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15.8: Da Engenharia Genética e Modificação Genética - Biologia

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Ao permitir que nos concentremos em como os genes e sua regulação evoluíram, essas tecnologias genômicas, transcriptômicas e proteômicas aumentaram enormemente nosso conhecimento de como as células funcionam em nível molecular. Continuamos a aumentar nosso conhecimento sobre o processo da doença e, pelo menos em alguns casos, como podemos tratá-la. O uso de tecnologias para modificar geneticamente organismos é mais polêmico, apesar das melhores intenções humanas. Alguns organismos geneticamente modificados (OGM) visam aumentar a produtividade dos alimentos para melhor alimentar o mundo. A introdução de genes "benéficos" em alguns OGMs fez:

  • safras resistentes à seca para aumentar a área onde as principais safras de alimentos podem ser cultivadas.
  • culturas resistentes a pragas para reduzir a dependência de pesticidas químicos tóxicos para o meio ambiente.
  • colheitas resistentes a herbicidas que sobrevivem a produtos químicos usados ​​para destruir plantas prejudiciais.

A busca por variedades “melhoradas” de plantas e animais vem acontecendo desde antes da história registrada. Os fazendeiros têm cruzado vacas, ovelhas, cachorros e variedades de culturas de milho a trigo, na esperança de encontrar variedades de crescimento mais rápido, maiores e mais resistentes (você escolhe). É a manipulação do DNA (a essência do próprio material genético) que está na origem da controvérsia. A controvérsia se reflete nas opiniões de que os alimentos OGM são potencialmente perigosos e que seu cultivo deve ser proibido. No entanto, o consenso geral é que tentar proibir os OGM é tarde demais! Na verdade, você provavelmente já está comendo alguns alimentos OGM sem nem mesmo saber. Talvez a boa notícia seja que, depois de muitos anos de plantações OGM já em nossa corrente alimentar, o consenso científico emergente é que os alimentos OGM não são mais prejudiciais do que os alimentos não modificados. O debate atual é rotular ou não os alimentos que são (ou contêm) ingredientes OGM como geneticamente modificados.

Em uma abordagem estranha, mas talvez divertida, do desconforto que algumas pessoas sentem sobre os OGM, uma empresa iniciante modificou geneticamente Petúnias. Quando cultivadas em água, suas flores são brancas, mas quando "regadas" com cerveja, elas produzem flores rosa ou roxas, dependendo da quantidade de cerveja que recebem (confira em Can Beautiful Flowers Change Face?). Segundo a empresa, eles buscam “levar o que considera a beleza da bioengenharia para o público em geral” (e talvez algum lucro também?).

Mais recentemente, temos o CRISPR e ferramentas relacionadas que podem editar com precisão as sequências de genes (na verdade, qualquer DNA). E, ao contrário dos “remédios charlatães” de antigamente, essas ferramentas têm o real potencial para curar doenças, destruir vetores transmissores de doenças, curar câncer, melhorar plantações e possivelmente alterar o curso da evolução. A velocidade com que alguém pode realizar esse bem (ou mal) é realmente impressionante.


Integrando a Genômica nas Políticas e Práticas de Saúde Pública

Esta página da web é arquivada para fins históricos e não está mais sendo mantida ou atualizada.

por Laura M. Beskow, Marta Gwinn e Mark A. Rothstein

Fundo

O Projeto Genoma Humano, um esforço colaborativo contínuo para desvendar os mistérios do DNA humano, gerou grandes expectativas entre os cientistas e o público. Espera-se que os rápidos avanços na genética humana e as tecnologias associadas (como & ldquogene chips & rdquo) tragam novos desenvolvimentos importantes na medicina e na saúde pública. O Dr. Francis Collins, diretor do National Human Genome Research Institute, prevê um futuro em que a prevenção de doenças e os conselhos de tratamento sejam adaptados aos genótipos dos pacientes, com tais conselhos tomando a forma de vigilância médica mais frequente ou precoce, estilo de vida ou modificações dietéticas, ou direcionados terapia medicamentosa (1) Collins e McKusick prevêem que a avaliação genética dos riscos de doenças individuais e respostas aos medicamentos chegará aos cuidados de saúde convencionais logo na próxima década (2).

Junto com a empolgação com a perspectiva de intervenções sob medida, no entanto, há alguma incerteza. O que as descobertas de genes - aparentemente anunciadas diariamente - significam para a saúde pública? Até recentemente, o campo da genética tinha sido confinado em grande parte ao reino de doenças raras causadas por mutações em genes únicos. Mesmo assim, a comunidade de saúde pública incluiu componentes genéticos em alguns de seus trabalhos, experimentando sucessos notáveis ​​na prevenção de defeitos congênitos, triagem neonatal para erros inatos do metabolismo e desenvolvimento da capacidade de serviços genéticos. Hoje, as conquistas crescentes do Projeto Genoma Humano exigem uma reavaliação do papel da genômica em todas as condições de interesse para a saúde pública. Praticamente todas as doenças humanas resultam da interação entre fatores de suscetibilidade genética e o meio ambiente, amplamente definida para incluir qualquer fator exógeno & mdashquímico, físico, infeccioso, nutricional, social ou comportamental. Este conceito de interação gene-ambiente pode ajudar a explicar por que, por exemplo, alguns indivíduos preocupados com a saúde com níveis de colesterol & ldquoaceitável & rdquo sofrem infartos do miocárdio aos 40 anos de idade, enquanto outros parecem imunes a doenças cardíacas apesar de anos de tabagismo, dieta pobre e falta de exercício. Desvendar a complexa interação entre genes e meio ambiente levará a uma melhor compreensão da base biológica das doenças e a novos caminhos para melhorar a saúde e prevenir doenças. (Usamos o termo & ldquogenomics & rdquo para denotar essa visão expandida de genes e produtos gênicos dentro de um sistema completo de genes e fatores ambientais.)

Cumprir essa promessa representa uma ambiciosa agenda de liderança em saúde pública. Existe uma imensa lacuna entre os produtos científicos do Projeto Genoma Humano e nossa capacidade de usar informações genéticas para beneficiar a saúde, e preencher essa lacuna requer uma ampla gama de atividades de saúde pública. Por exemplo

  • A pesquisa em saúde pública é necessária para traduzir informações sobre genes e sequências de DNA em conhecimento sobre a suscetibilidade genética a doenças e as interações entre essas suscetibilidades e fatores de risco modificáveis.
  • A comunidade de saúde pública deve ajudar a formular políticas que promovam o uso seguro e apropriado da informação genética.
  • Os profissionais de saúde pública devem trabalhar com outros setores da saúde para garantir que testes genéticos válidos estejam disponíveis e acessíveis & mdashespecialmente em populações carentes & mdashand para garantir que as pessoas tenham acesso a intervenções comprovadas.
  • A saúde pública tem um papel importante em facilitar a comunicação e a educação sobre genômica entre todas as partes interessadas, incluindo profissionais de saúde, o público em geral, pacientes, cientistas, formuladores de políticas e pessoal da indústria farmacêutica, de biotecnologia e de seguros.
  • A saúde pública também tem um papel crucial na avaliação do impacto e da relação custo-eficácia da integração da genômica na promoção da saúde e nos programas de prevenção de doenças.

A triagem neonatal, ou mais geralmente a triagem em massa obrigatória, é um paradigma para a integração da genômica na saúde pública. Outro é obrigatório oferta de testes genéticos, como as leis da Califórnia (& sect125050-125110) que exigem que todas as mulheres grávidas (antes de um certo ponto da gestação) recebam informações sobre a triagem pré-natal para defeitos congênitos do feto. No entanto, para doenças comuns e complexas, as interações gene-ambiente envolvidas na maioria das vezes aumentam o risco de uma pessoa para a doença, mas não prediz definitivamente se ela tem ou terá a doença. Da mesma forma, as intervenções ambientais baseadas no genótipo podem ajudar a reduzir o risco, mas não necessariamente prevenir ou tratar a doença. Assim, ao invés da triagem obrigatória, outro paradigma para a integração da genômica na saúde pública poderia ser semelhante ao sugerido pelo Dr. Collins, que é fornecer aos indivíduos quem deseja saber com informações sobre suas suscetibilidades genéticas pessoais, juntamente com conselhos de redução de risco personalizados. A farmacogenômica, a ciência que compreende a correlação entre a composição genética de um indivíduo e sua resposta ao tratamento com drogas, representa outra aplicação potencialmente difundida de testes baseados em DNA. Assim, embora programas como a triagem neonatal continuem a ser uma atividade importante e valiosa de saúde pública, outros modelos podem existir para futuros programas de prevenção envolvendo genômica, particularmente aqueles focados em doenças comuns e complexas.

A integração da genômica à pesquisa, política e prática de saúde pública levanta muitas das mesmas questões jurídicas discutidas ao longo deste livro. Embora o acréscimo de um componente genético a essas atividades não altere necessariamente as considerações jurídicas fundamentais, a sociedade investe enorme poder no conceito de genética. Ideias mal colocadas de determinismo genético (o futuro de uma pessoa é definido e fixado por sua composição genética) e reducionismo genético (todas as características, problemas de saúde e comportamentos são atribuíveis à genética) têm implicações negativas significativas para a saúde pública e mensagens de prevenção (3) Além disso, a genética e suas aplicações em nome da & ldquopública saúde & rdquo carregam o ônus histórico da eugenia, um movimento que incluiu leis de higiene racial na Alemanha nazista, bem como esterilização forçada, leis antimiscigenação e políticas restritivas de imigração nos Estados Unidos e em todo o mundo (4) As primeiras experiências com o rastreamento de adultos para a doença falciforme também pressagiam questões que devem ser enfrentadas na aplicação do conhecimento genético (5) Esses programas às vezes eram oferecidos sem fornecer educação adequada, consentimento e acompanhamento e, como resultado, os portadores que foram identificados (e que não tinham risco de desenvolver a doença) sofreram estigmatização e discriminação (6).

Os comentaristas anteriores abordaram questões éticas, legais e sociais associadas aos testes genéticos (7,8) e com pesquisa genética (9,10) Este capítulo enfoca questões jurídicas selecionadas que surgem com a integração da genômica nas políticas e práticas de saúde pública.

Autoridades Legais

A promessa da informação genética é temperada por várias preocupações sobre seu uso indevido e essas preocupações têm sido objeto de uma variedade de atividades legislativas. A Conferência Nacional de Legislaturas Estaduais fornece uma compilação regularmente atualizada de leis genéticas estaduais relacionadas a uma série de questões, como adoção, engenharia genética e clonagem, direito penal e forense, emprego, seguro, pesquisa e testes médicos, paternidade e privacidade (11) Aqui, destacamos como exemplos duas categorias de tais atividades legislativas: as que visam à discriminação genética no emprego e as que envolvem seguro saúde nos níveis estadual e federal. As preocupações sobre a discriminação no seguro e no emprego podem ser de particular importância para a saúde pública porque o medo da discriminação pode impedir os indivíduos de buscar aconselhamento genético ou testes que poderiam beneficiar sua saúde ou de participar de valiosas pesquisas genéticas (12).

Nível estadual

Em 2000, a American Management Association entrevistou 2.133 gerentes de recursos humanos sobre exames médicos de funcionários no local de trabalho. Quando apresentado com uma definição específica de teste genético, apenas sete (0,3%) entrevistados responderam que suas empresas realizaram tais testes (13) Proporções substancialmente maiores relataram testes de suscetibilidade a riscos no local de trabalho e obtenção de históricos médicos familiares (15,8% e 18,1%, respectivamente).

