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Qual é a lógica por trás do congelamento de óvulos se as células podem ser clonadas?

Qual é a lógica por trás do congelamento de óvulos se as células podem ser clonadas?


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Parece-me que há muitas discussões em torno do tópico de alguém congelando seus ovos.

O que eu não entendo é o seguinte:

  1. Por que você congelaria seus óvulos quando sabe que hoje existe a tecnologia para transformar uma célula somática em óvulo, ou não se vê aqui?

  2. Está comprovado que o congelamento não altera a atividade biológica e, portanto, não diminui a chance de dar à luz uma criança malformada?

Para mim, parece muito mais fácil e seguro (e menos caro) produzir gametas femininos artificialmente do que congelá-los e, 10 anos depois, descongelar e esperar que ainda sejam biologicamente ativos.


Por que você congelaria seus ovos?

Para 1, uma mulher pode desejar congelar seus óvulos se ela precisar atrasar o parto. Esta página explora vários motivos pelos quais, por exemplo, "Mulheres que desejam ou precisam adiar a procriação para buscar objetivos educacionais, profissionais ou outros objetivos pessoais.". Além disso, explora algumas explicações básicas do processo, se você estiver interessado. Se uma mulher tiver dúvidas sobre sua fertilidade em 10 anos (usando sua frase final como exemplo), como se ela foi recentemente diagnosticada com câncer, ou precisa terminar os estudos, mas está pronta para se comprometer a ter um bebê em mais de 9 meses, então ela pode decidir congelar seus óvulos por um período quando ela for mais adequada para ter um bebê, usando um período em que ela corpo é mais adequado para a produção de ovos.

O congelamento tem efeitos adversos?

Quanto à sua segunda pergunta, a mesma página menciona o congelamento bem-sucedido de um embrião por 10 anos a -196 graus Celsius, sem efeitos adversos no eventual nascimento.

Independentemente disso, explorar os riscos revela que a decisão sobre se a prática é vista como positiva ou negativa ainda está em jogo - diferentes partes defendem opiniões diferentes, já que parece não haver verdade objetiva sobre efeitos adversos comprovados.

Os riscos descritos por esta clínica devem ser considerados, embora mínimos em comparação com o risco de crianças malformadas, no entanto, ainda é uma escolha popular, embora apresentada como 'experimental'. Este estudo (2010, Rudick et al) mostrou como, nos EUA, a criopreservação já era oferecida em 283 das 442 clínicas de fertilidade pesquisadas. 1/3 dos motivos da escolha foi por mulheres com câncer e os outros 2/3 por mulheres com 'idade materna avançada'.

O ACOG (American College of Obstetricians and Gynecologists), em 2013, afirmou que não preconiza o congelamento de óvulos.com o único propósito de contornar o envelhecimento reprodutivo em mulheres saudáveis', no entanto, a ASRM (American Society for Reproductive Medicine) levantou seu rótulo como sendo' experimental 'em 2012. O artigo anteriormente relacionado descreve um estudo conduzido pela ASRM, que 'revisou os dados de quatro ensaios clínicos randomizados e vários estudos observacionais que compararam as taxas de fertilização, as taxas de implantação de embriões e as taxas de gravidez de óvulos frescos versus óvulos congelados', e 'não mostraram aumento de defeitos congênitos, distúrbios do desenvolvimento ou anormalidades cromossômicas quando os ciclos de fertilização in vitro foram conduzidos com óvulos congelados, levando a sociedade a declarar a técnica eficaz e segura'.

Conclusão

Sua pergunta é um pouco ampla e pode ser respondida pela escolha subjetiva da mulher / mulheres envolvidas, no entanto, o ASRM ainda enfatiza que "devemos proceder com cautela ao usar isso como uma técnica eletiva", estabelecendo uma linha clara entre 'necessidade' e 'querer'. No entanto, não há evidências que mostrem que as taxas de anormalidade são maiores usando este método, mas considerando que ainda é uma prática relativamente nova que está sendo comercializada como um escolha em vez de um tratamento médico, há ceticismo no ar em torno de se o marketing de designs científicos e médicos como uma mera 'escolha' para mulheres mais velhas levará esta tecnologia a se tornar melhor ou pior.

Além disso, sobre o seu comentário sobre ser 'menos caro', este site mostra que o custo médio da fertilização in vitro nos EUA é atualmente de cerca de 10.000 - 20.000 USD, enquanto o primeiro site que vinculei (aqui) estima o custo em cerca de 10.000 USD para passar por um ciclo de congelamento de óvulos. No entanto, os preços variam de clínica para clínica. Apesar de tudo, os preços ainda são semelhantes e a escolha recai sobre a mulher escolher pagar e congelar seus óvulos se, por exemplo, ela foi recentemente diagnosticada com câncer ou teme não estar fértil em 5 anos ou mais.

Espero que esta resposta tenha sido suficiente para responder às suas perguntas, e se você tiver mais perguntas, sinta-se à vontade para me perguntar :)

Fontes:


Produção Embrião

Lisette A. Maddison,. Wenbiao Chen, em Methods in Cell Biology, 2011

2 Triagem de eventos de armadilhas genéticas

Cruze peixes injetados com armadilhas de genes individuais em peixes selvagens.

Colete ovos de acasalamentos bem-sucedidos. eu.

Segure os peixes com armadilhas de genes em um pequeno tanque separado.

Rastreio de fluorescência 1.

A 24 hpf, 48 hpf e 5 dpf. eu.

Verifique a fluorescência nos canais vermelho e amarelo.

Mantenha os embriões com expressão de proteína fluorescente e levante-os até a maturidade. O DNA genômico pode ser isolado de biópsias de cauda às 6 semanas de idade para identificação da inserção.

Se mais de 10 embriões com padrão de expressão idêntico estiverem disponíveis em uma única ninhada, 1-3 embriões podem ser usados ​​para a identificação da inserção e o restante pode ser elevado à maturidade.


Engenharia Genética Humana

A tecnologia genética possui o potencial de mudar a espécie humana para sempre. O Projeto Genoma Humano, a ser concluído em breve, capacitará cientistas genéticos com um livro de instruções biológicas humanas. Os genes em todas as nossas células contêm o código das proteínas que fornecem a estrutura e a função de todos os nossos tecidos e órgãos. Conhecer esse código completo abrirá novos horizontes para o tratamento e talvez a cura de doenças que permaneceram um mistério por milênios. Mas junto com o uso louvável e compassivo da tecnologia genética vem o espectro de objetivos obscuros e objetivos malévolos.

Para alguns, o potencial de uso indevido é razão suficiente para fechar a porta completamente - os benefícios simplesmente não compensam os riscos. Neste artigo, gostaria de explorar a aplicação da tecnologia genética aos seres humanos e aplicar a sabedoria bíblica aos eventuais atoleiros éticos que não estão muito distantes. Nesta seção, investigaremos as várias maneiras pelas quais os humanos podem ser projetados.

Uma vez que introduzimos genes estranhos em embriões de camundongos, vacas, ovelhas e porcos por anos, não há razão tecnológica para sugerir que isso não possa ser feito em humanos também. Atualmente, existem duas maneiras de buscar a transferência de genes. Uma é simplesmente tentar aliviar os sintomas de uma doença genética. Isso envolve terapia gênica, tentando transferir o gene normal apenas para os tecidos mais afetados pela doença. Por exemplo, as infecções brônquicas são a principal causa de morte precoce para pacientes com fibrose cística (FC). Os pulmões de pacientes com FC produzem muco espesso que fornece um excelente meio de crescimento para bactérias e vírus. Se o gene normal puder ser inserido nas células dos pulmões, talvez a qualidade e a quantidade de sua vida possam ser melhoradas. Mas esta não é uma cura completa e eles ainda passarão o gene da FC para seus filhos.

Para curar uma doença genética, o gene defeituoso deve ser substituído por todo o corpo. Se o defeito genético for detectado em um embrião inicial, é possível adicionar o gene neste estágio, permitindo que o gene normal esteja presente em todos os tecidos, incluindo tecidos reprodutivos. Essa técnica tem sido usada para adicionar genes estranhos a camundongos, ovelhas, porcos e vacas.

No entanto, no momento, nenhum laboratório é conhecido por tentar essa tecnologia bem desenvolvida em humanos. O biólogo molecular de Princeton, Lee Silver, oferece duas razões. 1 Primeiro, mesmo em animais, funciona apenas 50% do tempo. Em segundo lugar, mesmo quando bem-sucedido, cerca de 5% das vezes, o novo gene é colocado no meio de um gene existente, criando uma nova mutação. Atualmente, essas probabilidades não são aceitáveis ​​para os cientistas e, especialmente, para os clientes em potencial que desejam obter a engenharia genética de seus descendentes. Mas esses são apenas problemas de técnica. É razoável supor que essas dificuldades possam ser superadas com pesquisas adicionais.

A engenharia genética deve ser usada para curar doenças genéticas?

O principal uso da engenharia genética humana diz respeito à cura de doenças genéticas. Mas mesmo isso deve ser abordado com cautela. Certamente, dentro de uma cosmovisão cristã, aliviar o sofrimento sempre que possível é andar nas pegadas de Jesus. Mas que doenças? Até que ponto nossa capacidade de interferir na vida deve ir? Até agora, a terapia genética foi testada principalmente para doenças debilitantes e fatais, como a fibrose cística.

O primeiro ensaio de terapia genética em humanos corrigiu um distúrbio imunológico com risco de vida em uma menina de dois anos que, agora, dez anos depois, está bem. A terapia genética exigiu dezenas de aplicativos, mas salvou a família de uma conta de US $ 60.000 por ano para o tratamento medicamentoso necessário sem a terapia genética. 2 Recentemente, dezesseis pacientes com doenças cardíacas, que estavam literalmente esperando pela morte, receberam uma solução contendo cópias de um gene que ativa o crescimento dos vasos sanguíneos por injeção diretamente no coração. Com o crescimento de novos vasos sanguíneos ao redor das artérias obstruídas, todos os dezesseis apresentaram melhora e seis ficaram completamente aliviados da dor.

