciais na janela de linearidade, não deve ser significativamente diferente entre as execuções comparadas. No desenvolvimento do método SOD, estendemos este conceito a toda a curva, e todas as execuções incluídas na análise devem mostrar perfis de amplificação comparáveis.
o Ct método é baseado na análise de um alvo diluído em série. Um exemplo desta abordagem é apresentado na Fig. 1A exame cuidadoso dos perfis de amplificação obtidos ilustra o princípio central do método SOD: todas as curvas de amplificação são semelhantes em forma e apenas a posição do perfil está relacionada à quantidade alvo. Os primeiros perfis de amplificação, correspondentes às amostras mais concentradas, são encontrados à esquerda, enquanto as amostras com um fator de diluição crescente deslocam-se regularmente para a direita. Essa observação nos levou à conclusão de que um critério de exclusão poderia ser baseado na diferença na forma, e não na eficiência. Isso está de acordo com o trabalho de Rutledge e Stewart [40] em que esses autores descreveram a curva de amplificação como uma função da eficiência. Portanto, se a eficiência determina a forma de uma curva, monitorando a forma de um perfil de amplificação, podem ser obtidas informações sobre a eficiência da amplificação.
Em primeiro lugar, uma "impressão digital" para cada curva de amplificação usando m, yf e Fmax resultante do ajuste da equação de Richards aos dados brutos. Posteriormente, esses parâmetros foram usados ​​para obter a matriz de variância-covariância a fim de calcular o Distância de Mahalanobis [30].
Essa medida estatística é baseada em correlações entre variáveis ​​por meio das quais diferentes padrões podem ser identificados e analisados. Em particular, a análise SOD fez uso da distância de Mahalanobis para determinar a similaridade de uma amostra desconhecida em comparação com o conjunto padrão. Esta abordagem foi muito útil porque nos permitiu avaliar não apenas a variância de parâmetros individuais (m, yf e Fmax), mas também para quantificar as co-variações recíprocas entre m, yf e Fmax.
Fmax foi considerado no desenvolvimento de SOD porque este parâmetro demonstra uma amplificação bem-sucedida e, geralmente, em condições de amplificação subótimas, as leituras não atingem a característica Fmax valores [9]. Examinando nosso banco de dados, notou-se que Fmax mostrou alta variância, portanto, afeta ligeiramente c & # 178SOD sozinho, mas Fmax teve um impacto significativo na matriz de variância-covariância. O parâmetro m descreve a inclinação da curva no ponto de inflexão [11]. Em nosso modelo, quanto maior o valor de m, quanto maior for a taxa de amplificação. No entanto, este estimador não indica diretamente a eficiência de amplificação entendida como a proporção entre as quantidades de produtos atuais e anteriores [38].
Finalmente, a assimetria dos perfis de amplificação foi monitorada pela relação entre Fmax e yf. Foi demonstrado que curvas PCR absolutamente simétricas raramente ocorrem, justificando a introdução de um ajuste de cinco parâmetros [25]. Além disso, em nosso trabalho anterior [11], foi demonstrado que a reação de amplificação pode se desviar de uma curva sigmóide simétrica para uma sigmóide assimétrica (bem descrita pela equação de Richards) na presença de eficiência subótima. Na verdade, a qualidade do ajuste do modelo logístico diminuiu progressivamente com menor eficiência, sugerindo uma mudança na forma de amplificação da curva de PCR [32].
A análise de correlação entre m, yf e Fmax obtidos a partir da curva padrão e do DNA de entrada demonstraram que esses parâmetros de forma são independentes da concentração. Isso apóia nossa hipótese experimental de que todas as curvas de amplificação da curva padrão são semelhantes em forma e apenas a posição do perfil determina a quantidade alvo. Na presença de inibição da PCR, verificou-se que o aumento das concentrações de ácido tânico e IgG resultou na diminuição Fmax e m valores, enquanto a assimetria aumentou com maiores concentrações de inibidor (quando a assimetria aumenta, yf diminui mais do que o correspondente Fmax Fig. 3 e 4). Pode ser que a inibição do ácido tânico seja simplesmente devido à extinção da fluorescência, uma vez que encontramos uma diminuição dramática na Fmax e uma diminuição da inclinação da curva de deslizamento. No entanto, também mostramos que a assimetria de fluorescência aumentou, demonstrando que o ácido tânico produziu uma distorção cinética de amplificação. A adição de quercitina às amplificações de PCR produziu dados muito interessantes. Na verdade, descobrimos que diminuiu Fmax e m na presença de altas concentrações de inibidor, porém este flavonídeo não induziu modificação assimétrica das curvas (Fig. 5D). Os dados relatados demonstram claramente que o método SOD pode identificar cinéticas de PCR não ideais resultantes de diferentes modelos de inibição. Além disso, os resultados obtidos na presença de quercitina destacam a importância do uso de uma abordagem multivariada.
Ao comparar o desempenho do SOD com o KOD, verificou-se que o SOD foi mais sensível do que o KOD em todas as configurações testadas. SOD e KOD foram igualmente específicos na presença de IgG e quercitina, enquanto SOD foi mais específico do que KOD na presença de ácido tânico.
Além disso, o método SOD apresenta várias vantagens em relação ao KOD SOD é totalmente manual. De fato, não é necessário que o usuário identifique uma janela de análise como no método KOD, e mais importante, SOD não depende de um valor de eficiência constante evitando todos os problemas relacionados com sua determinação [28, 40, 41]. Como relatado anteriormente, a determinação da eficiência de PCR variável pode levar a resultados diferentes, contribuindo para quantificações errôneas e dispersas [19].
Além disso, é evitada a transformação log de dados de fluorescência que poderiam ser responsáveis ​​pelo viés na análise.
O método SOD foi desenvolvido para o químico Sybr Green, e a aplicação desse procedimento a outros produtos químicos, como o TaqMan, precisa ser avaliada extensivamente.
Muito recentemente, Tichopad et al. [29] propôs um novo procedimento KOD baseado na estatística de Malahanobis [30]. Neste estudo, o máximo da primeira derivada e o máximo da segunda derivada foram estimados usando um ajuste logístico na parte central da trajetória do PCR. Usando esses dois parâmetros, esses autores propuseram monitorar apenas a primeira metade da curva. Ao contrário, o método SOD é baseado na possibilidade de descrever toda a trajetória do PCR usando a equação de Richards. SOD representa uma continuação e uma extensão da aplicação da equação de Richards para leituras de PCR em tempo real [11]. Acreditamos que o método SOD introduz conceitos originais que não são encontrados no método desenvolvido recentemente descrito por Tichopad et al. [29]. O SOD aproveita a possibilidade de descrever a forma de toda a trajetória do PCR por meio da combinação dos parâmetros m, yf e Fmax enquanto o método de Tichopad et al. [29] concentra-se em dois pontos-chave da trajetória: o máximo da primeira e da segunda derivada.
Além disso, no método SOD, usamos uma abordagem métrica bastante diferente. Embora outros métodos multivariados estejam disponíveis para tarefas semelhantes (máquinas de vetores de suporte, cluster K-means), usamos a distribuição assintótica da distância de Mahalanobis porque é uma extensão lógica do método KOD, que se baseia na distribuição normal univariada.