Mais da metade dos estados promulgaram leis que proíbem a discriminação genética no emprego (11) Todos eles proíbem a discriminação com base nos resultados de testes genéticos e todos proíbem a discriminação genética na contratação, demissão ou nos termos de emprego. Alguns também cobrem informações sobre testes genéticos, história familiar ou características herdadas. Por exemplo, a Carolina do Norte (& sect95-28.1A) proíbe a discriminação no emprego & ldquoon conta da pessoa que solicitou testes genéticos ou serviços de aconselhamento, ou com base nas informações genéticas obtidas sobre a pessoa ou um membro da família da pessoa & rsquos. & Rdquo O estatuto define "Informações quogenéticas" como "informações sobre genes, produtos genéticos ou características herdadas que podem derivar de um indivíduo ou membro da família." Muitas dessas leis também proíbem os empregadores de solicitar ou exigir informações genéticas, realizar testes genéticos ou obter informações genéticas. Em Nova York (& sect296.19 (a)), por exemplo, é ilegal para os empregadores 1) direta ou indiretamente solicitar, exigir ou administrar um teste genético a uma pessoa como condição ou emprego, ou 2) comprar ou de outra forma adquirir os resultados ou interpretação dos resultados de um teste genético individual ou fazer um acordo com um indivíduo para fazer um teste genético ou fornecer os resultados do teste genético.

Vinte e nove estados proíbem as seguradoras de saúde de buscar, exigir ou usar informações genéticas para determinar a elegibilidade para seguro e 38 estados proíbem classificação, cancelamento ou negação de seguro com base em informações genéticas (11) A lei de Maryland (Ins & sect27-909) proíbe as seguradoras, planos de serviços de saúde sem fins lucrativos e organizações de manutenção da saúde de 1) usar um teste genético, os resultados de um teste genético, informações genéticas ou uma solicitação de serviços genéticos para rejeitar , negar, limitar, cancelar, recusar renovar, aumentar as taxas de, afetar os termos ou condições de, ou de outra forma afetar uma apólice ou contrato de seguro saúde e 2) solicitar ou exigir um teste genético, os resultados de um teste genético ou informação genética para determinar se deve emitir ou renovar a cobertura de benefícios de saúde. As leis estaduais de seguro saúde são substituídas pelo Employee Retirement Income Security Act (ERISA) (29 U.S.C. Cap. 18) na medida em que tentam regular os planos de saúde de grupo baseados no empregador. Assim, o principal valor das leis estaduais é proibir a discriminação no seguro saúde individual.

Hall e Rich (14) avaliaram recentemente se esses tipos de leis reduzem a extensão da discriminação genética por parte das seguradoras de saúde. A partir de dados coletados em vários locais, eles não encontraram quase nenhum caso bem documentado de seguradoras de saúde pedindo ou usando resultados de testes genéticos pré-sintomáticos em suas decisões de subscrição, antes ou depois que essas leis foram promulgadas ou em estados com ou sem essas leis. Eles concluíram, no entanto, que tais leis tornaram menos provável que as seguradoras usem informações genéticas no futuro e que, embora as seguradoras e os agentes estejam apenas vagamente cientes das leis, as leis moldaram as normas da indústria e atitudes sobre a legitimidade do uso Essa informação. Os autores também observaram que os casos de consequências adversas do seguro saúde que descobriram diziam respeito ao pagamento por serviços genéticos (por exemplo, aconselhamento genético, testes, serviços de prevenção) em vez da disponibilidade e preços do seguro saúde. O pagamento por serviços relacionados à genética é uma barreira importante ao acesso que as leis de discriminação genética não abordam.

Nível federal

Embora vários projetos de lei tenham sido apresentados na última década, nenhuma legislação federal foi aprovada diretamente relacionada à discriminação genética na cobertura de seguro individual ou no emprego. O 107º Congresso (2001 e ndash02) apresentou vários desses projetos (por exemplo, H.R.602, S.318) que proibiriam planos de saúde e seguradoras de discriminar com base em informações genéticas protegidas e também tornariam ilegal a discriminação por causa de informações genéticas protegidas. Esses projetos de lei definem "informações genéticas protegidas" como 1) informações sobre testes genéticos de um indivíduo 2) informações sobre testes genéticos de membros da família do indivíduo ou 3) informações sobre a ocorrência de uma doença ou distúrbio em membros da família.

Além da legislação específica, entretanto, outras leis federais antidiscriminação se aplicam à genética. Esses incluem:

  • Uma ordem executiva assinada pelo presidente Clinton em fevereiro de 2000 proibindo a discriminação no emprego federal com base em informações genéticas (15).
  • A Lei dos Americanos com Deficiências de 1990 (ADA) (Pub. L. 101-336), que cobre os indivíduos que têm uma deficiência física ou mental que limita substancialmente uma atividade importante na vida, têm um registro de tal deficiência ou são considerados tendo tal deficiência. A Equal Opportunity Employment Commission (EOEC) emitiu uma interpretação do ADA afirmando que as entidades que discriminam indivíduos com base em informações genéticas consideram esses indivíduos como tendo deficiências (16) Esta interpretação não vincula os tribunais, no entanto, e a jurisprudência subsequente lança dúvidas sobre se seria mantida. No Sutton v. United Airlines, Inc. (17), a Suprema Corte considerou que, ao determinar a gravidade de uma deficiência de acordo com o ADA, a condição deve ser considerada em seu estado atenuado, como no caso de óculos ou medicamentos. Significativamente, o Tribunal argumentou que o Congresso pretendia que a cobertura da ADA & rsquos fosse limitada aos 43 milhões de americanos que o Congresso estima como portadores de deficiências graves. De acordo com o Tribunal, se fossem incluídos os indivíduos com deficiências & ldquomitigadas & rdquo, a cobertura ultrapassaria em muito esse valor. Se raciocínio semelhante fosse aplicado a indivíduos assintomáticos com risco geneticamente aumentado de doença, a conclusão seria que eles também não são cobertos pelo ADA. Em 2001, o EOEC decidiu sua primeira ação judicial contestando o uso de testes genéticos no local de trabalho, quando uma empresa ferroviária dos Estados Unidos concordou em parar de exigir testes genéticos de funcionários que apresentassem reivindicações de síndrome do túnel do carpo (18).
  • O Health Insurance Portability and Accountability Act de 1996 (HIPAA) (Pub. L. 104-191) proíbe os planos de saúde em grupo com base no empregador de usar qualquer fator relacionado ao estado de saúde, incluindo informações genéticas, como base para negar ou limitar a elegibilidade para cobertura ou para cobrar mais de um indivíduo pela cobertura (consulte o Capítulo 8). A HIPAA também limita as exclusões para doenças pré-existentes e declara explicitamente que a informação genética na ausência de um diagnóstico atual não deve ser considerada uma condição pré-existente.

Uma questão chave na elaboração de abordagens legislativas que promovam o uso apropriado da genômica é se a informação genética deve ser tratada separadamente ou como parte das medidas destinadas a abordar as informações de saúde de forma mais ampla. Essa controvérsia tem implicações importantes para a integração da genômica nas atividades de vigilância em saúde pública.

Excepcionalismo Genético

O desafio de definir o termo & ldquogenética & rdquo é uma das dificuldades conceituais decorrentes do excepcionalismo genético & mdash a prática de tratar a informação genética como diferente de outros tipos de informação de saúde e proporcionar-lhe privacidade e segurança especiais.Teoricamente, tudo, desde os resultados de um teste de DNA até observações de rotina sobre sexo, cor dos olhos e tipo de sangue, pode ser classificado como informação genética. Definições legislativas restritas (por exemplo, & ldquothe resultados da análise de DNA & rdquo) podem não atingir os objetivos políticos desejados, como proteger os indivíduos da discriminação genética porque não se aplicam, por exemplo, ao histórico de saúde da família. Por outro lado, definições amplas (por exemplo, "informações sobre genes, produtos genéticos ou características herdadas") podem impedir atividades médicas e de saúde pública importantes. Gostin e Hodge (19) apresentam uma análise da extensão em que as informações genéticas são iguais ou diferentes de outras informações de saúde e concluem que não são tão diferentes a ponto de justificar legal e eticamente o status especial.

Michigan criou a Comissão de Michigan sobre Privacidade e Progresso Genético em 1997 para aconselhar o governador e a legislatura sobre questões específicas da genética. Em seu relatório final (20), a Comissão recomendou que qualquer legislação deve considerar a genética no contexto das questões médicas como um todo e, portanto, as proteções de privacidade devem abranger todas as informações médicas confidenciais. Também recomendou limitar a legislação às áreas nas quais os padrões profissionais e códigos de ética são insuficientes para proteger o bem público e os direitos individuais e evitar a legislação que proíbe ou impede de forma inadequada os testes genéticos e pesquisas benéficas.

Em resposta a este relatório, Michigan aprovou uma série de leis que tratavam de questões como consentimento informado antes da realização de um teste genético (& sect333.17020), bem como discriminação genética no emprego (& sect37.1201) e seguro (& sect500.3407b) . Nessas leis, & ldestequogenético & rdquo é definido como & ldquothe análise de DNA humano, RNA, cromossomos e as proteínas e metabólitos usados ​​para detectar genótipos hereditários ou relacionados a doenças somáticas ou cariótipos para fins clínicos, & rdquo e & ld informações quogenéticas & rdquo são definidas como & ldquoinformações sobre um gene, produto gênico ou característica herdada derivada de um teste genético. & rdquo Essas definições são semelhantes às sugeridas por outros grupos de especialistas (8,21) Michigan não tem, entretanto, leis que ofereçam proteções especiais de privacidade para informações genéticas, além das leis que já cobrem as interações profissional-paciente, confidencialidade de pesquisa e privacidade médica em geral. Também não prevê direitos de propriedade sobre amostras ou informações genéticas, embora os pacientes tenham direitos de acesso às informações médicas.

Vigilância em Saúde Pública

Uma das principais funções da saúde pública é a vigilância da saúde pública. Ao coletar e analisar informações sobre surtos de doenças, os epidemiologistas podem determinar a causa provável dos eventos adversos à saúde e apontar o caminho para a prevenção e intervenção precoce. À medida que se conhece mais sobre a relação entre fatores genéticos e ambientais na etiologia de doenças complexas, a obtenção de informações genéticas de populações expostas e afetadas pode ser importante como parte de uma vigilância abrangente de saúde pública. Independentemente de a adição de informações genéticas às atividades de vigilância ser considerada qualitativa ou meramente quantitativamente diferente, a questão é se é lícito aos agentes governamentais exigir a coleta dessas novas informações.

Desafios jurídicos à coleta de informações de saúde pelo governo geralmente envolvem reivindicações constitucionais, como busca e apreensão ilegal, proteção igualitária e devido processo legal (ver Capítulo 7). Sob todas essas teorias constitucionais, os tribunais equilibram o interesse público em obter as informações de saúde com o interesse individual em evitar a divulgação. Uma consideração importante é o possível dano ao indivíduo que pode resultar da divulgação de informações privadas. & ldquoEmbora o risco real de dano social causado diretamente pela vigilância seja baixo, os riscos percebidos (e maiores ameaças reais que surgem em outros ambientes) podem criar um contexto no qual a coleta de dados de saúde pública é politicamente problemática ou resistida pelos sujeitos & rdquo (22) Reduzir a ansiedade do público sobre a divulgação de informações de saúde é um empreendimento inexato, mas as seguintes medidas sem dúvida ajudariam:

  1. Promulgando uma forte legislação de privacidade de saúde que limita o uso das informações para fins de saúde pública, protege os registros do acesso indevido por partes não autorizadas, prevê que as informações devem ser mantidas e usadas da forma menos identificável consistente com fins de saúde pública e fornece condições severas penalidades por violações
  2. Educar o público sobre a existência e disposição de tal legislação de privacidade na saúde e
  3. Promulgação de leis que proíbem a discriminação não razoável com base na saúde por entidades dos setores público e privado.
Considerações Práticas

A comunidade de saúde pública tem um papel importante a desempenhar na tradução de descobertas genéticas em oportunidades para melhorar a saúde e prevenir doenças de forma a maximizar os benefícios do uso de informações genéticas, minimizar os riscos e conservar os recursos de saúde. Leis e políticas relacionadas a programas e estratégias de saúde pública, recursos humanos, considerações científicas e técnicas e interesses financeiros e do consumidor serão ferramentas importantes no desempenho dessa função. Triagem neonatal, licenciamento profissional e supervisão de testes genéticos são exemplos de áreas em que a aplicação da lei e da genômica já se cruzam.