Em cada um desses casos, a terapia genética foi realizada como último recurso para uma condição fatal. Isso parece cair facilmente dentro dos limites médicos de buscar a cura e, ao mesmo tempo, não causar danos. O problema surgirá quando a terapia genética for buscada para aliviar uma condição que é menos do que fatal e talvez considerada por alguns simplesmente como um dos inconvenientes da vida, como um gene que pode oferecer resistência à AIDS ou pode melhorar a memória . Esses genes são conhecidos agora e muitos estão sugerindo que esses objetivos estarão e devem estar disponíveis para a terapia gênica.

O aspecto mais problemático da terapia genética tem sido determinar o melhor método de entregar o gene às células certas e estimulá-las a incorporar o gene nos cromossomos da célula & # 8217s. A maioria dos pesquisadores usou formas mutiladas de vírus que incorporam naturalmente seus genes às células. Todo o campo da terapia gênica sofreu um sério revés em setembro de 1999, após a morte de Jesse Gelsinger, que havia se submetido à terapia gênica para uma deficiência enzimática hereditária na Universidade da Pensilvânia. 3 Jesse aparentemente sofreu uma reação imunológica severa e morreu quatro dias após ser injetado com o vírus modificado.

O mesmo vetor de vírus foi usado com segurança em milhares de outros testes, mas, neste caso, depois de liberar pilhas de dados clínicos e responder a perguntas por dois dias, os pesquisadores não entenderam completamente o que havia de errado. 4 Outras instituições também não apresentaram relatórios imediatos, conforme exigido, de eventos adversos graves em seus julgamentos, o que levou a uma revisão do Congresso. 5 Tudo isso deve indicar que as respostas para os problemas técnicos da terapia gênica não foram respondidas e o progresso será retardado à medida que as diretrizes e os procedimentos de notificação são estudados e reavaliados.

Corrigir meu problema genético, impedirá em meus descendentes?

A resposta simples é não, pelo menos no futuro previsível. A terapia gênica atualmente tem como alvo o tecido existente em uma criança ou adulto existente. Isso pode aliviar ou eliminar os sintomas nesse indivíduo, mas não afetará as crianças futuras. Para realizar uma correção para as gerações futuras, a terapia genética precisaria ter como alvo as células germinativas, o espermatozóide e o óvulo. Isso coloca vários problemas técnicos no momento. Também existe uma preocupação muito real em tomar decisões genéticas para as gerações futuras sem o seu consentimento.

Alguns procurariam contornar essas dificuldades realizando terapia gênica em embriões precoces antes que a diferenciação de tecidos ocorresse. Isso permitiria que o novo gene fosse incorporado em todos os tecidos, incluindo órgãos reprodutivos. No entanto, esse processo não faz nada para aliviar a condição de quem já sofre de doenças genéticas. Além disso, como mencionado no início desta semana, este procedimento colocaria os embriões em risco inaceitável devido à taxa inerente de falha e dano potencial ao embrião.

Outra maneira de afetar a terapia gênica da linha germinativa envolveria uma combinação de terapia gênica e clonagem. 6 Um embrião, fertilizado em vitro, do espermatozóide e do óvulo de um casal em risco de anemia falciforme, por exemplo, poderiam ser testados para o gene da célula falciforme. Se o teste do embrião for positivo, as células podem ser removidas desse embrião inicial e cultivadas em cultura. Então, o gene normal da hemoglobina seria adicionado a essas células cultivadas.

Se a técnica de clonagem humana pudesse ser aperfeiçoada, uma dessas células poderia ser clonada para criar um novo indivíduo. Se a clonagem fosse bem-sucedida, o bebê resultante seria um gêmeo idêntico do embrião original, apenas com o gene da célula falciforme substituído pelo gene da hemoglobina normal. Isso resultaria em um bebê normal e saudável. Infelizmente, o embrião inicial foi sacrificado para permitir a engenharia de seu gêmeo idêntico, uma troca eticamente inaceitável.

Portanto, o que vimos é que mesmo a terapia genética humana não é uma solução de longo prazo, mas temporária e individual. Mas mesmo ao tolerar o uso da terapia gênica para fins terapêuticos, precisamos ter cuidado para que aqueles para quem a terapia gênica não está disponível por razões éticas ou monetárias não sejam deixados de lado. Seria fácil evitar aqueles com defeitos não corrigidos como menos do que desejáveis ​​ou até menos do que humanos. Na verdade, há muito em que pensar.

A engenharia genética deve ser usada para produzir super-humanos?

A possibilidade de alguém ou algum governo utilizar as novas ferramentas da engenharia genética para criar uma raça superior de humanos deve pelo menos ser considerada. Precisamos enfatizar, entretanto, que simplesmente não sabemos quais fatores genéticos determinam características popularmente desejadas, como habilidade atlética, inteligência, aparência e personalidade. Com certeza, cada um deles tem um componente significativo que pode estar disponível para manipulação genética, mas é seguro dizer que nosso conhecimento de cada um desses traços está em sua infância.

Mesmo com o aumento do conhecimento dessas áreas, outras qualidades genéticas podem impedir sua engenharia. Até agora, poucos genes têm apenas uma aplicação no corpo. A maioria dos genes apresenta efeitos múltiplos, às vezes em tecidos diferentes. Portanto, a engenharia de um gene para o aprimoramento de uma característica particular - digamos, memória - pode causar inadvertidamente maior suscetibilidade ao vício em drogas.

Mas e se nos próximos 50 a 100 anos, muitas dessas incógnitas puderem ser antecipadas e a engenharia para características vantajosas se tornar possível. O que podemos esperar? Nossa preocupação é que, sem um redirecionamento da visão de mundo da cultura, haverá uma tendência crescente de querer assumir a evolução da espécie humana. Muitas pessoas veem isso, somos simplesmente macacos eretos, de grande cérebro. Não existe mente independente. Nossa mente se torna simplesmente uma construção física do cérebro. Embora o cérebro seja certamente complicado e nosso nível de compreensão de seu intrincado mecanismo cresça diariamente, alguns esperam que no futuro possamos compreender o suficiente para mudar quem e o que somos como espécie, a fim de atender às futuras demandas de sobrevivência.

Edward O. Wilson, entomologista de Harvard, acredita que em breve enfrentaremos dilemas genéticos difíceis. Devido aos avanços esperados na terapia genética, não seremos apenas capazes de eliminar ou, pelo menos, aliviar as doenças genéticas, poderemos ser capazes de aprimorar certas habilidades humanas, como matemática ou habilidade verbal. Ele diz: & # 8220Logo devemos olhar profundamente dentro de nós mesmos e decidir o que desejamos nos tornar. & # 8221 7 Já em 1978, Wilson refletiu sobre nossa eventual necessidade de & # 8220decidir quão humanos desejamos ser. & # 8221 8

Surpreendentemente, Wilson prevê que as gerações futuras optarão apenas pelo reparo de doenças incapacitantes e não realizarão melhorias genéticas. Sua única razão, entretanto, é uma pergunta. & # 8220 Por que uma espécie deveria desistir do núcleo definidor de sua existência, construído por milhões de anos de tentativa e erro biológico? & # 8221 9 Wilson é ingenuamente otimista. Já existem vozes altas afirmando que o homem pode intencionalmente arquitetar nosso futuro & # 8220evolucionário & # 8221 melhor do que as mutações casuais e a seleção natural. A hora de mudar o curso desse lento trem para a destruição é agora, não mais tarde.

Devo ser capaz de determinar o sexo do meu filho?

Muitas das questões em torno do uso ético das práticas de engenharia genética são difíceis de responder com um simples sim ou não. Este é um deles. A resposta gira em torno do método usado para determinar a seleção do sexo e do momento da própria seleção.

Por exemplo, se o sexo de um feto é determinado e considerado indesejável, ele só pode ser retificado pelo término do embrião ou feto, seja no laboratório ou no útero por meio de aborto. Existem todos os motivos para proibir este processo. Primeiro, uma vida inocente foi sacrificada. O princípio da santidade da vida humana exige que uma nova vida inocente não seja morta por nenhum motivo além de salvar a vida da mãe. Em segundo lugar, mesmo neste país onde o aborto é legal, seria de se esperar que restrições fossem colocadas em vigor para evitar que uma vida fosse tirada simplesmente porque é do sexo errado.

No entanto, existem procedimentos que podem separar os espermatozoides que carregam o cromossomo Y daqueles que carregam o cromossomo X. Os óvulos fertilizados por espermatozoides que carregam o Y serão machos e os óvulos fertilizados por espermatozoides que carregam o X serão fêmeas. Se a amostra de esperma usada para fertilizar um óvulo foi selecionada para o cromossomo Y, você simplesmente aumenta as chances de ter um menino (

90%) sobre uma garota. Enquanto o casal estiver disposto a aceitar um menino ou uma menina e não descartar o embrião ou abortar o bebê se for do sexo errado, é difícil dizer que tal procedimento deva ser proibido.

Uma razão para utilizar este procedimento é reduzir o risco de uma doença genética ligada ao sexo. Daltonismo, hemofilia e síndrome do X frágil podem ser devidos a mutações no cromossomo X. Portanto, os homens (com apenas um cromossomo X) têm muito mais probabilidade de sofrer dessas características quando a mãe é portadora ou o pai é afetado. (Nas mulheres, o segundo cromossomo X geralmente carrega o gene normal, mascarando o gene mutado no outro cromossomo X). A seleção de uma menina por seleção de esperma reduz muito a possibilidade de ter um filho com qualquer uma dessas doenças genéticas.Novamente, é difícil argumentar contra o desejo de reduzir o sofrimento quando uma vida não foi perdida.