Nós demonstramos, pela primeira vez, que uma comparação da variação de forma de um perfil de amplificação com a forma de perfis padrão pode ser usada para excluir amostras aberrantes de Ct análise. Isso nos permite evitar a disseminação dos resultados e, portanto, aumenta o potencial da análise de quantificação.
Por isso, propomos SOD como um método de controle de qualidade sem controle manual na análise de PCR em tempo real com aplicações em qualquer campo do diagnóstico molecular.

Arquivo adicional 1 -
Dados de fluorescência e elaboração de ajustes de amplificações de amostras padrão (curva padrão) e amplificações obtidas na presença de: ácido tânico, IgG e quercitina. Arquivo adicional 2 -
Soluções analíticas para o valor y do ponto de inflexão (Yf.) e a inclinação da reta tangente (m) cruzando o ponto de inflexão.
  • A) Distribuição de qui-quadrado das distâncias quadradas sobre o vetor médio da população (D2 = y - Σ)'Σ -1 (y - Σ)) com 3 graus de liberdade.
  • B) Gráficos de dispersão de todos os pares de variáveis Fmax, Yf e m.
Arquivo adicional 2 -
amplificações (curva padrão) e amplificações obtidas na presença de: ácido tânico, IgG e quercitina.

Ct: ciclo de limiar IgG: imunoglobulina G SOD: detecção cinética de outlier baseada na forma KOD: detecção cinética de outlier Asym: Assimetria.

MG e DS realizaram o desenho do estudo, participaram da análise dos dados, desenvolveram o método SOD e redigiram o manuscrito. MBLR participou da coleta e análise dos dados e revisou criticamente o manuscrito. PT realizou a PCR em tempo real. DM participou da coleta de dados. VS participou da concepção do estudo e revisou criticamente o manuscrito. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.

1 Dipartimento DiSUAN, Sezione di Biomatematica, Universit degli Studi di Urbino "Carlo Bo", Campus Scientifico Sogesta Localit Crocicchia - 61029 Urbino, Itália e 2 Dipartimento di Scienze Biomolecolari, Sezione di Salerca sull'Attivit Motoria e della Ricitit degli Studi di Urbino "Carlo Bo", Via I Maggetti, 26/2 - 61029 Urbino, Itália.

Cite este artigo como: Sisti et al., Detecção de valores discrepantes cinéticos com base na forma em PCR em tempo real BMC Bioinformática 2010, 11:186

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Resultados

Quantificação usando AccuCal

Para resolver os problemas de longa data dos métodos tradicionais de quantificação de PCR [8], uma solução metodológica deve se integrar facilmente em cada execução de qPCR, fornecer resultados precisos e, idealmente, ser universalmente aplicável.