Triagem Neonatal

A triagem neonatal para doenças genéticas começou na década de 1960, possibilitada por uma nova tecnologia de coleta de amostras de sangue e um teste laboratorial simples e barato para triagem de fenilcetonúria (PKU). Como o rastreamento de PKU demorou a se tornar parte dos cuidados médicos de rotina, os defensores das crianças pressionaram por uma legislação estadual que acabou levando à triagem neonatal em todos os 50 estados e no Distrito de Columbia (23) Programas de rastreamento em todo o estado foram lançados sem uma avaliação completa da validade do teste de rastreamento ou da utilidade da intervenção dietética para prevenir o retardo mental em crianças com PKU. No entanto, a triagem neonatal para PKU agora é geralmente reconhecida como um sucesso de saúde pública.

Quase todos os 4 milhões de bebês nascidos nos Estados Unidos a cada ano são examinados para PKU e de dois a 10 outros distúrbios. Os departamentos de saúde estaduais são responsáveis ​​por realizar a triagem neonatal de acordo com as leis ou regulamentos estaduais. Na ausência de diretrizes federais, os números e tipos de testes de triagem realizados variaram de estado para estado e ao longo do tempo, à medida que os testes foram adicionados e subtraídos dos painéis de triagem dos laboratórios estaduais (24) Essa falta de uniformidade e o advento de novas tecnologias de triagem (25,26) levou a Administração de Recursos e Serviços de Saúde federal a solicitar à Academia Americana de Pediatria que formasse uma Força-Tarefa de Triagem Neonatal. Em agosto de 2000, a Força-Tarefa publicou recomendações que convocavam funcionários públicos federais e estaduais, provedores de saúde e grupos de defesa a trabalharem juntos para desenvolver diretrizes atualizadas para programas de triagem neonatal, ao mesmo tempo em que abordavam as principais questões éticas, legais e sociais (27,28) Essas questões incluem consentimento informado, a confidencialidade dos resultados da triagem, o uso de amostras de sangue residuais para pesquisas e a necessidade de aumentar a conscientização do público e dos profissionais sobre a capacidade e as limitações dos programas de triagem neonatal.

As políticas estaduais sobre o consentimento dos pais para a triagem neonatal variam amplamente. Maryland tem um programa de triagem neonatal voluntário, Wyoming solicita consentimento informado e Massachusetts desenvolveu um processo de consentimento informado para um estudo piloto de triagem neonatal para fibrose cística (27) Em todos os outros estados, a triagem neonatal é obrigatória, embora a maioria dos estados permita a recusa dos pais. O relatório da Força-Tarefa recomendou que & ld Abordagens adicionais para informar e educar os pais sejam mais estudadas & rdquo (27).

Muitos programas estaduais adicionaram a triagem neonatal para anemia falciforme na década de 1980, chamando atenção renovada para a questão da confidencialidade dos resultados dos testes de triagem (29) Mais recentemente, o crescimento de bancos de dados eletrônicos para triagem neonatal e outros registros de saúde pública acrescentou outra dimensão a esta questão (30) As tentativas de coordenar e avaliar melhor os programas de saúde infantil e infantil levaram a uma maior integração de sistemas de informação que antes eram amplamente independentes. A vinculação e o compartilhamento de dados exigem novos métodos para salvaguardar a confidencialidade (27).

Amostras residuais de programas de triagem neonatal tornaram-se reconhecidas como um recurso rico para estudos de pesquisa. Essas amostras representam um & ldquobiobank & rdquo verdadeiramente baseado na população, que pode ser usado para desenvolver novos conhecimentos, identificando pessoas afetadas a partir de registros médicos e recuperando suas amostras armazenadas para teste (31) Mesmo sem informações de identificação pessoal, essas amostras são úteis para estudos de frequência de genótipos baseados em populações. No entanto, não existe um consenso geral sobre o uso de amostras residuais de triagem neonatal para pesquisas. Uma declaração de política publicada em 1996 delineou algumas das questões e apresentou diretrizes (32), mas o debate sobre este tópico continua.

Licenciatura Profissional

Garantir uma força de trabalho de saúde pública e pessoal competente é um serviço vital de saúde pública. Como a maioria dos profissionais de saúde foi treinada antes dos avanços em genômica trazidos pelo Projeto Genoma Humano, poucos têm a educação ou a experiência necessária para participar efetivamente neste campo emergente. Por exemplo, Giardiello e colegas (33) estudou o uso clínico de comerciais APC teste de gene para polipose adenomatosa familiar (FAP). Eles descobriram que apenas 18,6% dos pacientes receberam aconselhamento genético antes do teste, e apenas 16,9% forneceram consentimento informado por escrito. Os médicos interpretaram erroneamente os resultados do teste em 31,6% dos casos, fornecendo aos pacientes uma falsa garantia de que não tinham FAP quando, na verdade, seus resultados foram inconclusivos.

Uma série de esforços estão em andamento para promover a educação genética entre os clínicos (33) e saúde pública (34) profissionais. Um modelo de elementos-chave de dados que devem ser disponibilizados aos profissionais de saúde sobre um teste genético, por exemplo, na forma de uma ficha técnica, também foi proposto (35) No entanto, como o número de testes baseados em DNA proliferam, uma área que pode receber atenção crescente é o licenciamento de profissionais de aconselhamento genético e mdashprofessionals que ajudarão as pessoas a tomar decisões sobre testes genéticos, bem como ajudá-los a interpretar e responder aos resultados. O Conselho Americano de Conselheiros Genéticos certifica conselheiros genéticos, mas os processos de faturamento médico normalmente proíbem o reembolso para profissionais não licenciados. Assim, os pagadores são cobrados por consultas de aconselhamento genético de acordo com os códigos de serviço médico, que muitas vezes são indicadores fracos do serviço prestado, bem como mais caros do que se cobrados diretamente (36).

A justificativa para o licenciamento de conselheiros genéticos é diversa. Em primeiro lugar, pode ajudar a proteger a saúde e segurança públicas, definindo o escopo da prática, estabelecendo padrões mínimos para qualificações e conduta e fornecendo mecanismos para educação continuada, monitoramento de desempenho e ação disciplinar. Ao restringir o uso do título & ldconselheiro quogenético & rdquo, o licenciamento também pode proteger o público, ajudando-o a identificar profissionais qualificados. Em segundo lugar, o licenciamento pode aumentar a oferta de conselheiros genéticos treinados. Embora a rápida comercialização de testes genéticos possa impulsionar o necessidade para conselheiros genéticos, exigem pode não ser igual a essa necessidade percebida devido a restrições de reembolso. Permitir o reembolso direto para serviços de aconselhamento genético poderia ajudar a reforçar a legitimidade da profissão e atrair candidatos de alta qualidade para o campo. Finalmente, supondo que a oferta de fato aumente de forma que a disponibilidade não seja uma barreira, o licenciamento pode facilitar o acesso a serviços de aconselhamento genético por meio de cobertura de seguro e possivelmente por meio de custos reduzidos, porque os códigos de serviço médico são evitados.

A Califórnia se tornou o primeiro estado a promulgar um projeto de lei de licenciamento (SB 1364) em setembro de 2000, seguido por Utah (SB 59) em março de 2001. Nova York tem projetos de licenciamento pendentes (AB2360, SB2471). Uma questão importante para essa legislação é: Quem é elegível para licenciamento? Em muitos casos, o aconselhamento genético requer a capacidade de eliciar e interpretar a história familiar, fornecer informações sobre os riscos e benefícios do teste genético, interpretar e explicar os resultados e opções e fornecer aconselhamento, apoio emocional e encaminhamento com relação a questões psicossociais complexas. A lei da Califórnia exige o licenciamento de conselheiros genéticos master & rsquos e geneticistas clínicos em nível de doutorado e restringe o uso do título de & ldconselheiro quogenético & rdquo para aqueles que solicitaram e obtiveram uma licença. No entanto, permite que o aconselhamento genético seja fornecido por um & ldquofísico, uma enfermeira de prática avançada certificada com uma especialidade em genética ou outro profissional de saúde devidamente treinado e licenciado. & Rdquo Isso destaca a importância de garantir que todos os profissionais de saúde tenham um nível apropriado de genômica competência.

O licenciamento pode ser um passo importante para atender à necessidade de profissionais qualificados em aconselhamento genético. Ao mesmo tempo, o aconselhamento genético é tradicionalmente baseado em um modelo de & ldquolow throughput & rdquo; geralmente, é um processo individual que leva muito tempo, muitas vezes orientado para a análise de linhagens familiares para mutações genéticas altamente penetrantes. Os avanços na genômica trarão testes genéticos de alto rendimento para múltiplas variantes de genes de penetrância mais baixa, associadas ao aumento do risco de doenças comuns. Haverá uma necessidade significativa, que os profissionais de saúde pública podem ajudar a preencher, para produtos inovadores usando uma variedade de mídias para ajudar a aumentar a alfabetização genômica geral, bem como ferramentas educacionais que podem ser usadas na atenção primária e em outros ambientes.

Supervisão de testes genéticos

O nível de supervisão dos testes genéticos tem implicações médicas, sociais, éticas, jurídicas, econômicas e de política pública significativas, e o sistema de supervisão pode afetar muito os indivíduos que se submetem a testes, que fornecem testes e que desenvolvem testes (21) Os testes genéticos e não genéticos têm o mesmo nível de supervisão, que ocorre principalmente por meio das Emendas de Melhoria do Laboratório Clínico (CLIA) (42 CFR 493), da Lei Federal de Alimentos, Medicamentos e Cosméticos (21 USC 301) e durante os estágios de investigação, Política Federal para a Proteção de Seres Humanos (45 CFR 46, 21 CFR 50 e 56). A maioria dos novos testes genéticos são desenvolvidos e fornecidos como serviços de laboratório clínico, que são chamados de testes internos ou "preparações caseiras". A Food and Drug Administration (FDA) indicou que tem autoridade legal para regulamentar esses testes como dispositivos médicos, mas optou por não fazê-lo por uma questão de discrição de execução, em parte porque o número de tais testes é estimado para exceder a capacidade de revisão da agência (37,38) No entanto, o Secretary & rsquos Advisory Committee on Genetic Testing (SACGT), fundado em 1998 para aconselhar o Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA, recomendou que todos os novos testes genéticos sejam analisados ​​pela FDA antes de serem usados ​​para fins clínicos ou de saúde pública (21) e está desenvolvendo recomendações adicionais para ajudar o FDA com essa revisão.

O SACGT também recomendou que os regulamentos do CLIA fossem aumentados para fornecer disposições mais específicas para garantir a qualidade dos laboratórios que realizam testes genéticos. CLIA tem requisitos para laboratórios de certificação em áreas como citologia e microbiologia, mas uma categoria de especialidade de genética não existe atualmente. Foi proposta uma revisão do CLIA que reconheceria uma área de especialidade de teste genético e abordaria questões relacionadas à precisão e confiabilidade dos resultados do teste, consentimento informado, confidencialidade, aconselhamento e adequação clínica (39).