Mas devemos perguntar, é a determinação do sexo por seleção de esperma sensato? Um casal que já tem um menino e simplesmente quer uma menina para equilibrar sua família, parece bastante inocente. Mas por que isso é importante? O que alimenta esse desejo? É perigoso assumir cada vez mais controle sobre nossas vidas e deixar a soberania de Deus para trás. Esta não é uma situação de vida ou morte ou mesmo de redução do sofrimento.

Mas embora possa ser difícil encontrar algo seriamente errado com a seleção do sexo, também é difícil encontrar algo de bom nisso. Mesmo quando o objetivo pode ser evitar uma doença ligada ao sexo, corremos o risco de comunicar a outras pessoas afetadas por essas doenças que, porque eles poderia foram evitados, sua vida é de alguma forma menos valiosa. Portanto, embora possa não ser prudente proibir tais práticas, certamente também não deve ser abordado casualmente.

1 Lee Silver, Refazendo o Éden: clonagem e mais além em um admirável mundo novo, New York, NY: Avon Books, p. 230-231.

2 Leon Jaroff, histórias de sucesso, Tempo, 11 de janeiro de 1999, p. 72-73.

3 Sally Lehrman, Tratamento do vírus questionado após a morte por terapia genética, Natureza Vol. 401 (7 de outubro de 1999): 517-518.

4 Eliot Marshall, Gene therapy death prompts review of adenovirus vector, Ciência Vol. 286 (17 de dezembro de 1999): 2244-2245.

5 Meredith Wadman, NIH sob fogo de ensaios de terapia genética, Natureza Vol. 403 (20 de janeiro de 1999): 237.

6 Steve Mirsky e John Rennie, O que a clonagem significa para a terapia genética, Americano científico, Junho de 1997, p. 122-123.

8 Edward Wilson, On Natureza Humana, Cambridge, Mass .: Harvard University Press, p. 6


Uma pesquisa recente no site do Canadian Horse Journal fez a pergunta: Os equinos devem ser clonados?

Cerca de 83 por cento dos entrevistados disseram não, não até que mais pesquisas tenham sido feitas. 15 por cento disseram que talvez, em situações especiais com parâmetros estritos, apenas 2 por cento disseram sim, e que o registro de clones deveria ser permitido.

Outrora o conceito mais querido dos escritores de ficção científica, a clonagem trotou para o cenário mundial em 22 de fevereiro de 1997, quando foi anunciado que a ovelha Dolly, uma ovelha clonada no Instituto Roslin em Midlothian, Escócia, havia nascido em 5 de julho de 1996. Dolly foi o primeiro mamífero clonado com sucesso de uma célula adulta. Ela viveu no Instituto até sua morte em 2003.

Dolly chutou as portas do celeiro científico para abrir o caminho para todos os tipos de mamíferos clonados. Junto vieram “gêmeos” de gatos, ratos, veados, gado, moscas-das-frutas, coelhos e outros. Então, em 4 de maio de 2003, o primeiro eqüino e primeira mula, Idaho Gem, nasceu na Universidade de Idaho. Ele foi rapidamente seguido por dois “irmãos” clonados, Utah Pioneer, nascido em 9 de junho, e Idaho Star, nascido em 27 de julho.

Idaho Gem surgiu apenas algumas semanas antes do nascimento do primeiro cavalo clonado, Prometea, um potro Haflinger nascido em 28 de maio de 2003, no Laboratório de Tecnologia Reprodutiva, Cremona, Itália. O primeiro cavalo clonado na América do Norte, Paris Texas, foi produzido pela Texas A & ampM University em 2005.

Em 2006, o principal cavalo castrado de corrida de barril, Scamper, foi clonado e seu garanhão "gêmeo" se tornou o primeiro cavalo clonado a ficar em pé nos Estados Unidos. Em 2010, um cavalo Crioulo nasceu na Argentina, o primeiro clone de cavalo produzido na América do Sul .

Mas o que realmente é clonagem, e o cavalo clonado é literalmente idêntico ao animal original?

“Aproveitamos duas coisas”, explica a Dra. Katrin Hinrichs, professora e Patsy Link Chair em estudos reprodutivos de éguas na Faculdade de Medicina Veterinária e Ciências Biomédicas da Texas A & ampM University. “Primeiro, o núcleo de cada célula do corpo tem o mesmo DNA que codifica como produzir o animal inteiro. Segundo, o oócito (ovo) está pronto para fazer um embrião, cheio de tudo que será necessário para aquele embrião nos primeiros três a quatro dias de desenvolvimento. O procedimento básico é apenas uma variação do que acontece normalmente na fertilização. Normalmente, o óvulo tem metade de um complemento de DNA e o esperma entra no óvulo e traz a outra metade do DNA necessário. Então, com um conjunto completo de DNA, o ovo começa a se desenvolver em um embrião. Na clonagem, removemos o DNA do óvulo e, em seguida, introduzimos uma célula [do cavalo doador] que carrega um complemento completo de DNA. Em seguida, sinalizamos ao óvulo para começar a se desenvolver em um embrião ”.

Embrião clonado que se desenvolveu a ponto de ser transferido com sucesso para o útero de uma égua receptora. Leva cerca de sete a oito dias de cultura para chegar a esse estágio e, normalmente, tem de 100 a 500 células neste estágio. Foto cedida pela Texas A & ampM University

Hinrichs explica que, embora não haja mudanças na genética (DNA) do cavalo clonado, os genes no clone poderiam ser usados ​​de forma diferente - ativados mais ou menos do que no original. Portanto, em uma extensão variável, o clone será um pouco diferente do original.

“Às vezes, a placenta não funciona tão bem quanto deveria”, acrescenta ela, “e isso pode afetar a saúde do potro ao nascer, tornando-o fraco ou tendo um cordão umbilical grande”.

Por mais que as pessoas pensem que um cavalo clonado é uma duplicata do original, isso não significa necessariamente que ele possa fazer o que seu original - freqüentemente chamado de “gêmeo” - pode fazer. Se o potro era fraco ao nascer ou se nasceu com as pernas tortas (como pode acontecer com qualquer potro normal devido à sua posição no útero ou à flexibilidade das membranas ao seu redor), o potro pode não ter as qualidades atléticas do original cavalo. Além disso, a habilidade atlética também é um produto do ambiente, manejo, manejo e treinamento do animal.

Cada cavalo tem seu próprio caráter único, novamente moldado por suas experiências cumulativas, exposição e manuseio. De acordo com Hinrichs, não houve estudos até o momento sobre o quão semelhante o cavalo clonado é ao seu irmão gêmeo original. Um equívoco, diz ela, é que a clonagem produzirá o mesmo animal com as mesmas memórias e experiências. Isso simplesmente não é possível. A clonagem produz um gêmeo geneticamente idêntico, mas, como qualquer conjunto de gêmeos, cada um terá suas próprias memórias e experiências.

“Descobrimos que cada um de nossos clientes geralmente tem uma razão única para seu interesse pela clonagem”, disse Blake Russell, presidente da ViaGen em Cedar Park, Texas. “Estamos produzindo números semelhantes de cada gênero e ainda reproduzimos a genética de grandes garanhões comprovados. Há um caso convincente para clonar os de elite, quer eles tenham passado a vida como uma égua, um castrado ou um garanhão. ”

ViaGen é uma divisão da Trans Ova Genetics e oferece serviços de clonagem e tecnologia de ponta para todas as espécies não primatas. Oferece seu serviço de clonagem de equinos há 13 anos. Nesse período, produziu 200 potros e a empresa possui licenciados no Brasil e na Argentina que estão produzindo potros clonados, alguns para o mercado de pólo.

O motivo mais frequente para a clonagem é preservar a genética única de um atleta eqüino de elite, seja no salto, pólo ou corrida de barril. Muitos desses cavalos são castrados ou éguas. Embora as éguas possam ser reproduzidas, é claro que os capões não podem. Se esses animais valiosos forem clonados, seus gêmeos podem ser mantidos para fins de reprodução exclusiva.

“Cavalos clonados podem se reproduzir”, diz Hinrichs. “Eles são basicamente cavalos normais. A reprodução é a principal razão pela qual as pessoas estão clonando cavalos [para] salvar uma genética valiosa para que possam produzir potros a partir dessas linhagens. Um motivo muito comum para a clonagem é porque um cavalo campeão excelente é um cavalo castrado. Ao cloná-lo, você pode manter o potro clonado intacto e então ser capaz de 'cruzar' com o castrado por meio de seu clone. ”

Ela acrescenta, no entanto, que a clonagem é um procedimento tecnicamente difícil que tem uma grande exigência em termos de custos de equipamentos, necessidade de pessoal especializado e acesso a um estoque de oócitos. Nos primeiros dias, quando Prometea foi parida, os pesquisadores fizeram experiências com 841 ovos reconstruídos. Destes, 22 cresceram em embriões transferíveis e, de 17 embriões transferidos para éguas receptoras, apenas Prometea foi levado a termo e entregue.