O método se baseia no AccuCal-D, um calibrador de DNA de fita dupla para uso com corantes intercalantes, ou AccuCal-P, um calibrador de fita simples marcado com fluorescência para ensaios qPCR baseados em sonda. Uma otimização inicial é necessária, mas após isso, o método AccuCal envolve três etapas simples (Fig. 1a e detalhadas nos Métodos). O software RealCount ™ foi desenvolvido para automatizar as etapas computacionais.

Quantificação de ácido nucléico amplificado por PCR usando o calibrador AccuCal. uma O fluxo de trabalho associado ao uso do AccuCal para quantificar a quantidade de ácido nucleico de entrada em cada PCR, b O calibrador AccuCal foi diluído para que 0, 40, 60, 80, 120, 140 e 200 ng em Sso Fast EvaGreen Supermix fossem adicionados aos respectivos poços de uma placa de PCR e submetidos a 40 ciclos de amplificação. c A intensidade de fluorescência de cada calibrador AccuCal (após subtração da média de 0 ng de fluorescência AccuCal) foi traçada contra a quantidade (pmols) e uma linha de regressão linear ajustada para gerar a curva de calibração. d Diluições de dez vezes de DNA lambda, variando de 4,5 × 10 6 - 4,5 × 10 1 cópias / PCR, foram amplificadas em quadruplicado em Sso Fast EvaGreen Supermix na mesma placa que os calibradores AccuCal. e A curva de calibração foi usada, juntamente com a eficiência calculada de cada reação de amplificação e os números dos ciclos entre o ponto de decolagem (Cq) e a segunda derivada máxima para cada reação de amplificação, para quantificar a quantidade média inicial de DNA em cada PCR. O erro padrão da média também é apresentado. f O número teórico e determinado de cópias / PCR, mais SEM, foram plotados um contra o outro e uma linha de regressão desenhada para demonstrar a concordância entre os dois valores

Para determinar a faixa AccuCal-D a ser usada, a otimização inicial foi realizada nas mesmas condições de reação das amplificações de DNA. No exemplo mostrado, um intervalo de 0-140 ng foi ótimo, pois abrangeu a porção exponencial das curvas de amplificação, onde a quantidade de alvo amplificado é diretamente proporcional à quantidade de entrada [9, 10], e deu um valor linear curva de calibração com valor de R 2 de 0,9987 (Fig. 1b, c e arquivo adicional 1). Esta determinação só precisa ser realizada uma vez, desde que as condições de reação de todos os PCRs subsequentes permaneçam constantes.

Para mostrar a precisão da quantificação de AccuCal-D, amplificamos diluições seriadas de dez vezes de quantidades conhecidas de um amplicon de 92 bp de DNA lambda, de 4,5 × 10 6 - 4,5 × 10 1 cópias, em quadruplicado ao lado de AccuCal-D, no quantidades predeterminadas e traçou a curva de calibração (Fig. 1b-d). A eficiência de cada reação de amplificação foi então determinada pelo RealCount usando algoritmos conhecidos [10]. Finalmente, usando os valores de eficiência e a curva de calibração, a quantidade média de DNA de entrada e o erro padrão da média foram calculados para todos os ciclos durante a fase exponencial de cada curva de amplificação usando RealCount (Fig. 1e). Uma análise de regressão entre os valores determinados e a quantidade teórica semeada no PCR rendeu um R 2 de 0,9977 (Fig. 1f), demonstrando a utilidade do método AccuCal-D e sua precisão na quantificação absoluta de qPCR em tempo real.

AccuCal-D depende de um corante intercalante para gerar fluorescência, mas a relação corante: fluorescência AccuCal-D é desconhecida. Para entender essa relação, desenvolvemos uma versão baseada em sonda do AccuCal, AccuCal-P. Um amplicon de 92 pb de uma gama de concentrações de DNA lambda foi amplificado e detectado usando uma sonda de hidrólise marcada com FAM ou corante intercalante EvaGreen. Ambos AccuCal-D e AccuCal-P marcado com FAM foram incluídos na placa de PCR e foram usados ​​independentemente para quantificar o DNA lambda detectado por ambos os marcadores. A quantificação usando AccuCal-D ou AccuCal-P, para ambos os conjuntos de amplificações de PCR, produziu resultados indistinguíveis para cada diluição, sem diferenças significativas entre os declives quando o número teórico de cópias é plotado contra determinado número de cópias (declives = 0,9601, 0,9653 , 0,9623 e 0,9701, R 2 = 1 para cada Fig. 2a e Arquivo adicional 1). AccuCal-P e a sonda de hidrólise são marcados com uma porção FAM por molécula de DNA e relatam a mesma fluorescência por molécula de DNA que o corante EvaGreen faz sob essas condições qPCR.