Embora esses regulamentos e padrões estejam sendo desenvolvidos em nível nacional, os programas estaduais e locais de saúde pública devem estar preparados para realizar atividades adicionais para recomendar quando e como a informação genética pode ser aplicada para melhorar a saúde e prevenir doenças em suas próprias comunidades. Isso envolve a avaliação dos próprios dados médicos, epidemiológicos e econômicos do estado sobre as doenças para as quais os testes genéticos estão disponíveis, a prontidão e o treinamento dos profissionais de saúde sobre a adequação das leis estaduais para proteger o público e garantir o acesso a proficiência laboratorial e capacidade de infraestrutura.

Questões emergentes

Dada a natureza em rápida evolução da descoberta genética, quase todos os problemas podem ser classificados como “emergentes”. Estes incluem a comercialização e patenteamento de materiais genéticos, direitos reprodutivos e tomada de decisão, clonagem humana e modificação genética de alimentos e microorganismos.

Uma questão emergente que pode afetar significativamente a saúde ambiental, a segurança de medicamentos e a avaliação de risco é a toxicogenômica. A toxicogenômica é o estudo de como os genomas respondem a estressores ambientais. Os cientistas neste campo estão usando novas ferramentas poderosas, como tecnologias de microarray e proteômica, para avaliar as mudanças na expressão do gene em uma base genômica, fornecendo uma perspectiva global sobre como um organismo responde a um estresse específico, medicamento ou tóxico (40) De acordo com o National Center for Toxicogenomics (40), a toxicogenômica pode ajudar a resolver três grandes problemas científicos:

  1. Compreender as respostas biológicas aos estressores ambientais e identificar os agentes que representam um risco significativo para a saúde humana. Os toxicologistas confiam amplamente na extrapolação de estudos com animais ao prever as respostas humanas a toxinas potenciais. A toxicogenômica pode ajudar os cientistas a obter insights sobre os caminhos da toxicidade e seus mecanismos, levando a melhores modelos de extrapolação, menos estudos em animais e conclusões mais rápidas.
  2. Melhorar a avaliação da exposição. O uso de assinaturas de mRNA pode possibilitar a identificação do agente (classe) e da dose a que uma pessoa foi exposta. Os marcadores de proteína também podem ser usados ​​para detectar doenças pré-sintomáticas induzidas pelo ambiente. Assim, programas de vigilância podem ser implementados em humanos e animais em áreas onde há suspeita de exposição e / ou contaminação.
  3. Identificar fatores de suscetibilidade que influenciam uma resposta individual aos agentes ambientais. Esta informação pode ser usada para prever a variação interindividual em resposta a drogas ou substâncias tóxicas ambientais.

Esses resultados potenciais levantam várias questões jurídicas.Em primeiro lugar, as discussões sobre genética e emprego geralmente se concentram na possibilidade de os empregadores excluírem os indivíduos do emprego com base em informações genéticas preditivas, por exemplo, informações sobre o risco futuro de câncer, quando a preocupação é o excesso de custos de saúde. A toxicogenômica apresenta a possibilidade de que o risco individual possa ser identificado antes da exposição tóxica e usado para proteger a saúde do trabalhador (41) As ações que podem ser tomadas em resposta a essas informações incluem maior monitoramento médico para medir os efeitos iniciais da exposição, mais equipamentos de proteção pessoal ou controles ambientais para reduzir os níveis de exposição e controles administrativos, como limitar os tempos de exposição. Assim, o principal problema de discriminação que surge nesses exemplos é se o empregador poderia exigir o teste das objeções do funcionário. As leis estaduais variam sobre se os empregadores podem legalmente exigir ou mesmo solicitar que um indivíduo faça um teste genético relacionado ao trabalho.

Outra abordagem usada na indústria de berílio (42) cabe ao empregador pagar pelos testes, que os trabalhadores podem realizar de forma totalmente voluntária. Os resultados são devolvidos ao funcionário, que decide sozinho se aceita qualquer risco geneticamente elevado.

Uma segunda aplicação da toxicogenômica é o estabelecimento de regulamentações de saúde ambiental. Os padrões podem variar de um local para outro com base nos genótipos da população da área, que podem estar relacionados à raça ou etnia. Por exemplo, suponha que uma fundição esteja localizada ao lado de uma reserva indígena. Suponha também que existam evidências de que indivíduos com um certo marcador genético correm maior risco de poluentes ambientais e que esse marcador esteja presente em uma taxa muito alta nos membros da tribo. Tal cenário levanta uma série de questões: Até que ponto a variação genética deve afetar os padrões ambientais? Deve um novo padrão ambiental mais restritivo ser adotado para esta área em particular? Ou o mesmo padrão restritivo deve ser aplicado em todos os lugares? Os indivíduos devem ser orientados a se submeter a testes de suscetibilidade antes de se localizar em uma determinada área?

Um desafio significativo para a toxicogenômica será reconciliar a postura não-diretiva tradicionalmente associada à genética com a diretividade às vezes encontrada na prática de saúde pública. Por causa da eugenia e outros abusos na primeira parte do século 20, os geneticistas hoje oferecem serviços centrados no paciente que tentam respeitar a autonomia individual. Por outro lado, os programas de saúde pública geralmente se concentram na saúde da população, e não na saúde individual, e alguns usam o poder governamental para obrigar a ações de proteção à saúde. Portanto, o apoio político e público para a integração da genômica nas políticas e programas de saúde pública dependerá da acomodação da não diretividade que uma abordagem ética da genômica requer.

Conclusão

Os avanços na genética humana devem revolucionar a medicina e a saúde pública, levando a novos entendimentos dos processos de doenças subjacentes, incluindo interações gene-ambiente associadas a doenças crônicas comuns, além de novos caminhos para prevenção e tratamento. A realização desse potencial requer a integração da genômica em uma ampla gama de pesquisas, políticas e atividades práticas de saúde pública. Essa integração não dá origem a desafios jurídicos fundamentalmente novos ou diferentes daqueles que os profissionais de saúde pública geralmente encontram. Em vez disso, a informação genética adiciona uma variável à já complexa interação entre medicina, saúde pública e direito sanitário.

Aqui, revisamos as autoridades legais em evolução destinadas a reduzir o uso indevido de informações genéticas, incluindo exemplos de atividades legislativas estaduais e federais relacionadas a seguros e discriminação no emprego. Essas atividades destacam a necessidade de adotar medidas fortes para proteger melhor a privacidade de todas as informações de saúde, sem impedir a função básica da saúde pública de coletar e distribuir informações essenciais para a saúde das comunidades. A informação genética já é parte integrante da prática de saúde pública na área de triagem neonatal e, à medida que avançamos além do reino das doenças raras e monogênicas, o sistema de supervisão de testes genéticos e a necessidade de ampla educação pública e profissional sobre a genômica apresenta desafios para os profissionais de saúde pública. As questões continuam a surgir junto com os rápidos avanços na genética e na tecnologia genética, e devem ser abordadas enquanto trabalhamos para entender o uso apropriado da informação genética na medicina, saúde pública e sociedade.

Agradecimentos

Este projeto foi apoiado por um acordo de cooperação dos Centros de Controle e Prevenção de Doenças através da Associação de Professores de Medicina Preventiva.


Introdução

Organoides são culturas tridimensionais (3D) in vitro derivadas de células-tronco ou progenitoras, que podem recapitular a variedade de tipos de células, organização arquitetônica e função de suas contrapartes de tecido in vivo [17, 64]. A primeira tentativa de gerar órgãos in vitro começou em 1907, quando Wilson demonstrou que células esponjosas dissociadas podiam se reagregar e se auto-organizar para reformar todo o organismo [117]. As tentativas atuais de gerar modelos de órgãos específicos cresceram a partir do trabalho de Sasai e colegas, que mostraram que o tecido cortical cerebral tridimensional (3D) poderia ser gerado in vitro a partir de células-tronco pluripotentes [26], bem como do trabalho de Clevers e colegas, que geraram organóides intestinais a partir de células-tronco intestinais adultas [95]. Esses estudos levaram à classificação dos organóides em duas categorias principais: organóides derivados de células-tronco pluripotentes (PSC) e organóides derivados de células-tronco adultas (AdSC).

Como já existem várias revisões comparando essas duas categorias [17, 43, 64], este capítulo fornecerá apenas um breve resumo dos principais fatores de distinção entre os organoides derivados do PSC e do AdSC. Em princípio, os organóides derivados de PSC são cultivados a partir de células-tronco embrionárias (ESCs) ou células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), as quais iremos nos referir coletivamente como PSCs. Essas células são primeiro cultivadas em suspensão em um meio definido para promover a agregação celular e a diferenciação dirigida [43]. Aglomerados de células são então incorporados em uma matriz que fornece suporte estrutural, permitindo que as células se organizem em estruturas semelhantes ao tecido endógeno. Os organóides derivados de PSC podem conter diferentes tipos de células originárias de diferentes camadas germinativas (ectoderme, mesoderme e endoderme). Desde as primeiras culturas 3D do córtex cerebral [26], protocolos de diferenciação organoide foram desenvolvidos para gerar modelos de vários outros tecidos, com base na presença de fatores de sinalização específicos no meio. Organóides derivados de PSC murinos estabelecidos agora incluem modelos de copo óptico [27], glândula pituitária [105], ouvido interno [59] e glândula tireóide [4, 63]. Organóides humanos derivados de PSC incluem modelos do cérebro [65], rim [77, 106], intestino delgado [102], estômago [73], pulmão [25], fígado [107], cólon [79] e glândula mamária [88].

Os organóides derivados de AdSC, por outro lado, não requerem diferenciação dirigida, visto que são cultivados a partir de células-tronco adultas residentes em tecido em um processo semelhante ao usado para a reagregação de células esponjosas [117]. As AdSCs são primeiro extraídas do órgão por dissociação do tecido e, em seguida, direcionadas para formar organóides em meio que suporta sua atividade de células-tronco com uma combinação ideal de fator de crescimento. Exemplos de culturas organoides derivadas de AdSC de camundongo incluem o intestino [95], estômago [8, 104], fígado [15, 41, 42, 45, 83], pâncreas [15, 44], pulmão [67], endométrio [14 ], glândula salivar [81] e papila gustativa [90]. Organóides humanos derivados de AdSC também foram desenvolvidos para o intestino [51, 96], fígado [15, 41, 42], pâncreas [15], endométrio [14, 109], trompa de Falópio [55] e próstata [53] . Embora a geração de organoides a partir de AdSCs requeira menos tempo do que a partir de PSCs, o número de diferentes tipos de células que podem ser gerados a partir de AdSCs é limitado, pois os organoides derivados de AdSC geralmente contêm apenas células epiteliais [43]. Por esta razão, eles são úteis para estudar a manutenção e regeneração do tecido epitelial, mas não são adequados para estudos envolvendo a interação entre diferentes tipos de células, por exemplo, interação imune-epitelial.

Desde o seu desenvolvimento, os organóides rapidamente se tornaram um modelo popular ao preencher a lacuna entre os modelos animais in vivo, que são demorados para gerar e dispendiosos para manter, e os sistemas de cultura de células bidimensionais in vitro, que carecem de organização de tecido 3D e muitas vezes contêm alterações genéticas associadas ao câncer. Os sistemas organoides 3D têm sido usados ​​para estudar o desenvolvimento de órgãos [65] e as interações hospedeiro-patógeno [20, 87]. Eles também podem ser usados ​​para modelagem de doenças e desenvolvimento de terapia, por exemplo, usando câncer e tecidos doentes como materiais de partida para a formação organoide [10, 11, 34, 65, 66, 96, 110]. Apesar de todas essas conquistas, a capacidade de gerar, reparar ou introduzir mutações genéticas específicas era necessária para modelar doenças monogênicas e câncer, bem como para a triagem de todo o genoma e estabelecimento de organoides repórteres.