Lynx Melody Too é o potro clonado da égua AQHA, Lynx Melody, campeã mundial da National Cutting Horse Association. Foto cortesia da ViaGen

“Os primeiros desafios concentraram-se nos cuidados e transferência de embriões”, diz Russell. “Quando a ViaGen começou a oferecer clonagem eqüina, a tecnologia de embriões equinos ainda girava em torno da utilização de embriões frescos. A ViaGen desenvolveu com sucesso a tecnologia de congelamento de embriões de alta qualidade e hoje, 100 por cento de nossos embriões eqüinos são criopreservados e enviados para nossos locais de transferência de embriões. ViaGen transfere a maioria de nossos embriões eqüinos no Texas para uma clínica veterinária que trabalha conosco há mais de dez anos. ”

No primeiro ano da ViaGen, eles viram alguns potros com tendões contraídos e alguns potros foram perdidos por uma variedade de razões, o que levou a mudanças no processo técnico. Russell diz que muitas das instituições de pesquisa estavam lutando com a saúde do potro imediatamente após o nascimento. O desafio mais significativo que permanece é melhorar a taxa de gravidez. No entanto, as taxas de sucesso agora são altas com o nascimento de potros clonados saudáveis ​​que não requerem cuidados especiais. A empresa garante aos seus clientes um potro com 60 dias de idade, geneticamente verificado, saudável e segurável.

Compreensivelmente, a clonagem tem seu fator de contorção. Avanços na ciência colocaram estratégias de reprodução tentadoras ao alcance das pessoas. Mas só porque você pode, isso significa que você deve?

Para algumas pessoas, o argumento é simplesmente que simplesmente não parece certo fazer experiências com a Mãe Natureza. Há um medo real de que a reação no caminho seja que a prevalência da doença leve a mutações genéticas e que a reprodução repetida para uma linha e / ou disciplina específica possa levar a um gargalo genético, colocando em risco a diversidade saudável da raça.

A clonagem também não é para todas as organizações raciais. O Jockey Club não registrará um puro-sangue clonado, nem de fato registrará qualquer cavalo concebido por qualquer método que não seja a cobertura ao vivo.

A American Quarter Horse Association ganhou recentemente um processo após ter sido processado por um proprietário de Quarter Horses clonados e seus descendentes por atividade antitruste.

“O proprietário prevaleceu no Tribunal Federal dos EUA”, diz Russell. “No entanto, a AQHA apelou e obteve reversão no tribunal de apelações. Portanto, a AQHA está autorizada a continuar sua restrição contra o registro de Cavalos Quarto de Milha clonados e seus descendentes. ”

Russell diz, porém, que a maioria dos registros internacionais deu as boas-vindas a cavalos clonados e seus descendentes em seus registros, e vê a tecnologia de clonagem simplesmente como mais uma ferramenta de reprodução a ser usada com responsabilidade pelos criadores para avançar seus objetivos de desempenho. “A decisão da AQHA não parece estar tendo muito impacto nas decisões de outros registros ao redor do mundo. ViaGen continua a fornecer serviços de clonagem para um grande número de proprietários de AQHA e eles estão usando a tecnologia para reproduzir o DNA de seus cavalos de elite AQHA. A maioria dos eventos, exceto corridas de cavalos, dá as boas-vindas a potros produzidos com técnicas avançadas de criação. A ViaGen também está fornecendo nossos serviços para proprietários da maioria das outras raças ao redor do mundo, incluindo puro-sangue usado para outros fins que não corrida, cavalos de esporte olímpico, cavalos de pólo, cavalos de corrida de barril, cavalos de corte, etc. ”

A clonagem tem um valor mais amplo na reprodução animal, especialmente na preservação de linhagens genéticas para proteção da vida selvagem.

“A principal justificativa que vejo para a clonagem é preservar a genética como em castrados valiosos ou no caso de espécies ou raças raras ou ameaçadas de extinção, para que seja possível expandir o pool genético”, diz Hinrichs. “Você poderia usar células de animais que morreram décadas atrás (se as células foram recuperadas antes ou na morte e congeladas) que estão sub-representadas na população hoje.”

O Frozen Zoo at San Diego Zoo Conservation Research tem criopreservado material genético de espécies ameaçadas de extinção desde 1976. De acordo com seu site, cerca de 15.000 amostras de esperma de 1.232 machos representando 309 espécies estão atualmente armazenadas nas instalações. Além disso, oócitos (ovos) de 381 fêmeas de 177 espécies também são criopreservados para fertilização e transferência de embriões. Gerenciadas adequadamente, as células congeladas permanecem viáveis ​​por décadas. Por exemplo, seus pesquisadores conseguiram uma fertilização bem-sucedida ao injetar esperma congelado por mais de 20 anos nos oócitos do rinoceronte branco do sul, ameaçados de extinção.

Em 15 de setembro de 2008, o banco genético francês Cryozootech anunciou o nascimento do potro Gemini, um clone do cavalo puro-sangue, Gem Twist, considerado um dos melhores jumpers de corrida da história. Em 2012, nasceu o primeiro potro de Gêmeos. Foto cortesia da ViaGen

Além disso, culturas de células viáveis ​​congeladas de mais de 9.000 animais individuais, representando cerca de 1.000 espécies, também estão na coleção. Amostras de DNA e tecido em bancos são mantidas para estudos de pesquisa que podem fornecer informações valiosas para gerenciar e preservar de forma sustentável as populações selvagens no futuro. No combate ao comércio ilegal de peças de animais silvestres, os códigos de barras genéticos permitem identificar as espécies utilizadas na fabricação de bolsas, calçados ou carnes comercializadas em mercados urbanos.

Russell diz que a ViaGen oferece um serviço de preservação genética para fornecer opções para proprietários de cavalos, gado e animais de estimação que desejam preservar a capacidade de considerar a clonagem no futuro.

“Temos milhares de animais representados em nosso banco de criopreservação e frequentemente clonamos cavalos que tiveram seu DNA preservado há 20 anos.”

Ele acrescenta que a clonagem tem valor quando os criadores se deparam com o desafio de uma égua ou garanhão subfértil em seu programa de criação. Uma tecnologia conhecida como injeção intracitoplasmática de espermatozóide equino (ICSI) pode ser útil quando o suprimento de espermatozoides congelados é limitado ou a égua não consegue engravidar sozinha. Mas os resultados de ICSI são altamente variáveis ​​e caros. Ele diz que a rota da clonagem abre novos métodos de reprodução mais fáceis, como a inseminação artificial (IA) ou o serviço natural.

“Pode fazer muito mais sentido econômico reproduzir um garanhão comprovado que passou do que investir na incrível despesa e no desafio de utilizar uma tecnologia especializada como a ICSI em cada criação”, diz ele. “Encontramos uma situação semelhante com éguas idosas e de elite.”

A clonagem não é barata e deve ser considerada um investimento de longo prazo.

“Atualmente, estamos oferecendo nosso serviço de clonagem eqüina por US $ 85.000”, diz Russell. “Isso é garantido para produzir um potro saudável, geneticamente verificado e [capaz de] passar em um exame de seguro aos 60 dias de idade. O ViaGen permite que o cliente pegue o potro ao lado da égua receptora aos 60 dias de idade e, posteriormente, devolva a égua receptora quando o potro for desmamado. Para as éguas receptoras e potros que saem do país, o ViaGen permite que o cliente retenha a égua receptora. A ViaGen concorda em manter o potro e a égua receptora por até 60 dias para inspeção, mas muitos dos clientes optam por levá-los para casa mais cedo para que possam criá-los em seu próprio sistema de manejo. ”

ViaGen provou ter um histórico positivo com cada linha de células nos últimos dez anos. À medida que os potros clonados crescem e fazem sua própria contribuição para as carreiras de desempenho e produção, eles percebem um aumento na demanda.

Para criadores que pensam em clonagem, o primeiro passo é uma amostra de biópsia simples retirada por seu veterinário. ViaGen fornece um kit de biópsia de preservação genética. As células são cultivadas em cultura a partir da amostra de biópsia e, uma vez concluídas, são criopreservadas para uso futuro. Isso mantém as opções abertas por décadas, e não deve haver necessidade de coletar novamente uma amostra de biópsia do cavalo. Tecido, no entanto, não pode ser retirado de um cavalo que foi sacrificado. A taxa pelo serviço é de $ 1.600 e a taxa de armazenamento anual é de $ 150 por animal.

Como Blake Russell, da ViaGen, começou a clonagem

O presidente da ViaGen, Blake Russell, foi criado no negócio de corridas de cavalos Quarter Horse e passou seus anos de formação com cavalos. Ele ingressou na empresa há mais de dez anos. Junto com um grupo de cavaleiros experientes, eles montaram uma lista de cavalos de grande desempenho que tinham pedigrees de elite, mas eram incapazes de procriar. O campeão de corrida Quarter Horse Tailor Fit estava no topo da lista. Ele foi castrado como um ano de idade, pois seus proprietários estavam mais interessados ​​em uma carreira na pista de corrida do que em uma carreira de criador. Sua mãe, Silk Skirt, foi um outlier comprovado e seu pai, Strawfly Special, foi um dos grandes.

Tailor Fit conquistou o título mundial de corridas AQHA duas vezes e ganhou bem mais de um milhão de dólares e um índice de velocidade de 110. Ele representou as características mais desejadas em cavalos de desempenho com tremenda conformação, um nível de coração e determinação raramente visto, e velocidade de elite. Russell disse que uma olhada em seu pedigree mostrou que essas características não aparecem por acaso, mas são o resultado de um conjunto superior de genes.

“Eu abordei o dono do Tailor Fit depois de sua aposentadoria e ela pediu que eu continuasse com a clonagem dele, já que carregava a paixão de construir um programa de reprodução em torno dele. Fiz o investimento e foi uma jornada difícil de descrever com palavras. ”

O resultado? Pure Tailor Fit.

“Pure Tailor Fit (o garanhão clonado) tem sido saudável e normal em todos os sentidos. Seu atletismo é fora de série e seus traços de personalidade atraem todos para ele como a atração principal. A safra mais antiga de potros de ‘Fit’ completou dois anos em 2016, e eu tenho 20 deles em nossa casa. Estamos extremamente entusiasmados com seu futuro, pois eles parecem carregar os atributos que iniciaram esta jornada em primeiro lugar. ”

Pure Tailor Fit é o garanhão clonado de propriedade de Blake Russell, presidente da ViaGen, Texas. Pure Tailor Fit foi clonado de Taylor Fit, bicampeão mundial de corrida, cavalo castrado. Foto cortesia da ViaGen

Correr com os potros na AQHA é proibido, pois eles não podem ser registrados, mas o programa de Russell é projetado em torno da produção de cavalos de corrida de barril e cavalos de corda excepcionais.