Quantificação usando AccuCal-D e AccuCal-P. uma Diluições de cinco, dez vezes de uma quantidade conhecida de DNA lambda, variando de 4,5 × 10 5 a 4,5 × 10 1, foram amplificadas duas vezes em quadruplicado e detectadas usando EvaGreen, o corante intercalante em Sso Fast mastermix ou um FAM marcado sonda de hidrólise específica para o amplicon alvo. Em ambos os casos, os calibradores AccuCal-D e AccuCal-P foram incluídos na mesma placa e usados ​​para quantificar independentemente a quantidade inicial de DNA de entrada em cada PCR. A quantidade teórica versus a quantidade calculada, determinada por AccuCal-D ou AccuCal-P, usando o corante EvaGreen (EG) ou a sonda de hidrólise (P), foi traçada e a regressão linear de cada é mostrada no gráfico à direita . b Diluições cinco, dez vezes de uma quantidade conhecida de DNA lambda em quadruplicado foram amplificadas em mastermix Sso Fast usando iniciadores para dar um amplicon de 501 bp. Os calibradores AccuCal-D e AccuCal-P foram incluídos na mesma placa e usados ​​para quantificar independentemente a quantidade inicial de DNA lambda em cada PCR. A quantidade teórica versus a quantidade calculada, determinada por AccuCal-D ou AccuCal-P, para o amplicon de 501 bp, foi traçada e a regressão linear de cada é mostrada no gráfico à direita. c Diluições de cinco, dez vezes (3 diluições de cem vezes no Eco) de uma quantidade conhecida de DNA lambda foram amplificadas em vários mastermixes (consulte Métodos) nas diferentes plataformas qPCR indicadas em 2–10 execuções de PCR. O valor teórico versus o valor médio calculado, determinado pelo AccuCal-D, em todas as plataformas foi traçado e a regressão linear é mostrada no gráfico à direita. O número médio de cópias calculadas / PCR e SEM são mostrados em cada caso

Para determinar a faixa de tamanhos de amplicons para os quais a quantificação AccuCal-D pode ser usada, também amplificamos os amplicons lambda de 501 bp. Amplicons de 92 bp a 501 bp cobrem o espectro de tamanhos de amplicons que são tipicamente amplificados por qPCR. Mais uma vez, AccuCal-P e uma sonda de hidrólise específica de modelo marcada com FAM foram usados ​​como um comparador para AccuCal-D e corante intercalante. Os resultados mostram que a quantificação é semelhante para ambos os tamanhos de amplicon, seja calculado usando AccuCal-D ou AccuCal-P, sem nenhuma inclinação diferindo significativamente de 1 (Fig. 2b). Isso sugere que o corante e a fluorescência da sonda permanecem constantes ao longo desta faixa de tamanhos de amplicon e, portanto, AccuCal pode ser usado de forma confiável para quantificar qualquer amplicon dentro desta faixa.

Para avaliar o desempenho do AccuCal-D em uma variedade de mastermixes baseados em corantes em uma série de plataformas qPCR em tempo real, oito grupos de pesquisa independentes foram fornecidos com AccuCal-D e reagentes para amplificação lambda (amplicon de 92 bp). Cada laboratório amplificou seus GOIs e quantidades de entrada conhecidas de lambda sob uma gama de condições típicas para esses laboratórios. Os resultados mostram que AccuCal-D fornece uma quantificação precisa e absoluta de concentrações conhecidas de DNA lambda nesses testes variados e independentes (Fig. 2c). Quando comparada coletivamente em todas as plataformas, a quantificação média determinada se correlaciona perfeitamente com o número teórico de cópias em cada PCR (Fig. 2c, declive = 1).

Quando integrado em cada qPCR executado nas mesmas condições que o (s) GOI (s), o AccuCal fornece quantificação absoluta robusta em uma variedade de quantidades de entrada e tamanhos de amplicon, em ensaios baseados em corante ou sonda.

AccuCal fornece confiança na análise de quantificação relativa

Quantificação relativa, por exemplo As análises ΔΔCq [11] e Pfaffl [12] têm sido tradicionalmente o método mais simples e mais comumente usado de quantificação por PCR. Embora AccuCal forneça quantificação absoluta, ela pode ser aplicada de forma relativa.

Para comparar AccuCal-D com análises de ΔΔCq e Pfaffl, avaliamos os níveis de CD40 e variantes da cadeia alfa do receptor de interleucina 7 (IL7R). A ativação de células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs) revela um repertório de variantes de splice desses genes que refletem uma predisposição à esclerose múltipla [13, 14]. Conduzimos experimentos para medir os níveis de CD40 e IL7R em PBMCs humanos via qPCR após 24 h de ativação com quantidades variáveis ​​de acetato de miristato de forbol (PMA) e ionomicina (PMA / I). A quantificação absoluta da qPCR foi realizada usando AccuCal-D e RealCount (Fig. 3a e arquivo adicional 1). A quantificação relativa foi avaliada expressando os valores absolutos de AccuCal-D em relação ao controle sem PMA / ionomicina, ou por análises ΔΔCq ou Pfaffl tradicionais usando gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) como um gene de referência e as células não estimuladas como um controle (Fig. 3b). Para a análise de Pfaffl, foram utilizadas as eficiências calculadas pelo RealCount.

