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Spores bacillus subtilis no leite

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Preciso inocular esporos no leite e depois contar no prato. Nunca vi um esporo, então como o reconheço na célula germinativa? alguém conhece o procedimento e se existem diferenças em relação a uma contagem normal em colônias de ágar?


Se você precisar inocular leite com um número conhecido de Bacillus subtilis esporos então você terá que seguir um protocolo de "esporulação" - (passando pela sua pergunta, não estou 100% certo se é isso que você quer fazer).

No entanto, encontre um protocolo de esporulação, desenvolvido pelas Universidades de Bonn e Freiburg, abaixo:

Esporulação

  1. Cultura noturna

    • Inocular sua cultura de Bacillus subtilis em 4 ml de meio LB
    • Deixe-os crescer durante a noite a 37 ° C, 200 rpm
  2. Crescimento exponencial

    • Meça o OD600 de sua cultura durante a noite e dilua-o em meio LB para um OD600 de cerca de 0,1-0,2 / ml em 10 ml LB
    • Deixe as células crescerem até uma OD600 de 0,8 / ml (37 ° C, 200 rpm)
  3. Esporulação

    • Centrifugue 10 ml das células a 13.000 x g por 1 minuto
    • Lave o pellet com 1 x PBS
    • Ressuspenda o pellet em 5 ml de DSM (Difco Sporulation Medium)
    • Deixe as células crescerem por 24 horas a 37 ° C (200 rpm)
  4. Tratamento de lisozima (adicional para purificação de esporos)

    • Trate as amostras com lisozima (15 mg / ml) em uma diluição de 1: 6
    • Incubar por 1 h em temperatura ambiente
    • Lavar 6 vezes com 1 x PBS
  5. Adicional:

    • contar esporos usando uma câmara de contagem aprimorada Neubauer e fazer alíquotas com um número definido de esporos por alíquota (por exemplo, 100 milhões de esporos por 500 μl)

(Observação: sempre use DSM fresco, pois o FeSO4 enferruja quando está em diluição)

Posso fazer uma menção especial ao Bacillus subtilis Este manual foi elaborado pela equipe iGEM e provou ser um excelente recurso. O protocolo acima foi retirado dela.

Depois de fazer a contagem de esporos, você pode inocular o leite de acordo com sua preferência. No entanto, esteja ciente de que o leite, a menos que completamente pasteurizado antes da inoculação, não é um produto estéril. Isso significa que outros organismos podem crescer em qualquer ágar que você decida espalhar.


Esporo de resistência ao calor do bacilo subtilis

Bacillus subtilis é um organismo modelo bem estudado, capaz de formar endosporos dormentes. Esses esporos podem sobreviver a condições ambientais adversas e, portanto, são uma grande preocupação para a indústria de alimentos.

Nesta pesquisa, o foco está em isolados de alimentos de B. subtilis que produzem esporos com resistência ao calor muito alta. O tratamento térmico é comumente aplicado na indústria de alimentos para reduzir o conteúdo bacteriano em produtos, resultando na prevenção de deterioração e em uma vida útil mais longa do produto. Claramente, existe uma grande variação entre as resistências ao calor dos esporos entre as diferentes cepas, e também foi estabelecido que as condições de esporulação são importantes na determinação das propriedades finais de resistência ao calor dos esporos [1,2].

Este projeto visa identificar os mecanismos moleculares subjacentes à resistência ao calor dos esporos. Depois de estabelecer as diferenças na resistência ao calor dos esporos entre as linhagens, a caracterização fenotípica e genotípica das linhagens resistentes ao calor extremo será realizada.


Introdução

A presença onipresente de formadores de esporos bacterianos na natureza pode ser amplamente atribuída à sua capacidade de produzir endosporos (esporos) que podem sobreviver a condições ambientais adversas (Nicholson et al., 2000 Setlow, 2006). Os esporos bacterianos podem entrar na cadeia alimentar de muitas fontes diferentes, por exemplo, via solo, poeira e biofilmes (Heyndrickx, 2011). As propriedades de resistência intrínseca dos esporos podem resultar na sobrevivência durante o processamento de alimentos, no qual o aquecimento é um dos tratamentos mais comumente aplicados para reduzir as cargas bacterianas. Tais tratamentos colocam pressão seletiva na microflora presente, permitindo a sobrevivência daquelas cepas que produzem esporos com alta resistência ao calor (Postollec et al., 2012). Os esporos sobreviventes podem germinar após a exposição a certos gatilhos ambientais e podem, subsequentemente, retomar o crescimento vegetativo, resultando potencialmente em patogenicidade alimentar ou deterioração alimentar, dependendo da espécie (Scheldeman et al., 2006 Wells-Bennik et al., 2016).