“Cada dia‘ Fit ’ou um de seus bebês confirma nossa decisão de trazer este pedigree de volta à produção. As pessoas muitas vezes se confundem com a clonagem e não entendem o valor de gêmeos idênticos. Irmãos completos não são um bom reflexo do poder da clonagem. Pure Tailor Fit carrega exatamente o mesmo valor de criação que Tailor Fit teria representado se ele tivesse tido permissão para permanecer intacto e procriar. A capacidade de ter um alto desempenho com um pedigree de elite e sem defeitos genéticos e estabelecer um programa de reprodução é a razão para a existência da tecnologia de clonagem.

A ViaGen Equine está clonando cavalos de elite para atletas olímpicos, criadores de classe mundial e proprietários dos melhores atletas eqüinos do mundo. No entanto, posso sair pela porta da frente todos os dias e ver com meus próprios olhos o poder desta tecnologia. ”


Conteúdo

Pelo menos seis áreas principais da criobiologia podem ser identificadas: 1) estudo de adaptação ao frio de microrganismos, plantas (resistência ao frio) e animais, tanto invertebrados como vertebrados (incluindo hibernação), 2) criopreservação de células, tecidos, gametas e embriões de origem animal e humana para fins (médicos) de armazenamento de longo prazo por resfriamento a temperaturas abaixo do ponto de congelamento da água. Isso geralmente requer a adição de substâncias que protegem as células durante o congelamento e descongelamento (crioprotetores), 3) preservação de órgãos em condições hipotérmicas para transplante, 4) liofilização (liofilização) de produtos farmacêuticos, 5) criocirurgia, um (minimamente) invasivo abordagem para a destruição de tecido insalubre usando gases / fluidos criogênicos, e 6) física do super-resfriamento, nucleação / crescimento do gelo e aspectos de engenharia mecânica da transferência de calor durante o resfriamento e aquecimento, conforme aplicado a sistemas biológicos. A criobiologia incluiria a criônica, a preservação de baixa temperatura de humanos e mamíferos com a intenção de um futuro renascimento, embora isso não faça parte da criobiologia convencional, dependendo fortemente de tecnologia especulativa ainda a ser inventada. Várias dessas áreas de estudo dependem da criogenia, o ramo da física e da engenharia que estuda a produção e o uso de temperaturas muito baixas.

Muitos organismos vivos são capazes de tolerar períodos prolongados de tempo em temperaturas abaixo do ponto de congelamento da água. A maioria dos organismos vivos acumula crioprotetores, como proteínas antinucleantes, polióis e glicose para se proteger contra os danos causados ​​pelo gelo por cristais de gelo afiados. A maioria das plantas, em particular, pode atingir temperaturas de −4 ° C a −12 ° C com segurança.

Edição de bactérias

Três espécies de bactérias, Carnobacterium pleistocenium, Chryseobacterium greenlandensis, e Herminiimonas glaciei, supostamente foram revividos após sobreviver por milhares de anos congelados no gelo. Certas bactérias, notavelmente Pseudomonas Syringae, produzem proteínas especializadas que servem como potentes nucleadores de gelo, que usam para forçar a formação de gelo na superfície de várias frutas e plantas a cerca de -2 ° C. [1] O congelamento causa lesões no epitélio e torna os nutrientes dos tecidos vegetais subjacentes disponíveis para a bactéria. [2] Listeria cresce lentamente em temperaturas tão baixas quanto -1,5 ° C e persiste por algum tempo em alimentos congelados. [3]

Editar Plantas

Muitas plantas passam por um processo denominado endurecimento, que lhes permite sobreviver a temperaturas abaixo de 0 ° C por semanas a meses.

Animais Editar

Editar Invertebrados

Os nematóides que sobrevivem abaixo de 0 ° C incluem Trichostrongylus colubriformis e Panagrolaimus davidi. Ninfas baratas (Periplaneta japonica) sobrevivem a curtos períodos de congelamento a -6 a -8 ° C. O besouro de casca chata vermelha (Cucujus clavipes) pode sobreviver após ser congelado a -150 ° C. [4] O mosquito do fungo Exechia nugatoria pode sobreviver após ser congelado a -50 ° C, por um mecanismo único pelo qual cristais de gelo se formam no corpo, mas não na cabeça. Outro besouro tolerante ao congelamento é Upis ceramboides. [5] Veja ecologia de inverno de insetos e proteína anticongelante. Outro invertebrado que é brevemente tolerante a temperaturas abaixo de -273 ° C é o tardígrado.

As larvas de Haemonchus contortus, um nematóide, pode sobreviver 44 semanas congelado a -196 ° C.

Vertebrados Editar

Para o sapo da madeira (Rana sylvatica), no inverno, até 45% do seu corpo pode congelar e virar gelo. "Cristais de gelo se formam sob a pele e se espalham entre os músculos esqueléticos do corpo. Durante o congelamento, a respiração, o fluxo sanguíneo e os batimentos cardíacos da rã cessam. O congelamento é possibilitado por proteínas especializadas e glicose, que evitam o congelamento intracelular e a desidratação." [6] [7] A rã-da-madeira pode sobreviver até 11 dias congelada a -4 ° C.

Outros vertebrados que sobrevivem a temperaturas corporais abaixo de 0 ° C incluem tartarugas pintadas (Chrysemys picta), pererecas cinzentas (Hyla versicolor), tartarugas de caixa (Carolina terrapene - 48 horas a -2 ° C), peeper primavera (Pseudacris crucifer), cobras-liga (Thamnophis sirtalis- 24 horas a -1,5 ° C), a rã do coro (Pseudacris triseriata), Salamandra siberiana (Salamandrella keyserlingii - 24 horas a -15,3 ° C), [8] lagarto comum europeu (Lacerta vivipara) e peixes da Antártica, como Pagothenia borchgrevinki. [9] [10] Proteínas anticongelantes clonadas de tais peixes têm sido usadas para conferir resistência ao congelamento em plantas transgênicas. [ citação necessária ]

Os esquilos terrestres do Ártico em hibernação podem ter temperaturas abdominais tão baixas quanto -2,9 ° C (26,8 ° F), mantendo as temperaturas abdominais abaixo de zero por mais de três semanas de cada vez, embora as temperaturas na cabeça e pescoço permaneçam em 0 ° C ou acima. [11]

Fundo histórico Editar

A história da criobiologia pode ser rastreada até a antiguidade. Já em 2500 aC, baixas temperaturas eram usadas na medicina no Egito. O uso do frio foi recomendado por Hipócrates para estancar o sangramento e o inchaço. Com o surgimento da ciência moderna, Robert Boyle estudou os efeitos das baixas temperaturas nos animais.

Em 1949, o sêmen de touros foi criopreservado pela primeira vez por uma equipe de cientistas liderada por Christopher Polge. [12] Isso levou a um uso muito mais amplo da criopreservação hoje, com muitos órgãos, tecidos e células armazenados rotineiramente em baixas temperaturas. Órgãos grandes, como o coração, geralmente são armazenados e transportados, por curtos períodos, em temperaturas frias, mas não congelantes, para o transplante. As suspensões celulares (como sangue e sêmen) e cortes finos de tecido às vezes podem ser armazenados quase indefinidamente em temperatura de nitrogênio líquido (criopreservação). Espermatozoides, óvulos e embriões humanos são armazenados rotineiramente em pesquisas e tratamentos de fertilidade. A taxa controlada e o congelamento lento são técnicas bem estabelecidas, pioneiras no início dos anos 1970, que possibilitaram o primeiro nascimento congelado de embriões humanos (Zoe Leyland) em 1984. Desde então, máquinas que congelam amostras biológicas usando etapas programáveis, ou taxas controladas, têm sido usadas todas em todo o mundo para a biologia humana, animal e celular - 'congelando' uma amostra para melhor preservá-la para eventual descongelamento, antes que seja congelada ou criopreservada em nitrogênio líquido. Essas máquinas são usadas para congelar oócitos, pele, hemoderivados, embriões, espermatozoides, células-tronco e preservação de tecidos em geral em hospitais, clínicas veterinárias e laboratórios de pesquisa. O número de nascidos vivos de embriões 'congelados lentamente' é de cerca de 300.000 a 400.000 ou 20% dos estimados 3 milhões em vitro nascimentos fertilizados. O Dr. Christopher Chen, Austrália, relatou a primeira gravidez no mundo usando oócitos congelados lentamente de um freezer britânico controlado em 1986.

A criocirurgia (destruição de tecido planejada e controlada pela formação de gelo) foi realizada por James Arnott em 1845 em uma operação em um paciente com câncer. A criocirurgia não é comum. [ citação necessária ]

Técnicas de preservação Editar

A criobiologia, como ciência aplicada, preocupa-se principalmente com a preservação em baixas temperaturas. O armazenamento hipotérmico é tipicamente acima de 0 ° C, mas abaixo das temperaturas normotérmicas (32 ° C a 37 ° C) dos mamíferos. O armazenamento por criopreservação, por outro lado, estará na faixa de temperatura de −80 a −196 ° C. Órgãos e tecidos são mais frequentemente os objetos de armazenamento hipotérmico, enquanto as células isoladas têm sido os objetos mais comumente criopreservados.