Quantificação de CD40, IL7R e GAPDH em PBMCs estimulados com 0-1x PMA / ionomicina. uma Quantificação absoluta de CD40, IL7R e GAPDH em PBMCs estimulados com 0, 0,25x, 0,5x e 1x PMA / ionomicina (20 ng ml −1 PMA, 500 ng ml −1 ionomicina PMA / I) por software RealCount seguindo qPCR usando calibradores AccuCal-D. b Níveis de expressão relativa de CD40 e IL7R em PBMCs estimulados com 0, 0,25x, 0,5x e 1x PMA / ionomicina (20 ng ml −1 PMA, 500 ng ml −1 ionomicina). As barras tracejadas são níveis de expressão relativos determinados por ΔΔCq usando GAPDH como o gene de referência e sem PMA / ionomicina como a amostra de controle, as barras sólidas são níveis de expressão relativos determinados por análise de Pfaffl, usando GAPDH como gene de referência, células não estimuladas como controles e valores de eficiência individuais calculados pelo software RealCount, e as barras quadriculadas são quantificadas pelo software RealCount após a inclusão de AccuCal-D na mesma corrida de PCR e expresso em relação ao controle sem PMA / ionomicina. c Gráficos de sobreposição representativos de citometria de fluxo mostrando a medição relativa de CD40 e IL7R na mesma população de PBMCs estimulados com 0 (vermelho), 0,25x (azul), 0,5x (verde) e 1x PMA / ionomicina (20 ng ml −1 PMA, 500 ng ml −1 ionomicina laranja) como em (uma). **** p & lt 0,0001 em relação ao respectivo controle sem PMA / ionomicina, n = 4

Ambas as análises absoluta e relativa mostraram a expressão de IL7R foi de 3 a 10 vezes menor em células estimuladas (p ≤ 0,0001 por todos os métodos) em comparação com células não estimuladas, considerando que quaisquer diferenças nos níveis de CD40 não eram de grande importância. Neste experimento, a interpretação dos dados qPCR das análises ΔΔCq e Pfaffl foi a mesma fornecida pelo AccuCal-D (Fig. 3b). A suposição para as análises ΔΔCq e Pfaffl é que o nível de GAPDH o gene de referência permanece constante entre os tratamentos. É importante ressaltar que a quantificação absoluta usando AccuCal-D indicou que este era realmente o caso (Fig. 3a). Os resultados das análises de qPCR foram suportados por citometria de fluxo, não mostrando nenhuma diferença no nível de expressão de CD40 e uma diminuição de 3 a 5,5 vezes na expressão de IL7R no grupo de tratamento em comparação com as células não tratadas (Fig. 3c).

É importante ressaltar que a análise AccuCal-D e RealCount fornece dados sobre os níveis de expressão de todos os genes, incluindo o gene de referência, entre tratamentos / grupos (Fig. 3a) e as eficiências individuais para cada reação de amplificação, que não estão disponíveis usando ΔΔCq e Pfaffl análises.

AccuCal substitui as análises de quantificação tradicionais

A fosfatase específica do epitélio da próstata e o nocaute homólogo da tensina (pePTENKO) induzem a patologia da próstata [15] e modifica a expressão do receptor de andrógeno (AR) específico da próstata em camundongos, conforme determinado por imunohistoquímica (Fig. 4a e Arquivo adicional 1) ou Western blot (Fig. 4b ) A análise Western mostrou que os níveis de proteína β-actina (ACTB) eram constantes e foram usados ​​para determinar os níveis de expressão relativa da proteína. O conteúdo de proteína AR foi significativamente maior (p = 0,008) no tecido da próstata de camundongos pePTENKO em comparação com o tipo selvagem (WT Fig. 4b).

Quantificação dos níveis de proteína e mRNA do receptor de andrógeno (AR, Ar) na próstata anterior de camundongo. uma Imuno-histoquímica representativa mostrando a expressão da proteína AR (coloração marrom) e patologia diferencial na próstata de camundongos WT e pePTENKO. b Quantificação da proteína AR por Western blot na próstata anterior de WT (n = 2) e pePTENKO (n = 4) camundongos, usando β-actina (ACTB) como um controle de carregamento para determinar os níveis relativos de proteína. c Quantificação relativa de Ar por análises ΔΔCq e Pfaffl usando Actb como gene de referência e WT como controle. d qPCR de Ar e Actb em WT (curvas azuis, n = 7 em duplicado) e pePTENKO (curvas vermelhas, n = 5 em duplicado) ratos. e Comparação da quantificação teórica versus determinada de diluições em série de plasmídeos contendo Ar ou Actb amplicons, por qualquer das curvas padrão tradicionais (diamantes azuis e linha) ou uso de AccuCal e RealCount (quadrados vermelhos e linha). f Quantificação do número de cópia de mRNA absoluto de Ar e Actb gene de referência na próstata anterior de WT (n = 7) e pePTENKO (n = 5) ratos conforme determinado por RT-qPCR com calibradores AccuCal e software RealCount (AC) ou curvas padrão (Std). g Quantificação absoluta de um número de genes de referência usando AccuCal e RealCount para ambos WT (n = 7) e pePTENKO (n = 5) camundongos. h Comparação de metodologias de quantificação relativa para Ar. Análises ΔΔCq e Pfaffl usadas também Actb ou Hmbs como gene de referência e WT como controle, e os valores absolutos AccuCal (AC) e curva padrão (Std) foram expressos de maneira relativa a WT como controle. Todos os dados gráficos são exibidos como média ± SEM. **** p & lt0,0001, ** p = 0.001–0.01, * p = 0,01–0,05 por duas amostras independentes t-teste entre a expressão do receptor de andrógeno ou β-actina mRNA ou proteína em camundongos pePTENKO em comparação com camundongos WT, ou entre métodos de expressão relativa em comparação com ΔΔCq e Pfaffl realizado usando Actb como gene de referência