Esporos de espécies mesófilas pertencentes ao B. subtilis grupo são comumente encontrados em vários ingredientes alimentares e produtos alimentares. o B. subtilis grupo engloba as espécies B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. vallismortis, B. mojavensis, B. atropheus, e B. sonorensis, que são filogeneticamente próximos, mas distinguíveis (Logan e Vos, 2009). Essas espécies geralmente podem crescer entre temperaturas de 30 & # x0201350 & # x000B0C, com temperaturas de crescimento relatadas de B. licheniformis até 58 & # x000B0C (Warth, 1978). Os esporos de B. subtilis, B. amyloliquefaciens e B. licheniformis são comumente encontrados em vários ingredientes e produtos alimentícios, incluindo cacau, ervas, especiarias, pão, sopas, leite e leite em pó (te Giffel et al., 1996 Oomes et al., 2007 Lima et al., 2011 L & # x000FCcking et al., 2013 Miller et al., 2015). Essas espécies são, por exemplo, contaminantes bem conhecidos de matérias-primas usadas na fabricação de pão (Rosenkvist e Hansen, 1995 Sorokulova et al., 2003), e os esporos podem potencialmente sobreviver ao processo de cozimento do pão (Valerio et al., 2015). Após a sobrevivência, germinação e crescimento dos esporos, células vegetativas de B. amyloliquefaciens, B. subtilis ou B. licheniformis pode resultar em produtos alimentares estragados. B. subtilis, por exemplo, foi relatado estar presente no cacau (Lima et al., 2011) levando a bebidas de chocolate estragadas, B. licheniformis pode estar presente no leite e leite em pó levando à deterioração de produtos lácteos tratados termicamente (Gopal et al., 2015), e B. amyloliquefaciens pode estragar o pão, resultando em pão pegajoso pela degradação do amido e a formação de polissacarídeos extracelulares (Sorokulova et al., 2003 Valerio et al., 2012, 2015). Certas cepas de B. licheniformis pode produzir uma toxina, a lichenisina A, que pode causar doenças transmitidas por alimentos (Salkinoja-Salonen et al., 1999 Nieminen et al., 2007 Logan, 2012). Lichenisyn é um lipo-peptídeo sintetizado não ribossomalmente que é estável ao calor (Konz et al., 1999). Devido ao potencial patogênico de cepas de B. licheniformis, é fundamental controlar esses esporos na cadeia alimentar (Madslien et al., 2013).

Diferenças notáveis ​​foram observadas com relação às propriedades de resistência ao calor úmido dos esporos de cepas dentro do B. subtilis grupo (Kort et al., 2005 Oomes et al., 2007 Lima et al., 2011 Berendsen et al., 2015). Após uma análise detalhada da resistência ao calor dos esporos de 14 cepas pertencentes ao B. subtilis grupo, as cepas podem ser divididas em dois grupos com base na resistência ao calor dos esporos (Berendsen et al., 2015). Para B. subtilis cepas, foi recentemente demonstrado que os esporos com alto nível de resistência ao calor contêm um Tn1546 transposon, englobando um spoVA operon que é diretamente responsável por este fenótipo (designado spoVA 2mob, onde mob indica a presença em um elemento genético móvel (Berendsen et al., 2016a). Além disso, observamos alto nível de resistência ao calor de esporos de B. licheniformis e B. amyloliquefaciens cepas que carregam o Tn1546 transposon os esporos dessas cepas mostraram níveis de resistência ao calor semelhantes aos dos esporos de B. subtilis cepas com um Tn1546 transposon (Berendsen et al., 2015, 2016a).

Neste estudo, relatamos a presença e composição de Tn1546 homólogos de transposon de B. subtilis que foram encontrados em cepas de B. amyloliquefaciens e cepas de B. licheniformis que produziu esporos altamente resistentes ao calor. Isso foi realizado por análise de genoma ou detecção por PCR. o spoVA Operons 2mob encontrados em B. amyloliquefaciens e B. licheniformis foram introduzidos em B. subtilis para avaliar seu papel na resistência ao calor dos esporos. Além disso, as temperaturas de crescimento de todos B. amyloliquefaciens e B. licheniformis cepas (nove cada) com ou sem o Tn1546 transposons foram avaliados.


Análise de fatores que influenciam a sensibilidade dos esporos de Bacillus subtilis a produtos químicos que danificam o DNA

Mira: Para elucidar os fatores que influenciam a sensibilidade dos esporos de Bacillus subtilis a produtos químicos que danificam o DNA.