Uma regra prática no armazenamento hipotérmico é que cada redução de 10 ° C na temperatura é acompanhada por uma redução de 50% no consumo de oxigênio. [13] Embora os animais em hibernação tenham mecanismos adaptados para evitar desequilíbrios metabólicos associados à hipotermia, órgãos hipotérmicos e tecidos mantidos para transplante requerem soluções de preservação especiais para combater a acidose e diminuição da atividade da bomba de sódio. e aumento do cálcio intracelular. Soluções especiais de preservação de órgãos, como Viaspan (solução da Universidade de Wisconsin), HTK e Celsior, foram projetadas para esse fim. [14] Essas soluções também contêm ingredientes para minimizar os danos por radicais livres, prevenir edema, compensar a perda de ATP, etc.

A criopreservação de células é guiada pela "hipótese de dois fatores" do criobiologista americano Peter Mazur, que afirma que o resfriamento excessivamente rápido mata as células pela formação de gelo intracelular e o resfriamento excessivamente lento mata as células por toxicidade eletrolítica ou esmagamento mecânico. [15] Durante o resfriamento lento, o gelo se forma extracelularmente, fazendo com que a água deixe as células osmoticamente, desidratando-as. O gelo intracelular pode ser muito mais prejudicial do que o extracelular.

Para os glóbulos vermelhos, a taxa de resfriamento ideal é muito rápida (quase 100 ° C por segundo), enquanto para as células-tronco, a taxa de resfriamento ideal é muito lenta (1 ° C por minuto). Crioprotetores, como dimetilsulfóxido e glicerol, são usados ​​para proteger as células do congelamento. Vários tipos de células são protegidos por sulfóxido de dimetila a 10%. [16] Os criobiologistas tentam otimizar a concentração do crioprotetor (minimizando a formação de gelo e a toxicidade) e a taxa de resfriamento. As células podem ser resfriadas a uma taxa ótima a uma temperatura entre −30 e −40 ° C antes de serem mergulhadas no nitrogênio líquido.

Os métodos de resfriamento lento baseiam-se no fato de que as células contêm poucos agentes nucleantes, mas contêm substâncias vitrificantes de ocorrência natural que podem prevenir a formação de gelo em células que foram moderadamente desidratadas. Alguns criobiologistas estão buscando misturas de crioprotetores para vitrificação total (formação zero de gelo) na preservação de células, tecidos e órgãos. Os métodos de vitrificação representam um desafio na necessidade de pesquisa de misturas crioprotetoras que possam minimizar a toxicidade.

Em humanos Editar

Gâmetas humanos e embriões de duas, quatro e oito células podem sobreviver à criopreservação a -196 ° C por 10 anos em condições de laboratório bem controladas. [17]

A criopreservação em humanos com relação à infertilidade envolve a preservação de embriões, espermatozoides ou oócitos por congelamento. Concepção, em vitro, é tentada quando o esperma é descongelado e introduzido nos óvulos "frescos", os óvulos congelados são descongelados e os espermatozoides são colocados com os óvulos e juntos são colocados de volta no útero ou um embrião congelado é introduzido no útero. A vitrificação tem falhas e não é tão confiável ou comprovada quanto o congelamento de espermatozoides fertilizados, óvulos ou embriões como os métodos tradicionais de congelamento lento, porque os óvulos sozinhos são extremamente sensíveis à temperatura. Muitos pesquisadores também estão congelando o tecido ovariano junto com os óvulos, na esperança de que o tecido ovariano possa ser transplantado de volta para o útero, estimulando os ciclos normais de ovulação. Em 2004, Donnez de Louvain, na Bélgica, relatou o primeiro nascimento ovariano bem-sucedido a partir de tecido ovariano congelado. Em 1997, amostras do córtex ovariano foram retiradas de uma mulher com linfoma de Hodgkin e criopreservadas em um freezer controlado (Planer, Reino Unido) e armazenadas em nitrogênio líquido. A quimioterapia foi iniciada após a paciente apresentar insuficiência ovariana prematura. Em 2003, após congelamento-descongelamento, foi realizado autotransplante ortotópico de tecido cortical ovariano por laparoscopia e após cinco meses, os sinais de reimplante indicaram recuperação dos ciclos ovulatórios regulares. Onze meses após o reimplante, foi confirmada uma gravidez intra-uterina viável, que resultou no primeiro filho nascido com vida - uma menina chamada Tamara. [18]

Hipotermia terapêutica, e. durante a cirurgia cardíaca em um coração "frio" (gerado pela perfusão fria sem qualquer formação de gelo) permite operações muito mais longas e melhora as taxas de recuperação para os pacientes.

A Society for Cryobiology foi fundada em 1964 para reunir aqueles das ciências biológicas, médicas e físicas que têm um interesse comum nos efeitos das baixas temperaturas nos sistemas biológicos. Em 2007, a Society for Cryobiology tinha cerca de 280 membros de todo o mundo, e metade deles reside nos Estados Unidos. O objetivo da Sociedade é promover a pesquisa científica em biologia de baixa temperatura, para melhorar a compreensão científica neste campo, e para disseminar e aplicar esse conhecimento em benefício da humanidade. A Sociedade exige de todos os seus membros os mais elevados padrões éticos e científicos no desempenho de suas atividades profissionais. De acordo com o estatuto da Sociedade, a associação pode ser recusada a candidatos cuja conduta seja considerada prejudicial à Sociedade em 1982, o estatuto foi alterado explicitamente para excluir "qualquer prática ou aplicação de congelamento de pessoas falecidas na antecipação de sua reanimação", apesar das objeções de alguns membros que eram criônicos, como Jerry Leaf. [19] A Sociedade organiza uma reunião científica anual dedicada a todos os aspectos da biologia de baixa temperatura. Este encontro internacional oferece oportunidades para apresentação e discussão das pesquisas mais atualizadas em criobiologia, bem como revisão de aspectos específicos por meio de simpósios e workshops. Os membros também são mantidos informados sobre as notícias e as próximas reuniões por meio do boletim da Sociedade, Notas de Notícias. O presidente da Society for Cryobiology de 2011-2012 foi John H. Crowe. [20]

A Society for Low Temperature Biology foi fundada em 1964 e tornou-se uma instituição de caridade registrada em 2003 [21] com o objetivo de promover pesquisas sobre os efeitos das baixas temperaturas em todos os tipos de organismos e suas células, tecidos e órgãos constituintes. Em 2006, a sociedade tinha cerca de 130 membros (principalmente britânicos e europeus) e realizava pelo menos uma assembleia geral anual. O programa geralmente inclui um simpósio sobre um assunto tópico e uma sessão de comunicações gratuitas sobre qualquer aspecto da biologia de baixa temperatura. Simpósios recentes incluíram estabilidade de longo prazo, preservação de organismos aquáticos, criopreservação de embriões e gametas, preservação de plantas, microscopia de baixa temperatura, vitrificação (formação de vidro de sistemas aquosos durante o resfriamento), liofilização e banco de tecidos. Os membros são informados por meio do Boletim da Sociedade, que atualmente é publicado três vezes por ano.

Criobiologia (editora: Elsevier) é a publicação científica mais importante nesta área, com cerca de 60 contribuições arbitradas publicadas a cada ano. Os artigos dizem respeito a qualquer aspecto da biologia e medicina de baixa temperatura (por exemplo, congelamento, liofilização, hibernação, tolerância e adaptação ao frio, compostos crioprotetores, aplicações médicas de temperatura reduzida, criocirurgia, hipotermia e perfusão de órgãos).

Cartas Cryo é um jornal de comunicação rápida independente com sede no Reino Unido que publica artigos sobre os efeitos produzidos por baixas temperaturas em uma ampla variedade de processos biofísicos e biológicos, ou estudos envolvendo técnicas de baixa temperatura na investigação de tópicos biológicos e ecológicos.

Biopreservação e Biobanco (anteriormente Cell Preservation Technology) é uma revista científica trimestral revisada por pares publicada por Mary Ann Liebert, Inc. dedicada ao amplo espectro de tecnologias de preservação, incluindo criopreservação, estado seco (anidrobiose) e manutenção em estado vítreo e hipotérmica. Tecnologia de Preservação Celular foi renomeado Biopreservação e Biobanco e é o jornal oficial da International Society for Biological and Environmental Repositories.


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Um alvo biomolecular (mais comumente uma proteína ou um ácido nucleico) é uma molécula-chave envolvida em uma via metabólica ou de sinalização particular que está associada a uma condição de doença ou patologia específica ou à infecciosidade ou sobrevivência de um patógeno microbiano. Os alvos potenciais de drogas não são necessariamente causadores de doenças, mas devem, por definição, serem modificadores da doença. [9] Em alguns casos, pequenas moléculas serão projetadas para aumentar ou inibir a função alvo na via específica de modificação da doença. Moléculas pequenas (por exemplo, agonistas receptores, antagonistas, agonistas inversos ou moduladores, ativadores ou inibidores de enzimas ou abridores ou bloqueadores de canais iônicos) [10] serão projetados para serem complementares ao sítio de ligação do alvo. [11] Moléculas pequenas (drogas) podem ser projetadas de modo a não afetar quaisquer outras moléculas importantes "fora do alvo" (freqüentemente chamadas de anti-alvos), uma vez que as interações medicamentosas com moléculas fora do alvo podem levar a efeitos colaterais indesejáveis. [12] Devido às semelhanças nos locais de ligação, os alvos intimamente relacionados identificados através da homologia de sequência têm a maior chance de reatividade cruzada e, portanto, o maior potencial de efeito colateral.