Métodos de engenharia genética

Atualmente, existem vários métodos de engenharia genética que têm sido empregados em organoides, abrindo um novo campo de pesquisa & # x02014 genética de organoides. Esses métodos permitem modificações específicas da sequência de DNA genômico. Se as modificações forem introduzidas em uma sequência de codificação, elas podem levar a uma mudança específica na proteína alvo, que pode fornecer uma visão sobre o papel biológico de um resíduo específico ou da própria proteína. Esse processo requer a consideração de dois pontos principais: as ferramentas genéticas e o método de entrega nas células-alvo.

Métodos de entrega

Existem atualmente dois métodos comuns de introdução de componentes de edição de genes em organoides: viral (por exemplo, transdução retro / lentiviral ou adenoviral) e não viral usando transferência de DNA nu (Fig. & # X200B (Fig.1). 1). Cada método tem suas vantagens e desvantagens, que serão brevemente discutidas aqui e resumidas na Tabela & # x200B Tabela1. 1 A escolha do sistema de entrega apropriado requer consideração das propriedades das células alvo, o tamanho do fragmento de DNA e a duração necessária da expressão do gene.

Métodos de geração de organóides e engenharia genética com suas possíveis aplicações. Os organoides podem ser gerados a partir de células-tronco adultas (AdSCs) ou células-tronco pluripotentes (PSCs). As AdSCs, extraídas do tecido de origem, podem ser cultivadas em condições adequadas para dar origem a organóides que imitam o órgão do qual derivam. Os organóides derivados de PSC são cultivados a partir de linhagens celulares de pluripotência induzida ou células-tronco embrionárias. Representados nas figuras humanas esquerda e direita estão os tipos de organóides que foram gerados com AdSCs ou PSCs, respectivamente. Os organoides podem ser modificados com diferentes métodos de engenharia genética, como CRISPR / Cas, transposase ou RNAi. Essas ferramentas podem ser fornecidas com uma abordagem não viral, como lipofecção ou eletroporação, ou com uma abordagem viral utilizando retrovírus, lentivírus ou adenovírus. Os organoides geneticamente editados podem ser posteriormente utilizados para várias aplicações / campos de estudo, incluindo modelos de desenvolvimento biológico e medicina translacional / de precisão

Tabela 1

Prós e contras dos diferentes métodos de entrega

Pode infectar células que não se dividem

Infectam células em divisão e não divisão

Fácil de alcançar alto título viral

Eficiente para qualquer tipo de célula e organismos vivos

Pode introduzir grandes construções

Eficiente em muitos tipos de células

Não pode infectar células que não se dividem

Pode induzir resposta imunológica

Tamanho do transgene limitado a 8 & # x000a0kb

Demora para a produção de vírus

Problemas com biossegurança e mutagênese

Tamanho do transgene limitado a 8 & # x000a0kb

Produção de vírus demorada

Problemas com biossegurança e mutagênese

Transgene pode ser perdido nas divisões

Problemas com biossegurança e mutagênese

Requer otimização extensiva

Potencial dano celular / transporte inespecífico para as células

Expressão transiente do transgene

As transfecções retro e lentivirais utilizam a maquinaria viral para induzir a integração estável de sequências genéticas estranhas, cuja expressão pode ser consistentemente passada para as progênies [62]. No entanto, os retrovírus dependem do ciclo celular do hospedeiro para integrar a informação genética ao genoma, portanto, não podem infectar células terminalmente diferenciadas e sem divisão. Além disso, a infecção por retrovírus requer alto título viral e pode induzir respostas imunes que podem reduzir a eficiência da integração do genoma [92, 101]. Os lentivírus têm uma adaptação que contorna essa limitação e, portanto, são comumente usados ​​para células que são difíceis de infectar, como células do sistema imunológico ou células que não se dividem [21]. No entanto, com os retro e lentivírus, a integração ocorre preferencialmente em locais transcricionalmente ativos, o que pode afetar adversamente a expressão dos genes do hospedeiro. Além disso, ambos os vetores virais só podem acomodar uma inserção máxima de DNA de cerca de 8 & # x000a0kb, que cobre a maioria dos cDNAs, mas não todos [21, 46].

O método adenoviral evita a integração permanente permanecendo epissomal após a transfecção e é eficaz tanto na divisão como na não divisão das células [101]. Também é fácil gerar altos títulos de vírus para maior expressão do transgene introduzido. No entanto, devido à falta de integração genômica, o gene introduzido pode ser perdido em várias rodadas de divisão da célula hospedeira [114, 115].

Por último, a transferência não viral de DNA nu geralmente envolve uma de duas abordagens de entrega: eletroporação ou lipofecção. A eletroporação utiliza pulsos elétricos para criar transitoriamente aberturas na membrana celular, permitindo que o DNA estranho entre na célula [32]. Este método é geralmente eficiente para muitos tipos de células e até mesmo em organismos vivos, e também pode facilmente introduzir grandes construções na célula. No entanto, a eletroporação requer um dispositivo relativamente caro e extensos testes piloto, pois os parâmetros ideais variam significativamente para cada dispositivo e tipo de célula. A lipofecção utiliza a lipofectamina ou moléculas lipídicas relacionadas que podem formar lipossomas, encapsulando o DNA e introduzindo-o na célula [97]. Este método é relativamente simples e geralmente eficiente o suficiente em muitas células. No entanto, a expressão do transgene é normalmente transitória e a lipofecção pode afetar a sobrevivência celular.

Ferramentas para engenharia genética

Depois de decidir sobre um método de entrega genética, é importante considerar o método de edição genética. Como existem muitas revisões comparando as diferentes ferramentas de engenharia genética [19, 56, 57, 120], apresentaremos apenas um breve resumo dos métodos importantes que têm sido usados ​​para modificar geneticamente os organoides: RNA de interferência (RNAi), CRISPR / Cas9 , retro / lentivírus e transposons (Fig. & # x200B (Fig.1 1 e Tabela & # x200B Tabela2 2).

Mesa 2

Prós e contras das técnicas de edição de genes

Eficaz em todas as células somáticas de mamíferos

Nenhuma manipulação genética anterior necessária

Introduzir modificação específica na sequência alvo

Propenso a efeitos fora do alvo

A inserção aleatória pode interromper genes transcricionalmente ativos

Difícil de executar em grande escala

Susceptível à reação imunológica

Possíveis efeitos fora do alvo

O sistema RNAi utiliza o próprio maquinário da célula para silenciar a expressão de genes específicos. Neste sistema, as sequências de RNAi sintetizadas, tanto RNAs em gancho curto (shRNAs) ou RNAs de interferência curta (siRNAs), formam pares complementares com os mRNAs do gene alvo para promover a degradação ou silenciamento translacional e, assim, suprimir a expressão da proteína do alvo mRNA. Este método é eficaz em todas as células somáticas de mamíferos e nenhuma manipulação genética anterior é necessária [28, 39]. Os shRNAs podem ser entregues em células com vários vetores, como retro- / lentivírus, adenovírus, plasmídeos e transposons. [120]. No entanto, o RNAi é apenas um sistema knockdown, tem menor eficácia e é propenso a efeitos fora do alvo.

Uma escolha útil para a expressão de genes estáveis ​​são os sistemas baseados em transposons, por exemplo, PiggyBac e Sleeping Beauty, que podem introduzir de forma estável o gene de interesse no genoma do hospedeiro para expressão de longo prazo. Tanto o PiggyBac quanto a Bela Adormecida usam o mecanismo & # x0201ccut-and-paste & # x0201d para & # x0201ccut & # x0201d a sequência genética flanqueada por uma repetição invertida terminal específica de um locus e & # x0201cpaste & # x0201d em outro [46]. No entanto, essa inserção aleatória às vezes ocorre em um gene ativo, o que pode levar a efeitos inesperados na célula hospedeira.

Desde 2012, repetições palindrômicas curtas regularmente interespaçadas (CRISPR) / sistemas associados a CRISPR (Cas) foram amplamente adaptados para edição específica de sequência em células procarióticas e eucarióticas in vitro [16, 18, 35, 50, 71]. O sistema foi descoberto pela primeira vez em bactérias, dando-lhes resistência adaptativa a infecções bacteriófagas [9]. O sistema CRISPR / Cas9 foi, então, ainda projetado com dois componentes: endonuclease Cas9 e RNA de guia único (sgRNA ou gRNA), onde uma sequência espaçadora se liga a uma sequência complementar de DNA (sequência de protoespaçador) e guia Cas9 para um alvo específico. Um alvo de DNA contendo a sequência do protoespaçador e o motivo adjacente do protoespaçador (PAM) forma um alvo para o complexo Cas9 gRNA para introduzir uma quebra de fita dupla (DSB). A sequência PAM difere para as diferentes endonucleases Cas9 e Cas12a (Cpf1) derivadas de diferentes espécies de bactérias, permitindo assim uma ampla gama de aplicações [18, 89, 121]. Após a clivagem pela nuclease Cas9, o DSB pode ser reparado por qualquer reparo dirigido por homologia (HDR), que requer um modelo para reparo preciso de alta fidelidade ou por junção de extremidade não homóloga (NHEJ), onde as extremidades cegas são refeitas -ligado em conjunto [13]. O reparo por HDR seguindo um modelo fornecido permite que os pesquisadores introduzam mudanças de sequência específicas em genes alvo [33]. No entanto, esse processo é ineficiente e requer que a célula esteja na fase S do ciclo celular para que o reparo ocorra [47]. O plasmídeo modelo também deve ser clonado com braços de homologia específicos para cada gene, aumentando assim o esforço de trabalho. Alternativamente, o reparo do DNA pode ocorrer por inserções ou deleções de nucleotídeos introduzidas por NHEJ que geram mutações de mudança de quadro, levando à inativação do gene alvo. Como o NHEJ é frequentemente visto como sujeito a erros, ele não é usado para mutações direcionadas precisas. No entanto, trabalho recente de Artegiani et al. [6] adaptou o NHEJ para geração de knock-ins rápidos em vários organóides humanos. Este método remove o esforço necessário para a clonagem do braço de homologia à medida que o DNA knock-in é clonado em um plasmídeo autoclivável contendo uma sequência não humana que é reconhecida por sgRNA. Os autores puderam mostrar geração de knock-in mais eficiente em comparação com HDR, mesmo com inibição de TP53, o que foi sugerido para melhorar a eficiência de HDR em células-tronco pluripotentes humanas [6, 48].

Outros avanços no desenvolvimento de CRISPR / Cas9 também visam aumentar a eficiência de diferentes enzimas Cas para detectar uma faixa de sequência PAM mais ampla [41, 42] ou quase remover a restrição de sequência PAM completamente [113]. Modificação da endonuclease Cas9 por fusão da cas9 cas9 inativada com citidina desaminase para gerar editores de base [36, 40, 60]. Isso introduziu novas ferramentas para gerar mudanças de base precisas em organóides [37, 112].

A combinação da tecnologia organoide com as várias técnicas de edição genética fornece uma nova plataforma para a genética organoide e modelagem de doença baseada em organoide. O capítulo a seguir fornece mais detalhes sobre as aplicações de edição de genes com o sistema CRISPR / Cas9 em vários organóides derivados de AdSC e PSC.