Métodos e resultados: Os esporos do tipo selvagem de B. subtilis produzidos em temperaturas mais baixas eram mais sensíveis aos produtos químicos nocivos ao DNA, formaldeído e ácido nitroso, do que os esporos produzidos em temperaturas mais altas, mas este não era o caso com os agentes alquilantes de DNA etilmetanossulfonato e metilmetanossulfonato. Os esporos que carecem da maioria das proteínas pequenas e solúveis em ácido do tipo alfa / beta protetoras de DNA (denominadas esporos alfa-beta) produzidos em temperaturas mais baixas também foram mais sensíveis à morte por danos no DNA por peróxido de hidrogênio do que os esporos alfa-beta produzidos em temperaturas mais baixas temperaturas. O revestimento dos esporos, cuja composição varia significativamente com a temperatura de esporulação, desempenhou apenas um papel menor na resistência dos esporos a esses agentes que danificam o DNA. Os esporos produzidos em temperaturas mais baixas exibiram maior permeabilidade à metilamina e germinaram mais rapidamente com o surfactante dodecilamina do que os esporos produzidos em temperaturas mais altas. O tratamento de esporos com o agente oxidante hidroperóxido de cumeno sensibilizou os esporos sobreviventes a todos esses agentes que danificam o DNA. A composição de ácidos graxos da membrana interna dos esporos produzidos em diferentes temperaturas diferiu significativamente, mas os níveis de ácidos graxos insaturados na membrana interna não influenciaram a resistência dos esporos a agentes danificadores de DNA ou a sensibilização a tais agentes por tratamento prévio com hidroperóxido de cumeno.

Conclusões: As taxas mais altas de permeação de metilamina através da membrana interna de esporos feitos em temperaturas mais baixas e a maior sensibilidade dos esporos do tipo selvagem feitos em temperaturas mais baixas para formaldeído e ácido nitroso e de esporos alfa-beta feitos em temperaturas mais baixas para peróxido de hidrogênio, todos agentes que devem passar através da membrana interna do esporo para danificar o DNA no núcleo do esporo, sugerem que a permeabilidade da membrana interna é um fator significativo que influencia a sensibilidade do esporo a esses agentes. A sensibilização de esporos a substâncias químicas que danificam o DNA por pré-tratamento com um agente oxidante, um tratamento que aumenta a permeabilidade da membrana interna do esporo e a germinação mais rápida de esporos produzidos em temperaturas mais baixas por dodecilamina são consistentes com essa sugestão.

Significado e impacto do estudo: Os resultados desta comunicação fornecem uma nova visão sobre os fatores que influenciam a resistência dos esporos das espécies de Bacillus a substâncias químicas que matam os esporos, danificando o DNA dos esporos.


Métodos de inativação física para Bacilo esporos

Processamento de calor convencional

Appert (1810) demonstrou que o aquecimento de alimentos em recipientes selados pode manter a prateleira estável por longos períodos em temperatura ambiente, e Bigelow et al. (1920) fez o primeiro modelo matemático relacionado ao processamento térmico como cinética de inativação de esporos log-linear (Gould, 2006 Leuschner e Lillford, 2003).

Bacilo espécies com endosporos estão presentes em vários vegetais picantes, como alho, gengibre e cebola. O tratamento de alta temperatura em uma retorta pode ser usado para esterilizar esporos resistentes ao calor. Bacilo espécies estão frequentemente presentes no leite cru e desempenham um papel importante na deterioração do leite e de produtos à base de leite, e o uso de processamento de ultra-alta temperatura (UHT) pode inativar esporos intactos de modo a atingir uma longa vida de prateleira no ambiente temperatura (Atrih e Foster, 2002 Crielly et al., 1994 Gould, 2006).

Microrganismos resistentes ao calor, como B. subtilis esporos derivados do solo podem estar presentes no leite de soja, e o tratamento convencional de longo prazo de alta temperatura do leite de soja fornece inativação suficiente para esses esporos. No entanto, os processos de aquecimento envolvendo retorta e UHT afetam negativamente o sabor, a cor e a qualidade da textura devido à desnaturação da proteína e decomposição de nutrientes em altas temperaturas de 121–135 ° C (Crielly et al., 1994 Leuschner e Lillford, 2003).

O mecanismo de resistência dos esporos ao calor úmido é desconhecido, mas pode ser multicomponente, como protoplastos de esporos com baixos níveis de água. Além disso, a mineralização dos esporos contribui para a resistência ao calor, assim como o cálcio DPA. Ao contrário da falta de compreensão do mecanismo de resistência ao calor úmido, pequenas proteínas solúveis em ácido de ligação ao DNA são uma das principais causas da resistência ao calor seco (Atrih e Foster, 2002, Crielly et al., 1994 Leuschner e Lillford, 2003).