Para determinar se esses ensaios complexos poderiam ser substituídos por análise de mRNA usando qPCR, amplificamos por PCR Ar e Actb do RNA da próstata extraído de camundongos WT e pePTENKO. Inicialmente, a quantificação relativa foi realizada por análises tradicionais ΔΔCq e Pfaffl com Actb como gene de referência e WT como controle. Actb foi escolhido porque a proteína foi expressa de forma estável entre os grupos (Fig. 4b). As análises ΔΔCq e Pfaffl indicaram que não houve mudança significativa na Ar níveis de expressão em camundongos pePTENKO em comparação com WT (aumento de 1,250 e 1,286 vezes, respectivamente Fig. 4c). Sabe-se que os níveis de proteína e mRNA não necessariamente se correlacionam [16, 17], o que pode explicar esse resultado. Alternativamente, a análise de qPCR relativa pode estar incorreta. O exame dos gráficos de amplificação sugeriu uma maior expressão de Ar, assim como Actb, na próstata de camundongos pePTENKO (Fig. 4d).

Para resolver esse problema, usamos a quantificação absoluta via AccuCal-D, ou curvas padrão, para determinar os níveis de Ar e Actb em camundongos pePTENKO e WT. Os resultados demonstraram que os níveis de expressão de cada gene tiveram quantificações absolutas semelhantes por ambos os métodos (Fig. 4e) e foram significativamente maiores na próstata de camundongos pePTENKO do que em camundongos WT para a curva padrão e AccuCal-D (Ar, p & lt 0,0001 e p & lt 0,0001 Actb, p = 0,0049 e p = 0,0043, respectivamente Fig. 4f). Quando expresso de maneira relativa, Ar a expressão em camundongos pePTENKO foi 3,806 vezes maior do que em camundongos WT por quantificação de curva padrão e 3,697 vezes maior por quantificação AccuCal-D. Ambos foram significativamente diferentes das análises ΔΔCq e Pfaffl usando Actb como um gene de referência (p & lt 0,0001 Fig. 4h), mas estavam de acordo com os resultados de Western blot. Neste exemplo, as análises ΔΔCq e Pfaffl não foram precisas porque o gene de referência usado mudou de forma semelhante ao GOI entre os fenótipos (Fig. 4f).

Além disso, quantificamos, com AccuCal-D, uma série de outros genes de referência possíveis para usar para normalização. Não houve diferença significativa entre a expressão da proteína ribossomal L19 (Rpl19) e hidroximetilbilano sintase (Hmbs) entre WT e pePTENKO, mas os genes de referência restantes foram todos expressos de forma significativamente mais abundante nas próstatas de camundongos pePTENKO do que em camundongos WT, destacando a dificuldade em encontrar um gene de referência adequado em alguns experimentos (Fig. 4g). Em seguida, repetimos as análises ΔΔCq e Pfaffl usando o gene de referência de menor variável, Hmbs, e os resultados (aumentos de 4,294 e 3,603 vezes, respectivamente) foram muito semelhantes aos obtidos usando AccuCal-D ou quantificação de curva padrão e significativamente diferentes das análises ΔΔCq e Pfaffl realizadas usando Actb como um gene de referência (p & lt 0,0001 em ambos os casos (Fig. 4h).

No exemplo descrito, AccuCal-D forneceu um método de quantificação alternativo, independente dos genes de referência, onde estes são difíceis de encontrar (Fig. 4h). É importante ressaltar que também mostramos que a quantificação absoluta pela curva padrão correspondeu perfeitamente à análise AccuCal-D (Fig. 4e, f). Isso demonstrou que os níveis de proteína e expressão gênica de AR /Ar correlacionado, permitindo o uso de análise de mRNA por qPCR como um ensaio repórter fiel. Notavelmente, AccuCal forneceu essas informações de forma muito mais simples do que o método da curva padrão, e uma única curva de calibração poderia ser usada para quantificar todos os genes investigados simultaneamente.