Introdução

A doença de Huntington (HD MIM 143100), um distúrbio neurodegenerativo familiar caracterizado por distúrbio de movimento progressivo, declínio cognitivo e distúrbios psiquiátricos, é causado por uma repetição expandida do códon de glutamina CAG em HTT, que codifica huntingtin [1 & # x020133]. Este defeito genético foi originalmente mapeado para o cromossomo 4p16.3 usando análise de ligação em parte em famílias venezuelanas de um agrupamento populacional de DH, cuja generosa participação nesta pesquisa genética fundamental de DH também contribuiu, junto com muitas famílias norte-americanas e europeias também portadoras de uma mutação de expansão CAG , para a descoberta de HTT [3 e # x020136]. o HTT a repetição é polimórfica na população normal [7], mas a herança de & # x0003e35 CAGs pode levar a HD, enquanto as repetições de & # x0003e40 CAGs são totalmente penetrantes em uma vida normal [8,9]. As repetições expandidas mostram instabilidade germinativa frequente, de modo que os indivíduos com DH podem não ter um comprimento de repetição CAG idêntico ao do pai transmissor [10 & # x0201312]. Cru de novo casos de HD são gerados esporadicamente na população por expansão intergeracional de uma repetição CAG de comprimento normal [13,14]. O comprimento do herdado HTT A repetição de CAG é o principal determinante da idade de início dos sinais neurológicos diagnósticos, sendo responsável por

65% da variação neste fenótipo, com repetições mais longas levando, em média, a manifestações clínicas anteriores [7,15 & # x0201318]. Indivíduos com mutações bialélicas de HD (ou seja, homozigotos de HD) foram relatados e apóiam uma dominância completa em relação ao mecanismo patogênico que leva às manifestações da doença desde a idade de início de um indivíduo com dois HTT As repetições CAG são comparáveis ​​às de um heterozigoto com a mais longa das duas repetições [7,19]. Curiosamente, com base em um relatório, apesar de uma idade de início semelhante aos heterozigotos de HD, os indivíduos com dois HTT As repetições de CAG podem apresentar declínio mais rápido na capacidade funcional [20]. Embora o momento do início da doença seja dependente do tamanho da repetição CAG, a duração da doença manifesta (ou seja, o período de tempo desde o início até a morte) não é [21], sugerindo que a progressão para a morte envolve tecidos ou mecanismos diferentes daqueles que levam a início clínico. A relação entre o tamanho da repetição CAG e o início clínico da DH tem desempenhado um papel importante na orientação 1) da geração de modelos animais [22 & # x0201326], 2) desenho / interpretação de estudos moleculares [27] e 3) identificação de modificadores genéticos [ 28].

Os extensos dados experimentais acumulados e a dominância completa do alelo mutante são mais consistentes com um mecanismo de ganho de função, que levou à exploração da interferência específica do alelo mutante com HTT expressão como opção de tratamento [29]. Embora altamente promissoras em sistemas modelo, as abordagens de direcionamento de genes estão apenas começando os testes em humanos de segurança e eficácia. Uma estratégia alternativa para a identificação de alvos terapêuticos é capitalizar as observações de humanos com DH para descobrir os modificadores da doença que ocorrem naturalmente. Embora o comprimento CAG seja responsável por uma proporção significativa da variação na idade de início da DH [15,16,18], cada tamanho de repetição CAG na população em DH está associado a uma ampla gama de idades de início [7]. Uma vez que as diferenças individuais entre a idade observada no início clínico e a idade no início clínico esperada com base no tamanho da mutação (ou seja, idade residual no início) são parcialmente hereditárias [30,31], considera-se que os fatores genéticos e ambientais influenciam o tempo de início, além do comprimento CAG [32]. A expansão CAG associada a HD fica em diversos haplótipos [33 & # x0201338], refletindo vários eventos de mutação independentes em diferentes estruturas cromossômicas polimórficas. No entanto, nenhum dos haplótipos cromossômicos mais frequentes está associado a uma diferença na idade de início [34], argumentando que a DH não é comumente modificada por um padrão comum cis fator genético em HTT. Da mesma forma, a idade no início diagnóstico motor da DH não é influenciada pelo comprimento da repetição CAG normal [7,32], ou pela presença de um segundo alelo mutante [7], sugerindo que a variação hereditária na idade de início para um determinado A repetição de CAG é em grande parte devido ao desvinculado trans fatores [39]. Para identificá-los, realizamos uma análise de associação do genoma (GWA) inicial em indivíduos de ascendência europeia que revelou o primeiro conjunto de loci significativos do genoma associado à idade residual no início dos sintomas motores. Resumidamente, havia dois sinais de modificação de início independentes no cromossomo 15 [28], um sinal de modificação no cromossomo 8 [28] e um sinal de modificação no cromossomo 3 [40]. Dois dos loci modificadores agiram para atrasar o início e dois agiram para acelerar o início [28,40,41]. Esses achados estabeleceram a prova de princípio de que a patogênese da DH pode ser alterada antes do surgimento da doença clínica. Consistente com os resultados da análise de SNP único, a análise da via apoiou um papel das vias de reparo / manutenção do DNA na modificação da idade no início da HD, sugerindo que as mudanças somáticas de tamanho da repetição CAG podem desempenhar um papel na modificação do processo patogênico da HD que leva a sinais clínicos diagnósticos [28]. Juntas, essas observações demonstraram que os fatores genéticos em humanos são capazes de modificar a taxa de patogênese da HD antes do diagnóstico e apontam para uma abordagem baseada nessas observações humanas para o direcionamento terapêutico para atrasar o início da HD.

A maioria das análises de todo o genoma até o momento se concentraram nos europeus, fornecendo informações importantes, mas potencialmente limitadas, sobre a contribuição genética para o risco de doenças e características normais (Catálogo GWAS https://www.ebi.ac.uk/gwas/). Nosso estudo europeu HD GWA inicial [28] foi muito bem-sucedido em revelar loci modificadores significativos de efeito relativamente forte com base em um tamanho de amostra menor do que os estudos de risco genético de doenças mais comuns (Catálogo GWAS https://www.ebi.ac.uk/gwas /). No entanto, podemos ter perdido modificadores genéticos não presentes nos europeus. Aqui, estendemos nossa análise genética ao grupo venezuelano de HD não europeu para: 1) determinar a sequência completa de HTT no cromossomo que carrega a mutação de expansão CAG 2) para investigar sua origem, e 3) para determinar se a modificação da idade de início nesta população venezuelana está associada a fatores genéticos específicos que ocorrem naturalmente.


Resumo

Resumo O metabolismo do colesterol em macrófagos de camundongos C57BL / 6J propensos a aterosclerose foi comparado ao de macrófagos de camundongos C3H / HeN resistentes a aterosclerose. Os níveis de colesterol total no plasma de ambos os tipos de camundongos aumentaram significativamente, mas o nível de colesterol HDL aumentou apenas em camundongos C3H / HeN quando uma dieta rica em colesterol (1% de colesterol) foi fornecida por 5 semanas. Após a incubação de macrófagos de camundongos machos e fêmeas na dieta de alto colesterol com β-VLDL por 24 horas, o conteúdo de colesterol nos macrófagos de C57BL / 6J foi aproximadamente 1,5 a 2,0 vezes maior do que naqueles de camundongos C3H / HeN. A incorporação de oleato-β-VLDL de [3 H] colesterol em macrófagos de camundongos C57BL / 6J na dieta rica em colesterol foi maior do que a incorporação naqueles de camundongos C3H / HeN. A liberação de [3 H] colesterol de macrófagos de camundongos C57BL / 6J na dieta rica em colesterol foi um sétimo daquela de macrófagos de camundongos C57BL / 6J na dieta basal ou de macrófagos de camundongos C3H / HeN no nível basal ou alto dieta com colesterol. A atividade da esterase do colesterol ácido foi quase a mesma nos macrófagos de qualquer grupo. Acil CoA: a atividade da aciltransferase do colesterol em macrófagos de camundongos C57BL / 6J com dieta rica em colesterol aumentou em comparação com macrófagos de camundongos C57BL / 6J em dieta normal. A atividade neutra da colesterol esterase em macrófagos de camundongos C57BL / 6J foi cerca de metade daquela em macrófagos de camundongos C3H / HeN, independente do tipo de dieta. Não houve diferenças de sexo nesses metabolismos. Considerando nossos dados anteriores, esses resultados sugeriram que uma dieta rica em colesterol pode causar alterações metabólicas para acumular éster de colesterol em macrófagos de camundongos C57BL / 6J de acordo com anormalidades genéticas.

Camundongos C57BL / 6J em uma dieta rica em colesterol são conhecidos por serem muito suscetíveis à aterosclerose. 1 2 3 4 5 No entanto, camundongos C3H / HeN com dieta rica em colesterol por 1 ano foram resistentes à formação de lesões ateroscleróticas. 3 4 5 Após os camundongos C57BL / 6J terem consumido uma dieta rica em colesterol, os níveis de HDL-C diminuíram em 4 semanas 4 e lesões ateroscelóticas foram observadas em 7 semanas, e essas lesões continuaram a crescer até que todos os camundongos tivessem grandes placas ateromatosas no aorta e artérias coronárias. 5 Células de espuma aparentemente derivadas de macrófagos em lesões gordurosas típicas foram observadas sobre áreas acelulares contendo resíduos celulares em camundongos C57BL / 6J. 1 2 No entanto, o nível de HDL-C de camundongos C3H / HeN não mudou com uma dieta rica em colesterol e eles não desenvolveram lesões ateromatosas. 4 No entanto, é incerto se a diferença na resposta dos níveis plasmáticos de HDL é suficiente para explicar a diferença na aterogenicidade entre as duas linhagens de camundongos. Isso nos levou a esclarecer a diferença genética do metabolismo dos lipídios no nível celular.

Nós relatamos o mecanismo de formação de células espumosas por macrófagos pelo uso de β-VLDL. 6 7 Ou seja, os macrófagos incorporam β-VLDL 8 e acumulam éster de colesterol como gotículas lipídicas nas células. O metabolismo do colesterol que regula o acúmulo de ésteres de colesterol nos macrófagos atua da seguinte maneira. 9 Em primeiro lugar, o éster de colesterol em β-VLDL é hidrolisado pela colesterol esterase ácida nos lisossomas. 10 11 Em seguida, o produto, o colesterol livre, é reesterificado pelo ACAT e armazenado como éster de colesterol em gotículas de lipídios intracelulares. 12 13 Em seguida, o colesterol reesterificado é hidrolisado pela colesterol esterase neutra, 14 15 16 e, finalmente, o colesterol livre é liberado das células. É a hipótese de que o desequilíbrio do colesterol incorporado e do colesterol liberado induz o acúmulo de ésteres de colesterol e, assim, a formação de células espumosas. Cada atividade enzimática afeta esse desequilíbrio. Para elucidar ainda mais a diferença genética entre camundongos C57BL / 6J e C3H / HeN no nível celular, também investigamos o metabolismo de β-VLDL-C em macrófagos.

Como também foi relatado que camundongos C57BL / 6J fêmeas eram mais suscetíveis à aterosclerose do que camundongos machos (ou seja, que os camundongos fêmeas desenvolveram mais lesões de tamanho maior do que os machos 4), também comparamos o metabolismo de β-VLDL-C em machos e macrófagos de camundongos fêmeas.

Métodos

Materiais

O colesterol [14C] oleato (2,1 GBq / mmol), [3H] colesterol oleato (3,0 GBq / mmol) e [1-14C] oleoil-CoA (1,5 GBq / mmol) foram adquiridos na New England Nuclear Corp. DMEM era da Nissui Pharmaceutical Co, Ltd. Ratinhos machos e fêmeas C57BL / 6J e C3H / HeN eram da Japan Clea.