Novo processamento térmico

O aquecimento ôhmico baseado no aquecimento por resistência elétrica foi supostamente usado para inativar microrganismos no leite em 1919 (Anderson e Finkelstein, 1919). Hoje, vários estudos usando corrente alternada de baixa frequência de 500 Hz a 20 kHz em vez de corrente alternada comercial de 50 a 60 Hz foram realizados e as condições que podem ser aplicadas a alguns produtos, como molho de pasta e bolo de peixe, foram estabelecidas. O aquecimento ôhmico com corrente alternada de baixa frequência é útil devido à maior estabilidade e eficiência energética (Uemura et al., 2010).

Até recentemente, acreditava-se que o aquecimento ôhmico matava os microorganismos por meio do efeito térmico da geração de calor uniforme e rápida. No entanto, mais e mais evidências sugerem que efeitos não térmicos podem ocorrer (Somavat et al., 2012). Os tratamentos ôhmicos nas frequências de 60 Hz e 10 kHz foram comparados com o aquecimento convencional a 121, 125 e 130 ° C por quatro tempos de espera diferentes. Ambos os tratamentos ôhmicos mostraram uma tendência geral de aceleração Geobacillus stearothermophilus inativação de esporos. Supõe-se que, sob condições de alta temperatura, as oscilações do campo elétrico das moléculas de ácido dipicolínico polar (DPA) e proteínas de esporos podem levar à inativação acelerada. No entanto, há muito pouca literatura sobre o efeito não térmico específico da eletricidade nos esporos bacterianos durante o aquecimento ôhmico. A verificação biológica eficiente do aquecimento ôhmico para realizar todo o potencial do processo requer novos métodos analíticos e de interpretação. Se houver um efeito não térmico da eletricidade no aquecimento ôhmico, pode potencialmente melhorar a qualidade reduzindo a severidade do processo (Somavat et al., 2012).

Uemura et al. (2010) estudaram o efeito da inativação de B. subtilis esporos em leite de soja com aquecimento por radiofrequência (Uemura et al., 2010). Ao processar leite de soja em uma frequência de 28 MHz, os seguintes resultados foram obtidos. Processamento de aquecimento por radiofrequência reduzido B. subtilis esporos no leite de soja por quatro ordens logarítmicas a uma temperatura de saída de 115 ° C. Ao processar o leite de soja, o filme de Teflon que cobre o eletrodo evita a formação de incrustações. O tofu feito com leite de soja aquecido por radiofrequência apresentou maior resistência ao rompimento do que o tofu feito com leite de soja aquecido convencional. Concluiu-se que o aquecimento por radiofrequência pode ser usado para melhorar a segurança da soja e a qualidade do tofu (Uemura et al., 2010).

Processamento de inativação não térmica

Atenção recente tem sido focada em métodos de inativação microbiana não térmica que são baseados em vários tipos de energia física, como altas pressões, ultrassom, campos elétricos de alta voltagem e plasma frio para inativar bactérias enteropatogênicas de origem alimentar e fungos de deterioração relacionados à deterioração de qualidade e segurança (Cho et al., 1999 Hayakawa et al., 1998 Marquez et al., 1997 Mendes-Oliveira et al., 2019).

No entanto, bactérias formadoras de endosporos, como B. subtilis exibem resistência a tratamentos físicos. Muitos novos métodos foram estudados recentemente com o propósito de superar a resistência de alguns esporos aos métodos de inativação não-térmica (Tabela 2) (Cho et al., 1999 Hayakawa et al., 1998 Marquez et al., 1997 Moreau et al., 2000 Sawai et al., 1997 Vaid e Bishop, 1998 Warrimer et al., 2000). Um estudo investigou a morte de esporos bacterianos usando um campo elétrico pulsado de alta voltagem (HVPEF) (Marquez et al., 1997). Os resultados indicaram que Bacilo os esporos foram danificados quando a intensidade do campo elétrico era ≥ 35 kV / cm. O mecanismo básico de inativação dos esporos foi explicado pela polaridade do pulso, e os íons no córtex dos esporos se tornariam uma camada de proteção que impedia a radiação de penetrar no núcleo, e o córtex foi destruído pela polarização interfacial iônica, no entanto, o mecanismo exato não estava claro ( Marquez et al., 1997). Em outro estudo, um método associado a campo elétrico de alta intensidade concentrado (CHIEF) desenvolvido pela Universidade de Minnesota tem potencial considerável como um processo comercial para pasteurização não térmica de alimentos líquidos frescos (Deng et al., 2013). A média (± desvio padrão) de inativação microbiana após submeter as amostras de leite a uma única passagem pelo CHIEF foi 2,95 (± 0,35), 2,75 (± 0,25) e 0,18 (± 0,15) log UFC / ml para Salmonella, L. monocytogenes e esporo de B. cereus, respectivamente. O efeito de inativação do tratamento de passagem única para Bacilo os esporos eram menos, mas espera-se que passagens adicionais resultem em mais redução bacteriana (Deng et al., 2013).