Prisma 3 - Calculando Concentrações "Desconhecidas" usando uma Curva Padrão

Uma curva padrão é um gráfico que relaciona uma quantidade medida (radioatividade, fluorescência ou densidade óptica, por exemplo) à concentração da substância de interesse em amostras "conhecidas". Você prepara e analisa amostras "conhecidas" contendo a substância em quantidades escolhidas para abranger a faixa de concentrações que espera encontrar nas amostras "desconhecidas". Em seguida, você desenha a curva padrão traçando a quantidade testada (no eixo Y) versus concentração (no eixo X). Essa curva pode ser usada para determinar as concentrações da substância em amostras "desconhecidas". O Prism automatiza esse processo.

O Prism pode ajustar curvas padrão usando regressão não linear (ajuste de curva), regressão linear ou uma curva spline cúbica (ou LOWESS). Para encontrar concentrações "desconhecidas" usando uma curva padrão, siga estas etapas:

No Bem-vindo ao Prism caixa de diálogo, selecione Crie um novo projeto e Trabalhar independentemente. Escolha formatar a coluna X como Números e formatar a coluna Y para o número de réplicas em seus dados. Para nosso exemplo, escolha Uma única coluna de valores.

Insira os dados para a curva padrão. Em nosso exemplo, mostrado abaixo, inserimos concentrações para as amostras "conhecidas" na coluna X, linhas 1-5, e os resultados do ensaio correspondentes na coluna Y. Não se preocupe se o Prism exibir zeros à direita que você não inseriu - vamos mudar isso mais tarde. Logo abaixo dos valores da curva padrão, começando na linha 6, insira os resultados do ensaio para as amostras "desconhecidas" na coluna Y, deixando as células X correspondentes em branco. Posteriormente, o Prism ajustará a curva padrão e relatará as concentrações de substância desconhecidas usando essa curva.

Clique no Analisar botão. Escolher Análise integrada. De Curvas e regressão amp categoria, selecione Regressão linear se você estiver usando nossos dados de exemplo (ou se estiver analisando dados que suspeita serem curvilíneos, escolha Regressão não linear [ajuste de curva]). Para obter um exemplo de como proceder com dados não lineares, consulte o exemplo em Analyzing RIA or ELISA Data.

Na caixa de diálogo Parâmetros: regressão linear, marque a caixa rotulada Curva padrão X de Y, porque queremos que nossas concentrações desconhecidas sejam fornecidas. No Saída categoria de opções, selecione a Auto opções para determinar onde o Prism começará e terminará a linha de regressão. Defina o número de dígitos significativos para 3.

Quando você clica OK para sair da caixa de diálogo de parâmetros de regressão linear, o Prism executa o ajuste e cria uma planilha de resultados.

O Prism exibe os resultados em páginas chamadas visualizações. A visualização padrão mostra os parâmetros de definição para a curva de melhor ajuste.

Localize a caixa suspensa chamada & quotVer & quot na terceira linha da barra de ferramentas (não o menu & quotVer & quot na parte superior da tela). Selecione Valores X interpolados (nos primeiros lançamentos do Prism, esta era a & quotCurva padrão X de Y & quot).

O Prism relata o valor X correspondente para cada valor Y desemparelhado em sua planilha de dados.

Adicione desconhecidos ao seu gráfico

O gráfico automático do Prism inclui os dados da planilha de dados e da curva. Para adicionar & quotdesconhecidos & quot ao gráfico:

Mudar para o Gráficos seção do seu projeto.

Clique no Mudar botão e selecione Dados no gráfico.

A caixa de diálogo mostra todos os dados e tabelas de resultados representados no gráfico. Clique no Adicionar botão.

Na lista suspensa no topo do Adicionar conjuntos de dados ao gráfico caixa de diálogo, selecione . Regressão linear: valores X interpolados. Clique em Adicionar, então Fechar. A lista de conjuntos de dados incluídos no gráfico agora deve ser semelhante à janela abaixo.

pressione OK para voltar ao gráfico.

Se você quiser que os & quotdesconhecidos & quot sejam representados como picos projetados no eixo X (em vez de pontos de dados), clique no botão Alterar e selecione Símbolos e Linhas. Na lista suspensa & quotConjunto de dados & quot, selecione. Regressão linear: valores X interpolados. Altere a forma do símbolo para uma das últimas 4 opções (pontas) e defina o tamanho como 0.

Resultados da curva padrão - Desconhecidos são representados como picos nos resultados numéricos do gráfico são relatados como uma tabela incorporada. A ilustração inclui algumas alterações de formatação não discutidas aqui.


Discussão

  • Achei que era uma ótima maneira de ajudar a entender o que estava fazendo, em vez de apenas ouvir o que fazer.
  • Na verdade, escolher uma mutação que WE pessoalmente fez foi de longe a coisa mais interessante em toda a minha carreira aqui na IUP.
  • Foi mais interessante escolher sua própria mutação do que entender uma mutação que outra pessoa escolheu.
  • Eu achei realmente ótimo. Isso me fez sentir como um verdadeiro pesquisador e explorador.