Tratamento de Animais

Os camundongos com 6 semanas de idade foram alimentados com dieta basal (Oriental Kobo) ou dieta basal contendo 1% de colesterol (dieta com alto teor de colesterol) por 5 semanas (a composição de cada dieta é mostrada na Tabela 1). Designamos camundongos C57BL / 6J C57 e camundongos C3H / HeN C3H. Os grupos foram C57 alimentados com dieta basal (C57-B), C57 alimentados com dieta rica em colesterol (C57-H), C3H alimentados com dieta basal (C3H-B) e C3H alimentados com dieta rica em colesterol (C3H-H )

Preparação de macrófagos

Os macrófagos de exsudato peritoneal foram colhidos 4 dias após a injeção de 1 mL de meio tioglicolato (DIFCO). 17 células foram plaqueadas a uma densidade de 2 × 10 6 células / mL em DMEM suplementado com 10% de FBS (DMEM / 10% de FBS). Após 4 horas de aderência, as células foram lavadas e cultivadas durante a noite. As células foram então usadas para os experimentos.

Determinação dos níveis de colesterol total, LDL-C + VLDL-C e HDL-C no plasma

O isolamento de HDL foi determinado após o LDL e VLDL terem sido precipitados com o reagente de precipitação contendo 555 μmol / L de ácido fosfotúngstico e 25 mmol / L de MgCl2, pH 2,5. 18 O reagente de precipitação (100 μL) foi adicionado a 50 μL de plasma, a seguir a mistura foi incubada por 10 minutos em temperatura ambiente e centrifugada duas vezes, por 2 minutos cada vez, a 14.000g. O resíduo precipitado continha lipoproteínas contendo apoB (LDL e VLDL) e o sobrenadante continha HDL. A fração de HDL foi determinada para análise de colesterol em 2 horas por método enzimático usando um kit que detectou colesterol livre e esterificado (Determinador TC 555 Kyowa Medex Co, Ltd). O colesterol total foi determinado com o mesmo kit. O LDL-C mais VLDL-C foi determinado pela subtração do HDL-C do colesterol total.

Preparação de oleato de colesterol [3H] reconstituído em β-VLDL

β-VLDL (d& lt1.006) foi isolado a partir de soro de coelhos alimentados com colesterol por ultracentrifugação durante 16 horas. 8 A incorporação de oleato de [3H] colesterol em β-VLDL foi feita essencialmente pelo método de Brown et al 19: 1 GBq de oleato de colesterol [3H] foi adicionado com 1 mL de DMSO. A mistura foi sonicada por 30 segundos, em seguida, 2 mL de tampão de densidade de plasma (0,154 mol / L de NaCl, 1 mmol / L de EDTA e 10 mmol / L de Tris-HCl, pH 7,4, 0,01% de NaN3) foi adicionado e a mistura foi ressonicada durante 30 segundos. Foi então adicionado gota a gota a 6 mL de β-VLDL (10 mg de colesterol total / mL) em 3 minutos. A solução foi incubada durante 8 horas a 37 ° C e depois dialisada contra 3 L de tampão de densidade de plasma durante 10 horas. Após a diálise, a solução foi centrifugada por 16 horas a 105.000g. A camada superior foi usada como oleato de colesterol [3 H] - β-VLDL incorporado. A atividade específica foi de cerca de 1 × 10 7 dpm / mg de colesterol total.

Incorporação de [3 H] Oleato de Colesterol – β-VLDL por Macrófagos

Macrófagos (2 × 10 6 células / poço) foram semeados em placas de 12 poços e incubados por certos tempos em 0,75 mL de DMEM / 10% FBS contendo 200 μg [3H] colesterol oleato – β-VLDL (5 × 10 6 dpm ) Após a incubação, as células foram lavadas três vezes com DMEM / FBS a 10% e sua radioatividade foi medida com um contador de cintilação. Além disso, para determinar o colesterol [3H] livre liberado das células durante a incubação, solvente orgânico (clorofórmio: metanol, 2: 1) foi adicionado ao meio e os lipídios foram extraídos da camada de clorofórmio. Os lipídios foram aplicados em cromatógrafos de camada fina. 20 A radioatividade na fração de colesterol livre foi então contada. A captação total foi a soma da radioatividade intracelular e da radioatividade do colesterol [3 H] livre no meio. 7

Liberação de [3 H] colesterol de macrófagos carregados com [3 H] colesterol oleato – β-VLDL

Os macrófagos (2 × 10 6 células) foram semeados em placas de 12 poços e incubados por 24 horas em 1 mL de DMEM / FBS a 10% contendo 200 μg [3H] de colesterol oleato-β-VLDL. As células foram então lavadas três vezes com DMEM / FBS a 10%. Esses macrófagos foram incubados adicionalmente em 2 mL de DMEM / 10% FBS. Nos tempos indicados na Fig. 1, foram retirados 0,4 mL do meio e a sua radioatividade medida com contador de cintilação. 7

Ensaio de atividades de ácido e colesterol esterase neutro 5

Os macrófagos (2 x 10 7 células) foram lavados três vezes com PBS e suspensos em 1 mL de Tris-HCl 10 mmol / L (pH 7,4) contendo sacarose 0,25 mol / L. As células foram então sonicadas duas vezes por 15 segundos e usadas como a solução de enzima. A mistura de reação continha, além da solução de enzima, 0,5 mmol / L de oleato de colesterol, 0,37 MBq de colesterol [14 C] oleato, 0,5 mmol / L de ácido fosfatídico e 100 mmol / L de Tris-HCl, pH 7,4, para colesterol neutro esterase ou 0,5 mmol / L de fosfatidilcolina e tampão de acetato de sódio, pH 4,0, para ácido colesterol esterase em um volume total de 200 μL. A incubação foi realizada a 37 ° C durante 1 hora. O [14 C] oleato liberado foi extraído por uma modificação do método de Belfrage e Vaughan. 21 Resumidamente, a reação foi interrompida com 3,25 mL de clorofórmio / metanol / heptano (1,42: 1,25: 1,00) e, em seguida, 1 mL de NaOH 0,1 N foi adicionado. A radioatividade na fase aquosa foi medida.

Ensaio de atividade ACAT

A atividade ACAT da solução enzimática acima foi avaliada pelo método de Gillies et al 20 com [1-14C] oleoil-CoA sem colesterol exógeno.

Análises

O conteúdo de colesterol intracelular foi medido como se segue 7: as células lavadas em cada poço foram tratadas com 1 mL de hexano / isopropanol (2: 1) e o solvente orgânico foi evaporado. O sedimento foi dissolvido em 100 mL de metanol e os conteúdos de colesterol total e livre na solução de metanol foram analisados ​​enzimaticamente por meio dos kits Determinador TC 555 e Determinador FC 555. O teor de ésteres de colesterol foi considerado a diferença entre os conteúdos de colesterol total e livre.

A concentração de proteína foi determinada com um kit usando o método de Bradford (Bio-Rad, Protein Assay).

A significância foi analisada por Student's t teste.

Resultados

Efeito de uma dieta com alto teor de colesterol nos níveis de colesterol total no plasma de camundongos

Os níveis plasmáticos de lipídios são mostrados na Tabela 2. O nível de colesterol total de camundongos fêmeas C57-B era menor do que os níveis dos outros três grupos. Os níveis de HDL-C de camundongos C57-B de ambos os sexos foram menores do que os de camundongos C3H-B de ambos os sexos. Além disso, o nível em camundongos C57-B machos era maior do que em camundongos C57-B fêmeas. O nível de LDL-C + VLDL-C em camundongos machos C57-B foi maior do que os níveis nos outros três grupos. A razão de HDL-C para LDL-C + VLDL-C estava na ordem masculino C3H-B & gtfeminino C3H-B & gtfeminino C57-B & gtmale C57-B.

Após o consumo de uma dieta rica em colesterol, os níveis de colesterol total e LDL-C + VLDL-C aumentaram em todos os grupos. No entanto, os níveis de HDL-C em camundongos C57-H de ambos os sexos não mudaram estatisticamente, enquanto aqueles em camundongos C3H-H de ambos os sexos aumentaram. As proporções de HDL-C para LDL-C + VLDL-C foram muito menores em todos os grupos com dieta rica em colesterol do que naqueles com dieta basal. No entanto, a proporção em camundongos C57-H foi cerca de metade ou menos do que em camundongos C3H-H.

Metabolismo do colesterol em macrófagos de camundongos machos

Primeiro, para esclarecer o efeito da dieta rica em colesterol no acúmulo de ésteres de colesterol em macrófagos de camundongos machos, medimos o conteúdo de ésteres de colesterol após a incubação com ou sem β-VLDL (Fig. 1).O conteúdo de colesterol era muito baixo sem β-VLDL e quase não havia diferenças entre os quatro grupos. No entanto, após a incubação com β-VLDL, o conteúdo de éster de colesterol dos macrófagos de todos os grupos aumentou muito. Isso nos macrófagos C57-B era quase o mesmo que nos macrófagos C3H-B e C3H-H, mas que nos macrófagos C57-H era duas vezes maior do que nos macrófagos C57-B.

Em seguida, investigamos a incorporação de β-VLDL em macrófagos em camundongos machos usando [3H] colesterol oleato-β-VLDL (Fig. 2). A incorporação de [3 H] colesterol oleato – β-VLDL em macrófagos C57-H foi aumentada 1,3 vezes em comparação com macrófagos C57-B em 12 e 36 horas. Os níveis de incorporação nos macrófagos C57-B, C3H-B e C3H-H foram bastante semelhantes.

Em seguida, examinamos a liberação de [3 H] colesterol no meio de macrófagos carregados com [3 H] colesterol oleato-β-VLDL. A Fig. 3 mostra a razão da radioatividade liberada no meio para a radioatividade total incorporada em macrófagos como uma porcentagem. A quantidade aumentou de forma dependente do tempo em todos os macrófagos. No entanto, a quantidade dos macrófagos C57-H era notavelmente baixa - era cerca de um sexto das quantidades dos macrófagos dos outros três grupos em 12 horas. Os resultados acima indicaram que os macrófagos C57-H acumulam éster de colesterol absorvendo uma grande quantidade de β-VLDL e dificilmente liberando colesterol livre das células.

Em seguida, medimos as atividades enzimáticas envolvidas no metabolismo do colesterol intracelular (Figs 4, 5 e 6). Sabe-se que existem três enzimas importantes envolvidas no acúmulo de lipídios em macrófagos: a primeira é a esterase de colesterol ácida (Fig. 4), a segunda ACAT (Fig. 5) e a terceira esterase de colesterol neutro (Fig. 6). As atividades de esterase de colesterol ácido em camundongos machos (Fig. 4) não se alteraram entre os quatro grupos de macrófagos. A atividade ACAT de macrófagos C57-B de camundongos machos (Fig. 5) foi cerca de um terço da dos macrófagos C3H-B. No entanto, a atividade dos macrófagos C57-H aumentou em mais de três vezes em comparação com a dos macrófagos C57-B. A atividade dos macrófagos C3H-H não foi alterada. As atividades de esterase de colesterol neutro dos macrófagos C57-B e C57-H em camundongos machos (Fig. 6) foram cerca de metade daquelas dos macrófagos C3H-B e C3H-H. A atividade da enzima não foi significativamente alterada pela dieta rica em colesterol nas duas linhagens de camundongos. Esses resultados, portanto, sugerem fortemente o envolvimento da regulação genética nessas atividades enzimáticas e sua resposta a uma dieta rica em colesterol.