Hayakawa et al. (1998) relataram o uso de descompressão rápida para inativar esporos tolerantes ao calor de B. estearotermófilo IFO 12550. Abaixo de 400 MPa, esporos resistentes ao calor, como B. stearothermophilus não poderia ser esterilizado usando um método de prensagem simples (Amador-Espejo et al., 2014 Hayakawa et al., 1998). No entanto, quando a pressão de 200 MPa foi aplicada a 75 ° C por 60 min, a taxa de morte de esporos foi de 4 log CFU / ml. Este processo de inativação aumentou a permeabilidade à água em alta pressão e alta temperatura devido à destruição física da camada de esporos (Amador-Espejo et al., 2014 Hayakawa et al., 1998).

A irradiação UV é eficaz para matar bactérias formadoras de esporos que contaminam a superfície de várias substâncias. Foi estabelecido que a inativação das células por irradiação UV se deve principalmente ao efeito fatal no DNA. A exposição à radiação UV pode causar uma série de efeitos prejudiciais, como fluxo anormal de íons, aumento da permeabilidade da membrana celular e despolarização da membrana celular (Cho et al., 2012 Gayán et al. 2013 Sun et al., 2016). UV254 mostrou o efeito de inativação mais forte, o nível de B. subtilis os esporos diminuíram cerca de 3,6 log de ciclo após 3 min de exposição e redução de 2,5 log nos esporos após 3 min quando expostos a UV185 (Cho et al., 2012).

A luz intensa pulsada (IPL) é uma das tecnologias de tratamento não térmico que aplica pulsos de luz intensos e de curta duração na superfície dos alimentos. O espectro usado pelo IPL é semelhante ao da luz solar (170–2600 nm), mas a intensidade da luz é 20.000 vezes mais forte. Esta luz pode ser aplicada a superfícies de alimentos ou materiais de embalagem para matar efetivamente os microorganismos com uma redução de 3-6 log em Bacilo esporos. Embora o mecanismo de inativação do IPL não tenha sido totalmente elucidado, é geralmente aceito que a principal ação letal do IPL pode ser atribuída a mecanismos fototérmicos e / ou fotoquímicos associados à modificação química e clivagem do DNA (Anderson et al., 2000 Cho et al., Setlow 2012, 2006).


Matando esporos de Bacilo espécie por brometo de cetiltrimetilamônio

Peter Setlow, Departamento de Biologia Molecular e Biofísica, UConn Health, Farmington, CT 06030-3305, EUA.

Escola de Recursos e Engenharia Ambiental, Universidade de Ciência e Tecnologia de Jiangxi, Ganzhou, China

Departamento de Biologia Molecular e Biofísica, UConn Health, Farmington, CT, EUA

Departamento de Biologia Molecular e Biofísica, UConn Health, Farmington, CT, EUA

Departamento de Biologia Molecular e Biofísica, UConn Health, Farmington, CT, EUA

Departamento de Biologia Molecular e Biofísica, UConn Health, Farmington, CT, EUA

Peter Setlow, Departamento de Biologia Molecular e Biofísica, UConn Health, Farmington, CT 06030-3305, EUA.

Resumo

Para investigar os efeitos do surfactante catiônico brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB), um desinfetante, em esporos de Bacilo espécies.

Métodos e Resultados

A capacidade do CTAB de acionar a liberação de Bacilo O grande depósito de esporos de ácido dipicolínico (DPA) em um quelato 1: 1 com Ca 2+ (CaDPA) e para matar esporos foi investigado. Liberação de CaDPA desencadeada por CTAB de esporos de Bacillus subtilis, Bacillus cereus e Bacillus megaterium, mas não foi seguido pela conclusão da germinação. A liberação de CaDPA desencadeada por CTAB aumentou em temperaturas mais altas e foi ideal para B. subtilis esporos em pH 9,4 e 30 μg ml −1 CTAB. CTAB também matou Bacilo esporos conforme mostrado por contagens de placas e coloração vital de esporos dormentes tratados, e após sua germinação. Contudo, B. cereus e B. megaterium esporos eram mais sensíveis ao CTAB do que eram B. subtilis esporos. Liberação de CaDPA e morte de esporos isogênicos tratados com CTAB B. subtilis mutantes sem proteínas de germinação também foram examinados e comparados com os efeitos da conhecida dodecilamina germinante em esporos, para determinar como o CTAB exerce seus efeitos sobre os esporos.