Ao escolher sua própria mutação, esses alunos entram no modo de pesquisadores e eles claramente acolheram isso. Um perigo em simular uma situação de pesquisa em um curso de laboratório do aluno é o alto potencial para resultados abaixo do ideal em comparação com procedimentos “testados pelo aluno”. Na verdade, apenas um dos três grupos em BIOC 312 foi bem-sucedido na produção de uma proteína mutante para análise e esta proteína foi apenas parcialmente purificada pelo método usado no curso. Embora a falha em gerar uma proteína mutada seja decepcionante, cada grupo terá produzido e purificado com sucesso sua proteína de tipo selvagem. Os períodos de curso que teriam sido gastos na análise da proteína mutada podem ser facilmente usados ​​para análises adicionais da forma de tipo selvagem.

Além de combinar recursos de dois projetos descritos anteriormente, este projeto inclui um novo elemento, o uso de um método de análise de alto rendimento na forma de estudos de estabilidade de proteínas usando um instrumento de PCR em tempo real. Dada a ênfase crescente em métodos de alto rendimento em pesquisa, simplesmente expor os alunos a tais métodos é desejável. Existem vários benefícios adicionais neste caso. O uso do instrumento de PCR em tempo real aumentou muito o número de amostras analisadas e o número de sessões do instrumento para cada grupo em comparação com a análise por espectrofluorímetro de amostra única. Grupos usando o instrumento de PCR em tempo real mediram de 36 a 76 curvas de fusão para sua proteína de tipo selvagem em cinco sessões de instrumento separadas. No ano anterior, três grupos de alunos usando o espectrofluorímetro mediram de 3 a 5 curvas de fusão. Os alunos, portanto, tiveram mais oportunidade de aprimorar sua técnica, testar variáveis ​​experimentais e projetar experimentos de acompanhamento. Além disso, eles ganharam experiência com gerenciamento e análise de conjuntos de dados maiores do que normalmente encontram em outros cursos de laboratório.

Uma desvantagem da desnaturação térmica monitorada por um corante repórter, como laranja SYPRO, é que a análise termodinâmica que é possível com dados de fluorescência intrínseca para estimar ΔH o e ΔS o para desdobramento 11 não é válido. Esta análise assume um equilíbrio simples e reversível entre a proteína dobrada e a não dobrada. Embora isso provavelmente não seja estritamente verdadeiro para a maioria das proteínas em condições de desnaturação térmica, certamente não é verdade na presença de um corante repórter que se liga à proteína de maneira diferente à medida que ela se desenvolve. Os valores termodinâmicos obtidos neste caso refletirão o desdobramento da proteína e a ligação do corante repórter.

Várias opções são possíveis se for desejado incluir uma análise além do simples cálculo de Tm das curvas de fusão. A fluorimetria de varredura diferencial (medição das curvas de fusão na ausência e presença de ligante) pode ser usada para calcular constantes de dissociação de ligante 7, 8. Para esta análise, a proteína inicialmente não deve ter nenhum ligante ligado. Alternativamente, curvas de fusão medidas por instrumento de PCR em tempo real na presença de laranja SYPRO podem ser usadas para calcular parâmetros cinéticos para o desdobramento de proteínas na presença de desnaturantes químicos 9. Nenhuma dessas análises foi tentada no teste inicial do projeto de fator de tradução expandido. Uma terceira alternativa foi explorada em um ambiente de curso separado. Isso se baseia na eliminação do corante repórter usando GFP aprimorado (EGFP), uma proteína que apresenta fluorescência natural em um comprimento de onda detectável por instrumento de PCR em tempo real.

EGFP e proteínas fluorescentes relacionadas são usadas como biossensores em uma ampla gama de aplicações, incluindo estudos de interações proteína-proteína e mudanças conformacionais. O processo de dobramento / desdobramento dessas proteínas importantes tem sido estudado por uma variedade de métodos 15-17. Essas proteínas têm alta estabilidade térmica em condições fisiológicas normais e muitos estudos de seu dobramento / desdobramento são feitos em pH baixo ou na presença de desnaturantes. Uma revisão da literatura indica que existem poucos estudos sobre a desnaturação térmica de EGFP. Embora seja conhecido que essas proteínas não seguem um modelo simples de dois estados para desdobramento, as curvas de desnaturação sob algumas condições têm uma forma consistente com este modelo e, portanto, podem ser usadas para derivar valores termodinâmicos para o processo de desdobramento geral. A Figura 7 mostra as curvas de fusão para EGFP obtidas por instrumento de PCR em tempo real. Os resultados do EGFP foram gerados por alunos de graduação em um curso de bioquímica de um semestre que normalmente não inclui um componente de laboratório. Uma experiência de laboratório envolvendo expressão, purificação e caracterização de EGFP foi incluída para o curso oferecido com uma pequena inscrição durante uma sessão de verão. Esses resultados iniciais para a desnaturação térmica de EGFP usando um instrumento de PCR em tempo real sugerem que esse sistema pode ser promissor para incorporação em uma experiência de laboratório de graduação.


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