Comparação do metabolismo do colesterol entre camundongos machos e fêmeas

O metabolismo do β-VLDL-C em macrófagos foi quase o mesmo em camundongos machos e fêmeas em ambas as cepas. O conteúdo de éster de colesterol em macrófagos C57-H fêmeas incubados com β-VLDL foi maior entre todos os grupos de macrófagos e 1,6 vezes maior do que em macrófagos C57-B (Fig. 1). A liberação de [3 H] colesterol dos macrófagos C57-H fêmeas foi a mais baixa, sendo apenas um sexto daquela dos outros macrófagos (Fig. 3). As atividades enzimáticas absolutas e relativas em macrófagos de camundongos machos e fêmeas foram quase as mesmas (Figs 3, 4 e 5).

No entanto, uma ligeira diferença de sexo foi observada na incorporação de [3 H] colesterol oleato-β-VLDL. Isso em macrófagos C57-H fêmeas foi 1,3 vezes maior do que em C57-B fêmeas em 36 horas de incubação. A incorporação de [3 H] colesterol oleato – β-VLDL em macrófagos C3H-B fêmeas foi dois terços daquela em macrófagos C57-B fêmeas. A incorporação em macrófagos C3H-H fêmeas foi quase a mesma que em macrófagos C3H-B fêmeas. Os resultados acima indicaram que não houve diferenças sexuais notáveis ​​em termos de metabolismo lipídico em macrófagos.

Discussão

Foi relatado que os níveis de colesterol total não diferiram muito entre as cepas C57 e C3H com ração basal (4% de gordura) ou dieta aterogênica (15% de gordura, 1,25% de colesterol e 0,5% de ácido cólico) e que os níveis de HDL-C foram reduzidos apenas na cepa C57 com dieta aterogênica. 3 4 Neste estudo, observamos uma diferença nos níveis de HDL-C entre as cepas C57 e C3H com ração basal ou dieta rica em colesterol. Apesar dessa diferença, as proporções de HDL-C para LDL-C + VLDL-C foram muito baixas em todos os grupos de camundongos alimentados com dieta rica em colesterol em comparação com aqueles alimentados com dieta basal. Assim, observamos diferenças nas características dos macrófagos entre as duas linhagens de camundongos. Os resultados sugeriram que há diferenças genéticas no metabolismo do colesterol em nível celular entre as duas cepas com alimentação com alto teor de colesterol.

Cinco semanas após o início da dieta rica em colesterol, os macrófagos C57-H masculinos e femininos mostraram a característica de acumular mais éster de colesterol pelo aumento da incorporação de β-VLDL e diminuição da liberação de colesterol livre das células em comparação com outros macrófagos (Figs 2 e 3). As alterações enzimáticas estavam de acordo com esse metabolismo. Ou seja, a atividade da ACAT foi induzida apenas em macrófagos de camundongos C57 pela alimentação com uma dieta rica em colesterol. No entanto, a atividade da colesterol esterase neutra não foi induzida por tal dieta em macrófagos C57. Essas atividades são bastante semelhantes às relatadas em macrófagos peritoneais desencadeados por tioglicolato de rato, células de lesão aterosclerótica de coelho 6 e macrófagos derivados de monócitos sanguíneos de coelhos alimentados com uma dieta rica em colesterol. 22 Todos esses macrófagos acumulam facilmente éster de colesterol nas células. Portanto, pode-se concluir que macrófagos de camundongo C57 possuem a característica de acumular mais éster de colesterol e formar células espumosas, podendo contribuir para a formação de ateroma quando carregados com lipoproteínas.

No entanto, o metabolismo do colesterol dos macrófagos em macrófagos C3H-H foi quase o mesmo que nos macrófagos C3H-B, e o conteúdo de éster de colesterol nos macrófagos C3H-H incubados com β-VLDL foi menor do que nos macrófagos C57-H. Esses resultados sugeriram que os macrófagos de camundongos C3H não alteraram o metabolismo do colesterol em resposta a uma dieta rica em colesterol. Os macrófagos C3H tiveram uma alta atividade do metabolismo do colesterol, como macrófagos alveolares de rato e coelho 6 e macrófagos derivados de THP-1 tratados com fator 7 estimulador de colônias de macrófagos, isto é, macrófagos C3H-H preservaram alta atividade ACAT e alta atividade de esterase de colesterol neutro. Esses macrófagos (C3H-B e C3H-H) devem ter alta capacidade de catabolizar o colesterol exógeno e liberar o colesterol das células, e essas células acumulam menos éster de colesterol. Essas propriedades podem explicar porque o camundongo C3H é resistente à aterosclerose induzida por uma dieta aterogênica.

Das várias diferenças, a mais notável entre os camundongos C57 e C3H foi a atividade da esterase de colesterol neutro em camundongos alimentados com dieta normal e com dieta rica em colesterol (Fig. 6). Provavelmente, essa enzima, em combinação com a ACAT, é crítica para a liberação de colesterol dos macrófagos. A falta de indução desta enzima associada à indução de ACAT em camundongos C57 pela alimentação de colesterol leva a um baixo nível de liberação e acúmulo de éster de colesterol. No caso dos camundongos C57-B, a liberação de colesterol foi alta, apesar da baixa atividade da esterase de colesterol neutro. Em condições de baixa atividade da ACAT, a liberação de colesterol dependendo da esterase de colesterol ácido e neutro pode ser estimulada. 23

Camundongos C57 fêmeas tornam-se ateroscleróticos mais facilmente do que camundongos machos. Quando a testosterona foi administrada a camundongos C57 fêmeas, as lesões ateroscleróticas diminuíram. 4 Neste estudo, os níveis de colesterol total e HDL-C em camundongos C57-B fêmeas foram significativamente mais baixos do que em camundongos C57-B machos (Tabela 2). No entanto, a proporção de HDL-C para LDL-C + VLDL-C foi maior em camundongos C57-B fêmeas do que em machos. Após alimentação com dieta rica em colesterol, os níveis de colesterol total e LDL-C + VLDL-C aumentaram em ambos os sexos. O nível absoluto de HDL-C e a razão de HDL-C para LDL-C + VLDL-C não foram significativamente diferentes entre os dois sexos de camundongos C57-H. Esses resultados sugerem que os lipídios plasmáticos não explicam as diferenças sexuais em termos de aterogenicidade. Além disso, não houve diferença no metabolismo de β-VLDL-C entre macrófagos de camundongos machos e fêmeas, indicando que nossos resultados também não podem explicar as diferenças de sexo no nível celular. Outro (s) fator (es) relacionado (s) ao sexo podem contribuir para a aterogenicidade de camundongos fêmeas C57, juntamente com anormalidades do metabolismo dos lipídeos do plasma e dos macrófagos.

Em resumo, nossos achados levam à conclusão de que as atividades enzimáticas no metabolismo lipídico celular e suas respostas a uma dieta rica em colesterol são geneticamente reguladas em camundongos C57 e C3H.


Clonagem CReasPy: um método para clonagem simultânea e engenharia de genomas do tamanho de megabase em leveduras usando o sistema CRISPR-Cas9

Na última década, uma nova estratégia foi desenvolvida para contornar as dificuldades de engenharia genética de algumas espécies microbianas, transferindo (ou "clonando") seu genoma para outro organismo que é passível de modificações genéticas eficientes e, portanto, atua como uma bancada de trabalho viva. Como tal, o fermento Saccharomyces cerevisiae tem sido usado para clonar e criar genomas de vírus, bactérias e algas. A etapa de clonagem requer a inserção de elementos genéticos de levedura no genoma de interesse, a fim de direcionar sua replicação e manutenção como um cromossomo artificial na célula hospedeira. Os métodos atuais de introdução desses elementos genéticos ainda são insatisfatórios, seja por sua natureza aleatória (transposon), seja pela necessidade de sítios de restrição únicos em posições específicas (clonagem TAR). Aqui, descrevemos a clonagem CReasPy, um novo método que combina a capacidade de Cas9 de clivar DNA em um locus especificado pelo usuário e a recombinação homóloga altamente eficiente da levedura para clonar e criar simultaneamente um cromossomo bacteriano na levedura. Usando o genoma de 0,816 Mbp de Mycoplasma pneumoniae como prova de conceito, demonstramos que nosso método pode ser usado para introduzir o elemento genético de levedura em qualquer local do cromossomo bacteriano enquanto simultaneamente deleta vários genes ou grupo de genes. Também mostramos que a clonagem CReasPy pode ser usada para editar até três loci genômicos independentes ao mesmo tempo com uma eficiência alta o suficiente para garantir a triagem de um pequeno (& lt50) número de clones, permitindo tempos de ciclo de engenharia de genoma significativamente reduzidos.

Palavras-chave: CRISPR-Cas9 Saccharomyces cerevisiae clonagem de genoma edição de genoma de transplante de genoma micoplasma.


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Doenças, síndromes ou outras condições anormais causadas por mutações em um ou mais genes ou por alterações cromossômicas.

Uma alteração na sequência de nucleotídeos do genoma de um organismo.

Uma condição médica que está presente antes ou durante o nascimento. Essas doenças, também chamadas de defeitos congênitos, podem ser adquiridas durante o estágio de desenvolvimento fetal ou a partir da composição genética dos pais.

Refere-se à relação entre duas versões de um gene. Os indivíduos recebem duas versões de cada gene, conhecidas como alelos, de cada um dos pais. Se os alelos de um gene forem diferentes, um alelo será expresso - é o gene dominante. O efeito do outro alelo, denominado recessivo, é mascarado.

Uma pessoa ou outro organismo que herdou um alelo recessivo para uma característica genética ou mutação, mas geralmente não exibe essa característica ou apresenta sintomas da doença.

Um tipo especial de divisão celular em organismos que se reproduzem sexualmente, usados ​​para produzir gametas, como espermatozoides ou óvulos. Envolve duas rodadas de divisão que resultam em quatro células com apenas uma cópia de cada cromossomo.

Falha de cromossomos homólogos ou cromátides irmãs em se separarem adequadamente durante a divisão celular.

Estrutura em forma de fio de ácidos nucléicos e proteínas encontradas no núcleo da maioria das células vivas, carregando informações genéticas na forma de genes.

Célula germinativa haplóide masculina ou feminina madura que é capaz de se unir a outra do sexo oposto na reprodução sexual para formar um zigoto.

A união do espermatozóide com o óvulo. Também conhecido como óvulo fertilizado, o zigoto começa como uma única célula, mas se divide rapidamente nos dias seguintes à fertilização. Após esse período de duas semanas de divisão celular, o zigoto eventualmente se torna um embrião.

Um procedimento médico usado principalmente no diagnóstico pré-natal de anormalidades cromossômicas e infecções fetais, bem como para determinação do sexo. Nesse procedimento, uma pequena quantidade de líquido amniótico, que contém tecidos fetais, é coletada do saco amniótico que envolve o feto em desenvolvimento.

Moléculas biológicas que reduzem a quantidade de energia necessária para que uma reação ocorra.

Uma técnica experimental que usa genes para tratar ou prevenir doenças.

Uma sequência de nucleotídeos no DNA ou RNA que codifica uma molécula que tem uma função.

A menor unidade de vida, consistindo de pelo menos uma membrana, citoplasma e material genético.

Uma classe de molécula biológica que consiste em monômeros ligados de aminoácidos e que são as macromoléculas mais versáteis em sistemas vivos e desempenham funções cruciais em essencialmente todos os processos biológicos.

Um portador geneticamente modificado para entregar um gene. Certos vírus são freqüentemente usados ​​como vetores porque podem entregar o novo gene infectando a célula.


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