Conclusões

Os resultados desta investigação mostraram que CTAB mata esporos de três Bacilo , talvez por danificar a membrana interna do esporo, embora também seja possível que alguma morte por esse agente ocorra após o desencadeamento da germinação do esporo.

Significado e impacto do estudo

Os resultados deste trabalho indicam que o CTAB também é um desinfetante, mas também um esporicida, e pode ser um coadjuvante útil na descontaminação de esporos, especialmente em altas temperaturas.


Esporos de Bacillus thermoamylovorans com resistência ao calor de nível muito alto germinam mal em meio rico, apesar da presença de ger Aglomerados, mas com eficiência após exposição ao ácido cálcio-dipicolínico

FIG 1 Comparação da contagem de esporos (log10 CFU / ml) obtido por cepa por citometria de fluxo e plaqueamento em BHI após um tratamento térmico a 80 ° C por 10 min. As contagens médias de três experimentos independentes foram plotadas e as barras de erro exibem os desvios padrão.

Germinação com germinantes nutritivos.

FIG 2 Quantificação da eficiência de germinação de esporos usando microscopia de contraste de fase. Os esporos foram ativados por calor (HA) ou não (n-HA) e expostos a BHI mais vitamina B12 (A), Ca-DPA (B) ou tampão Tris (controle). A germinação foi calculada como a porcentagem de esporos de fase escura em imagens microscópicas de contraste de fase feitas após 3, 6 e 24 horas de incubação com germinante (as imagens são mostradas por 24 horas apenas). As porcentagens médias de dois experimentos independentes foram plotadas, incluindo barras de erro baseadas em desvios padrão. Barra de escala, 2 μm.

Germinação com Ca-DPA.

Mineração de genoma para genes de germinação.

FIG 3 Visualização esquemática das estruturas de operon previstas de ger(X1)abc e ger(X2)abc, codificando receptores germinantes putativos (A), cwlJ, gerQ, cwlJ2, e gerQ2, envolvido na germinação de Ca-DPA (B), e cinco spoVA operons, spo(VA1), spo(VA2), spo(VA3), spo(VA4), e spo(VA5) (C). Os locais de ligação do fator sigma, juntamente com o limite P os valores usados ​​para sua previsão são indicados com setas pretas. O asterisco indica que cwlJ2 e gerQ2 estão presentes apenas nas cepas B4064 e B4065 (A). o spoVA operons 2, 3 e 4 [spo(VA2), spo(VA3), e spo(VA4)] ao lado de spoVA os genes também contêm genes que codificam proteínas hipotéticas, indicadas com setas cinza claro e locais de ligação do fator sigma interno previstos (C). Operon spo(VA2), contendo o spo(VA2)C e spo(VA2)D genes, está localizado na borda do contig nos genomas de todos os isolados alimentares de B. thermoamylovorans. Assim, a sequência de nucleotídeos e os promotores previstos a montante dos dois genes que codificam proteínas hipotéticas (indicados como h **) são desconhecidos. No entanto, como a sequência de nucleotídeos dos dois h ** genes que codificam proteínas hipotéticas no operon spo(VA2) é muito semelhante à sequência do h ** gene na frente do spo(VA3)C gene no operon spo(VA3), é provável que as sequências a montante dos operons spo(VA2) e spo(VA3) são semelhantes (C). As escalas abaixo de cada parte da figura indicam distâncias em pares de bases de nucleotídeos.

Modelagem e inativação por calor de esporos.

FIG 4 (A a D) Gráficos de inativação por calor de esporos de B. thermoamylovorans cepas B4065 (A), B4166 (B), B4167 (C) e B4064 (D) a 110 ° C. (E e F) Para a cepa B4064, esta inativação de esporos foi adicionalmente determinada a 115 ° C (E) e 120 ° C (F). Para todas as cepas, duas culturas de esporos independentes foram expostas a um tratamento térmico, seguido de exposição a Ca-DPA (40 mM por 3 h) ou não antes da contagem dos sobreviventes. Os círculos abertos e quadrados abertos correspondem às culturas de esporos 1 e 2, respectivamente, sem tratamento com Ca-DPA. Os círculos fechados e os quadrados fechados correspondem às culturas de esporos 1 e 2, respectivamente, com tratamento com Ca-DPA.

Conteúdo

Compromisso com a edição de esporulação

Embora a esporulação em B. subtilis é induzida pela fome, o programa de desenvolvimento da esporulação não é iniciado imediatamente quando o crescimento diminui devido à limitação de nutrientes. Uma variedade de respostas alternativas pode ocorrer, incluindo a ativação da motilidade flagelar para buscar novas fontes de alimento por quimiotaxia, a produção de antibióticos para destruir micróbios competidores do solo, a secreção de enzimas hidrolíticas para eliminar proteínas extracelulares e polissacarídeos, ou a indução de 'competência 'para absorção de DNA exógeno para consumo, com o efeito colateral ocasional de que a nova informação genética é integrada de forma estável. A esporulação é a última resposta à fome e é suprimida até que respostas alternativas se mostrem inadequadas. Mesmo assim, certas condições devem ser atendidas, como integridade cromossômica, o estado de replicação cromossômica e o funcionamento do ciclo de Krebs. [1]

Natureza do regulamento Editar

A esporulação requer muito tempo e também muita energia e é essencialmente irreversível, [2] tornando crucial para uma célula monitorar seu entorno de forma eficiente e garantir que a esporulação seja iniciada apenas nos momentos mais apropriados. A decisão errada pode ser catastrófica: uma célula vegetativa morrerá se as condições forem muito adversas, enquanto as bactérias que formam esporos em um ambiente que é propício ao crescimento vegetativo serão eliminadas. [3] Em suma, o início da esporulação é uma rede rigidamente regulamentada com vários pontos de verificação para controle eficiente.

Dois reguladores transcricionais, σH e Spo0A, desempenham papéis importantes na iniciação da esporulação. Várias proteínas adicionais participam, principalmente controlando a concentração acumulada de Spo0A

P. Spo0A encontra-se no final de uma série de reações de fosfotransferência interproteínas, Kin – Spo0F – Spo0B – Spo0A, denominado como um ‘fosforelay’. A regulação desses vários fatores controlando a concentração acumulada de Spo0A

P, e suas interações são descritas em detalhes na Figura 2:

Na tabela abaixo, o termo 'Ativadores refere-se a genes / proteínas que resultam na iniciação da esporulação e 'Repressores refere-se àqueles que inibem o início da esporulação.

Os esporos fazem parte dos ciclos de vida de uma ampla gama de organismos, como muitas bactérias, plantas, algas, fungos e alguns protozoários. No Saccharomyces cerevisiae (Kingdom Fungi), o conjunto de genes iniciais que ativam a esporulação é induzido por Ime1 (Indutor de Meiose 1) e um regulador de genes intermediários é o Ndt80p. [4] Da mesma forma, em Dictyostelium discoideum (mofo viscoso), SDF-2 e citocininas são secretados durante o desenvolvimento tardio para desencadear as vias de transdução de sinal que levam a um aumento na atividade da proteína quinase dependente de cAMP, PKA, que desencadeia encapsulamento rápido, bem como garante dormência de esporos. [5]


Aplicação de Bacillus subtilis na agricultura, biomateriais e medicina

Por ser um probiótico não patogênico, B. subtilis é frequentemente usado como um aditivo microbiano para melhorar a função intestinal em animais. Foi descoberto que promove o crescimento animal e previne doenças [80]. Pode ser fabricado na forma de endosporos, que então entram no trato intestinal dos animais e rapidamente se reativam para secretar proteases altamente ativas, como lipases e amilases no trato intestinal superior, o que é útil para degradar carboidratos complexos na alimentação das plantas. Além disso, B. subtilis pode produzir polipeptídeos que têm um efeito antagônico contra patógenos intestinais, melhorando efetivamente a digestibilidade da ração. Além disso, pode ser usado na biorremediação da água e prevenir doenças em organismos da aquicultura como camarão e peixes [7]. Porque B. subtilis é uma bactéria aeróbia, que contribui para o ambiente anaeróbio ao consumir oxigênio nos intestinos, que por sua vez promove a reprodução das bactérias dominantes no intestino, mantendo o equilíbrio ecológico dos intestinos.

B. subtilis pode secretar uma variedade de peptídeos antimicrobianos de baixo peso molecular e bacteriocinas, como surfactina [81], bacilisina [82] e subtilina [83], que têm valor potencial em engenharia biomédica, alimentos e agricultura [84]. Peptídeos antimicrobianos de B. subtilis são ferramentas terapêuticas promissoras, devido à sua ampla atividade e rápida atividade de matar contra uma variedade de patógenos. Com os problemas crescentes de resistência microbiana devido ao uso não racional de antibióticos convencionais, os peptídeos antimicrobianos irão desempenhar um papel mais significativo no tratamento de infecções bacterianas [85]. Os peptídeos antimicrobianos também têm as vantagens de segurança e respeito ao meio ambiente. Eles são amplamente utilizados como aditivos para rações na agricultura e pecuária para melhorar a digestão das fibras animais e a saúde intestinal. B. subtilis pode melhorar o equilíbrio da flora intestinal e tem potencial para melhorar a saúde intestinal e a eficiência da absorção de alimentos. Estudos têm mostrado que adicionar B. subtilis esporos para alimentação de gado leiteiro podem melhorar a produção de leite e proteína [86]. Além disso, adicionando B. subtilis para a dieta de poedeiras pode melhorar seu desempenho, bem como a qualidade da casca dos ovos produzidos por galinhas poedeiras envelhecidas [87].

Biofilmes são comunidades estruturadas de células fortemente associadas que constituem o estado predominante de crescimento bacteriano em ambientes naturais e feitos pelo homem [88]. Biofilmes podem ser usados ​​para produzir materiais vivos com funções de autocura, que são desejáveis ​​para muitos produtos [89]. B. subtilis pode formar biofilmes complexos e robustos e é uma boa cepa modelo para estudar a formação de biofilmes. Estudos recentes têm mostrado que biofilmes baseados no mecanismo da proteína amilóide TasA em B. subtilis exibem comportamento viscoelástico dos hidrogéis. Estudos têm mostrado que os biofilmes podem ser fabricados com precisão em várias microestruturas tridimensionais (3D) por meio de impressão 3D e tecnologia de microencapsulação [90]. Comparado com materiais químicos, este material vivo artificial tem atividade metabólica, capacidade de auto-renovação e programabilidade [89]. Além disso, a capacidade de B. subtilis formar biofilmes promove a síntese de pentapeptídeo quorum sensing e óxido nítrico (NO), que pode atrasar o envelhecimento do hospedeiro [91]. A formação de biofilme melhora a capacidade dos microrganismos de metabolizar nutrientes e produzir produtos químicos e pode ser usada para melhorar a estabilidade dos processos de fermentação. Estudos recentes mostram que um reator de biofilme pode promover a secreção extracelular de MK-7 [92].

Quando confrontado com a fome, B. subtilis produz endosporos que podem sobreviver por muito tempo em um estado de anabiose. E quando os nutrientes estão disponíveis, ele germina novamente [93]. Esta característica conduz ao sucesso da expressão de antígenos heterólogos ou ao aumento da atividade relativa, termoestabilidade, estabilidade do pH e capacidade de reutilização de enzimas na superfície dos esporos. A enorme resistência ao estresse dos endosporos pode ser cooptada para melhorar a estabilidade e promover a reutilização de enzimas em ambientes complexos [94]. Além disso, a tecnologia de exibição de superfície de esporos foi recentemente aplicada com sucesso na produção de polímeros de proteínas, vacinas e enzimas industriais [95]. Enzimas como a lipase e a quitinase foram expressas com sucesso na superfície dos endosporos [94].

Conclusões e perspectivas futuras

Como a principal espécie modelo de bactérias Gram-positivas, B. subtilis has a broad array of mature genetic tools, promoters, and plasmid expression systems, which can be used in metabolic engineering, protein expression, and synthetic biology. It can produce chemicals, enzymes, and other industrial bio-products, but also be used as a platform for vaccine preparation or a feed additive in agriculture. Moreover, it is also an ideal model for studying biofilm formation and other physiological characteristics of attached cells. This paper reviewed the advantages of B. subtilis as a chassis cell from several aspects, including genetic manipulation, and heterologous gene expression, as well as its application in industry, agriculture, and medicine.

However, although B. subtilis has various attractive applications, it remains far less studied than its Gram-negative counterpart, E. coli. This remains true even in the present era with rich methodology and rapid tool development. One major bottleneck in the application of new methods attribute to the lower efficiency of plasmids construction in B. subtilis compared with E. coli. To solve this, future engineered strains of B. subtilis can be developed to allow direct plasmid construction. Conversely, the high recombination rate of B. subtilis has some advantages for the development of genome editing tools.

Our goal was to provide reads with a general understanding of the characteristics of B. subtilis, so one can take advantage of its features for certain applications or research purposes. Of course, as more and more scientists and engineers contribute studies on B. subtilis, more technologies, tools, and methods will be applied to B. subtilis in the future, and the potential of this bacterium for scientific and industrial applications will be enhanced further.


Assista o vídeo: Bacillus Subtilis 001 (Fevereiro 2023).