Mais comumente, os medicamentos são pequenas moléculas orgânicas produzidas por meio de síntese química, mas os medicamentos baseados em biopolímeros (também conhecidos como biofármacos) produzidos por meio de processos biológicos estão se tornando cada vez mais comuns. [13] Além disso, tecnologias de silenciamento de genes baseadas em mRNA podem ter aplicações terapêuticas. [14]

Em contraste com os métodos tradicionais de descoberta de medicamentos (conhecidos como farmacologia direta), que dependem de testes de tentativa e erro de substâncias químicas em células de cultura ou animais e combinando os efeitos aparentes com os tratamentos, o design racional de medicamentos (também chamado de farmacologia reversa) começa com a hipótese de que a modulação de um alvo biológico específico pode ter valor terapêutico. Para que uma biomolécula seja selecionada como alvo de uma droga, são necessárias duas informações essenciais. O primeiro é a evidência de que a modulação do alvo será modificadora da doença. Esse conhecimento pode vir de, por exemplo, estudos de ligação de doenças que mostram uma associação entre mutações no alvo biológico e certos estados de doença. [15] A segunda é que o alvo é "druggable". Isso significa que ele é capaz de se ligar a uma pequena molécula e que sua atividade pode ser modulada pela pequena molécula. [16]

Uma vez que um alvo adequado tenha sido identificado, o alvo é normalmente clonado e produzido e purificado. A proteína purificada é então usada para estabelecer um ensaio de triagem. Além disso, a estrutura tridimensional do alvo pode ser determinada.

A busca por pequenas moléculas que se ligam ao alvo é iniciada pela triagem de bibliotecas de compostos de drogas em potencial. Isso pode ser feito usando o ensaio de triagem (uma "tela úmida"). Além disso, se a estrutura do alvo estiver disponível, uma tela virtual pode ser realizada de drogas candidatas. Idealmente, os compostos de fármaco candidatos devem ser "semelhantes a fármacos", isto é, devem possuir propriedades que se prevê que conduzam à biodisponibilidade oral, estabilidade química e metabólica adequada e efeitos tóxicos mínimos. [17] Vários métodos estão disponíveis para estimar a semelhança com o medicamento, como a Regra de Cinco de Lipinski e uma variedade de métodos de pontuação, como a eficiência lipofílica. [18] Vários métodos para prever o metabolismo de drogas também foram propostos na literatura científica. [19]

Devido ao grande número de propriedades do medicamento que devem ser otimizadas simultaneamente durante o processo de design, às vezes são empregadas técnicas de otimização multiobjetivo. [20] Finalmente, por causa das limitações nos métodos atuais de predição de atividade, o design de drogas ainda depende muito da serendipidade [21] e da racionalidade limitada. [22]

O objetivo mais fundamental no projeto de drogas é prever se uma determinada molécula se ligará a um alvo e, em caso afirmativo, com que força.A mecânica molecular ou dinâmica molecular é mais frequentemente usada para estimar a força da interação intermolecular entre a pequena molécula e seu alvo biológico. Esses métodos também são usados ​​para prever a conformação da molécula pequena e modelar mudanças conformacionais no alvo que podem ocorrer quando a molécula pequena se liga a ela. [3] [4] Métodos semi-empíricos, de química quântica ab initio ou teoria funcional de densidade são frequentemente usados ​​para fornecer parâmetros otimizados para os cálculos de mecânica molecular e também fornecer uma estimativa das propriedades eletrônicas (potencial eletrostático, polarizabilidade, etc.) do candidato a fármaco que influenciará a afinidade de ligação. [23]

Métodos de mecânica molecular também podem ser usados ​​para fornecer previsão semiquantitativa da afinidade de ligação. Além disso, a função de pontuação baseada em conhecimento pode ser usada para fornecer estimativas de afinidade de ligação. Esses métodos usam regressão linear, aprendizado de máquina, redes neurais ou outras técnicas estatísticas para derivar equações de afinidade de ligação preditivas ajustando afinidades experimentais a energias de interação derivadas computacionalmente entre a molécula pequena e o alvo. [24] [25]

Idealmente, o método computacional será capaz de prever a afinidade antes de um composto ser sintetizado e, portanto, em teoria, apenas um composto precisa ser sintetizado, economizando muito tempo e custo. A realidade é que os métodos computacionais atuais são imperfeitos e fornecem, na melhor das hipóteses, apenas estimativas qualitativamente precisas de afinidade. Na prática, ainda são necessárias várias iterações de projeto, síntese e teste antes que uma droga ideal seja descoberta. Os métodos computacionais aceleraram a descoberta, reduzindo o número de iterações necessárias e, muitas vezes, forneceram novas estruturas. [26] [27]

O projeto de medicamentos com a ajuda de computadores pode ser usado em qualquer um dos seguintes estágios de descoberta de medicamentos:

  1. identificação de acertos usando seleção virtual (design baseado em estrutura ou ligante), otimização de afinidade e seletividade (design baseado em estrutura, QSAR, etc.) de outras propriedades farmacêuticas, mantendo a afinidade

A fim de superar a previsão insuficiente de afinidade de ligação calculada por funções de pontuação recentes, a interação proteína-ligante e informações de estrutura 3D do composto são usadas para análise. Para o projeto de drogas com base na estrutura, várias análises pós-triagem com foco na interação proteína-ligante foram desenvolvidas para melhorar o enriquecimento e efetivamente explorar potenciais candidatos:

  • Pontuação de consenso [28] [29]
    • Seleção de candidatos votando em várias funções de pontuação
    • Pode perder a relação entre as informações estruturais da proteína-ligante e o critério de pontuação
    • Representar e agrupar candidatos de acordo com informações 3D de proteína-ligante
    • Necessita de representação significativa das interações proteína-ligante.

    Existem dois tipos principais de desenho de medicamentos. O primeiro é conhecido como projeto de droga à base de ligante e o segundo, projeto de drogas baseado em estrutura. [2]

    Edição baseada em ligante

    Projeto de droga à base de ligante (ou projeto de drogas indiretas) depende do conhecimento de outras moléculas que se ligam ao alvo biológico de interesse. Estas outras moléculas podem ser usadas para derivar um modelo farmacóforo que define as características estruturais mínimas necessárias que uma molécula deve possuir para se ligar ao alvo. [32] Em outras palavras, um modelo do alvo biológico pode ser construído com base no conhecimento do que se liga a ele, e este modelo, por sua vez, pode ser usado para projetar novas entidades moleculares que interagem com o alvo. Alternativamente, uma relação quantitativa estrutura-atividade (QSAR), na qual uma correlação entre as propriedades calculadas das moléculas e sua atividade biológica determinada experimentalmente, pode ser derivada. Essas relações QSAR, por sua vez, podem ser usadas para prever a atividade de novos análogos. [33]

    Edição baseada em estrutura

    Projeto de droga com base na estrutura (ou design de drogas direto) baseia-se no conhecimento da estrutura tridimensional do alvo biológico obtido por meio de métodos como cristalografia de raios-X ou espectroscopia de RMN. [34] Se uma estrutura experimental de um alvo não estiver disponível, pode ser possível criar um modelo de homologia do alvo com base na estrutura experimental de uma proteína relacionada. Usando a estrutura do alvo biológico, as drogas candidatas que se prevê que se liguem com alta afinidade e seletividade ao alvo podem ser projetadas usando gráficos interativos e a intuição de um químico medicinal. Alternativamente, vários procedimentos computacionais automatizados podem ser usados ​​para sugerir novos candidatos a drogas. [35]

    Os métodos atuais para o desenho de medicamentos com base na estrutura podem ser divididos aproximadamente em três categorias principais. [36] O primeiro método é a identificação de novos ligantes para um determinado receptor, pesquisando grandes bancos de dados de estruturas 3D de pequenas moléculas para encontrar aquelas que se encaixam no bolso de ligação do receptor usando programas de acoplamento aproximado rápido. Este método é conhecido como triagem virtual. Uma segunda categoria é o design de novo de novos ligantes. Neste método, as moléculas de ligante são construídas dentro das restrições do bolso de ligação, reunindo pequenos pedaços de uma maneira gradual. Essas peças podem ser átomos individuais ou fragmentos moleculares. A principal vantagem de tal método é que novas estruturas, não contidas em nenhum banco de dados, podem ser sugeridas. [37] [38] [39] Um terceiro método é a otimização de ligantes conhecidos avaliando os análogos propostos dentro da cavidade de ligação. [36]

    Identificação do site de ligação Editar

    A identificação do local de encadernação é a primeira etapa no design baseado em estrutura. [16] [40] Se a estrutura do alvo ou de um homólogo suficientemente semelhante for determinada na presença de um ligante ligado, então o ligante deve ser observável na estrutura, caso em que a localização do sítio de ligação é trivial. No entanto, pode haver locais de ligação alostérica desocupados que podem ser de interesse. Além disso, pode ser que apenas estruturas de apoproteína (proteína sem ligante) estejam disponíveis e a identificação confiável de locais desocupados que têm o potencial de se ligar a ligantes com alta afinidade não seja trivial. Em resumo, a identificação do local de ligação geralmente depende da identificação de superfícies côncavas na proteína que podem acomodar moléculas do tamanho de drogas que também possuem "pontos quentes" apropriados (superfícies hidrofóbicas, locais de ligação de hidrogênio, etc.) que conduzem a ligação do ligante. [16] [40]

    Funções de pontuação Editar

    O projeto de drogas com base na estrutura tenta usar a estrutura das proteínas como base para projetar novos ligantes, aplicando os princípios de reconhecimento molecular. A ligação seletiva de alta afinidade ao alvo é geralmente desejável, uma vez que leva a drogas mais eficazes com menos efeitos colaterais. Assim, um dos princípios mais importantes para projetar ou obter novos ligantes potenciais é prever a afinidade de ligação de um determinado ligante ao seu alvo (e antitargets conhecidos) e usar a afinidade prevista como um critério de seleção. [41]

    Uma das primeiras funções de pontuação empírica de propósito geral para descrever a energia de ligação dos ligantes aos receptores foi desenvolvida por Böhm. [42] [43] Esta função de pontuação empírica assumiu a forma:

    Δ G ligação = Δ G 0 + Δ G hb Σ h - b o n d s + Δ G iônico Σ i o n i c - i n t + Δ G lipofílico | A | + Δ G rot N R O T < displaystyle Delta G _ < text> = Delta G _ < text <0>> + Delta G _ < text> Sigma _+ Delta G _ < text> Sigma _+ Delta G _ < text> left vert A right vert + Delta G _ < text> < mathit >>

    • ΔG0 - deslocamento derivado empiricamente que em parte corresponde à perda geral de entropia translacional e rotacional do ligante após a ligação.
    • ΔGhb - contribuição da ligação de hidrogênio
    • ΔGiônico - contribuição das interações iônicas
    • ΔGlábio - contribuição das interações lipofílicas onde | Alipo| é a área de superfície de contato lipofílico entre o ligante e o receptor
    • ΔGpodridão - penalidade de entropia devido ao congelamento de um rotativo na ligação de ligante após a ligação

    Uma equação "mestre" termodinâmica mais geral é a seguinte: [44]

    • dessolvatação - penalidade entálpica para remover o ligante do solvente
    • movimento - penalidade entrópica para reduzir os graus de liberdade quando um ligante se liga ao seu receptor
    • configuração - energia de deformação conformacional necessária para colocar o ligante em sua conformação "ativa"
    • interação - ganho entálpico para "resolver" o ligante com seu receptor

    A ideia básica é que a energia livre de ligação geral pode ser decomposta em componentes independentes que são conhecidos por serem importantes para o processo de ligação. Cada componente reflete um certo tipo de alteração de energia livre durante o processo de ligação entre um ligante e seu receptor-alvo. A Equação Mestre é a combinação linear desses componentes. De acordo com a equação de energia livre de Gibbs, a relação entre a constante de equilíbrio de dissociação, Kd, e os componentes da energia livre foram construídos.

    Vários métodos computacionais são usados ​​para estimar cada um dos componentes da equação mestre. Por exemplo, a mudança na área de superfície polar após a ligação do ligante pode ser usada para estimar a energia de dessolvatação. O número de ligações rotativas congeladas após a ligação do ligante é proporcional ao termo de movimento. A energia configuracional ou de deformação pode ser estimada usando cálculos de mecânica molecular. Finalmente, a energia de interação pode ser estimada usando métodos como a mudança na superfície apolar, potenciais estatisticamente derivados de força média, o número de ligações de hidrogênio formadas, etc. Na prática, os componentes da equação mestre são ajustados aos dados experimentais usando múltiplos regressão linear. Isso pode ser feito com um conjunto de treinamento diversificado, incluindo muitos tipos de ligantes e receptores para produzir um modelo "global" menos preciso, mas mais geral, ou um conjunto mais restrito de ligantes e receptores para produzir um modelo "local" mais preciso, mas menos geral. [45]

    Um exemplo particular de projeto racional de drogas envolve o uso de informações tridimensionais sobre biomoléculas obtidas a partir de técnicas como cristalografia de raios-X e espectroscopia de RMN. O projeto de drogas auxiliado por computador, em particular, torna-se muito mais tratável quando há uma estrutura de alta resolução de uma proteína alvo ligada a um ligante potente. Essa abordagem para a descoberta de medicamentos às vezes é chamada de desenho de medicamentos com base na estrutura. O primeiro exemplo inequívoco da aplicação de um projeto de medicamento baseado em estrutura que leva a um medicamento aprovado é o inibidor da anidrase carbônica dorzolamida, que foi aprovado em 1995. [46] [47]

    Outro estudo de caso importante no desenho racional de drogas é o imatinibe, um inibidor da tirosina quinase projetado especificamente para o bcr-abl proteína de fusão que é característica de leucemias positivas para o cromossomo Filadélfia (leucemia mielóide crônica e ocasionalmente leucemia linfocítica aguda). O imatinibe é substancialmente diferente dos medicamentos anteriores para o câncer, já que a maioria dos agentes da quimioterapia simplesmente tem como alvo as células que se dividem rapidamente, não diferenciando entre as células cancerosas e outros tecidos. [48]

    Exemplos adicionais incluem:

    • Muitos dos antipsicóticos atípicos, o H prototípico2- antagonista do receptor a partir do qual os membros posteriores da classe foram desenvolvidos
    • Inibidor seletivo de COX-2 AINEs, um inibidor de entrada de HIV de peptídeo como zolpidem e zopiclona, ​​um inibidor de integrase de HIV [49] (inibidores seletivos de recaptação de serotonina), uma classe de antidepressivos, um medicamento antiviral

    Tem-se argumentado que a natureza altamente rígida e focada do design racional de medicamentos suprime o acaso na descoberta de medicamentos. [50]


    Controvérsias sobre clonagem de animais domésticos

    As preocupações éticas sobre a clonagem podem ser amplamente divididas em duas categorias: preocupação com o efeito da clonagem no bem-estar animal e humano e objeção ao princípio da clonagem, isto é, produzir um animal por outro meio que não a fertilização.

    Atualmente, a clonagem está associada a um aumento no sofrimento animal quando comparada à produção de animais por métodos de criação convencionais. Isso se deve a cirurgias realizadas para obtenção de ovócitos ou transferência de embriões, perda de gestação, doença e morte de recém-nascidos, anormalidades de baixo nível na sobrevivência dos filhotes e possível sofrimento por doenças em animais produzidos como modelos de doenças. Essas preocupações são um tanto atenuadas pelo fato de que a maioria dessas descobertas não são exclusivas da clonagem, mas também estão associadas a outros procedimentos geralmente aceitos como valiosos, como fertilização in vitro e produção de embriões, transferência de oócitos e transferência de embriões. Além disso, o destino normal aceito de muitas espécies que estão sendo clonadas é serem alojadas para produção máxima e então serem abatidas e comidas. Um argumento convincente para a clonagem é que os benefícios potenciais do procedimento para a compreensão dos processos vitais e das doenças animais, para a saúde humana e para a produção de alimentos superam o custo do procedimento em termos de bem-estar animal.

    Outras preocupações residem no efeito da clonagem em toda a população animal, mais comumente relacionada à variação genética da espécie. Esta é uma preocupação legítima em algumas espécies e para alguns usos, como no gado leiteiro, no qual um touro pode gerar milhares de crias. No entanto, isso está mais relacionado à tecnologia de congelamento e distribuição de sêmen do que ao fato de um touro em si ter sido clonado. Em animais de companhia, é improvável que os poucos animais de estimação que provavelmente serão clonados afetem a população em geral. Em cavalos, a clonagem pode de fato aumentar a variação genética, porque um dos principais usos propostos é clonar capões que foram considerados competidores superiores, resgatando assim tipos genéticos que de outra forma seriam perdidos.

    As preocupações com a saúde humana concentram-se principalmente no consumo de alimentos produzidos a partir de animais clonados. Após anos de estudo, o FDA e a Autoridade Europeia para a Segurança dos Alimentos concluíram que o consumo de carne ou leite de animais clonados não apresenta risco à saúde pública. Portanto, as preocupações remanescentes sobre o consumo de alimentos de animais clonados provavelmente se baseiam mais em princípios do que no potencial real de danos. Como a clonagem é usada para produzir animais transgênicos ou editados por genes, muitas preocupações percebidas em relação à clonagem são, na verdade, preocupações com esses animais geneticamente alterados, que apresentam um conjunto completamente diferente de riscos potenciais à saúde humana e animal e ao meio ambiente. Na UE, embora seja reconhecida a falta de evidências de um risco para a saúde humana, a comercialização de alimentos provenientes de clones requer autorização. Há apelos para que as regras da UE proíbam a clonagem para fins agrícolas e proíba a comercialização de alimentos provenientes de clones.

    Uma questão ética fundamental em relação ao princípio da produção de animais por clonagem é se essa técnica viola alguma proibição moral, ou seja, que as pessoas estão “brincando de Deus” ao produzir embriões sem usar fertilização. Questões semelhantes surgiram com cada nova técnica reprodutiva desenvolvida; entretanto, muitas pessoas acham que a clonagem é um caso especial. Essa aversão moral geral do público ao conceito de clonagem é reforçada pelo retrato da clonagem como uma força malévola em livros e filmes de ficção científica.

    Contra-argumentos a essas preocupações morais são que a clonagem ocorre na natureza na forma de gêmeos idênticos que as pessoas vêm produzindo plantas e animais por meios "não naturais" desde a primeira vez que plantaram uma semente em uma nova área ou cruzaram uma vaca com um touro selecionado, e que este é simplesmente um novo desenvolvimento na mesma linha. A clonagem embrionária estava sendo realizada por mais de 10 anos antes do nascimento de Dolly, essencialmente sem atenção pública, e mesmo o nascimento de dois cordeiros clonados de células cultivadas de origem embrionária, anunciado um ano antes de Dolly, não teve impacto público. Assim, parece que a principal questão moral de interesse público não é a produção de embriões sem fertilização, mas a produção de embriões a partir de células de um animal existente conhecido.

    Os argumentos contra a clonagem de animais de companhia se concentraram no custo de produção de um clone - dezenas a centenas de milhares de dólares - quando milhões de cães e gatos indesejados são mortos a cada ano. No entanto, as pessoas atualmente compram cães e gatos de raça pura por milhares de dólares, quando podiam obter animais por nenhum custo ou por um custo baixo. A cultura americana apóia o conceito de que as pessoas podem gastar seu próprio dinheiro no que quiserem.

    Um argumento relacionado é que a clonagem torna os animais uma mercadoria ou um objeto, ao invés de um ser senciente, e que produzir um animal dessa forma mostra uma falta de respeito pelo animal como indivíduo. No entanto, os animais foram comprados e vendidos desde que foram domesticados, atualmente o sêmen e os embriões são congelados, enviados para todo o país e usados ​​para produzir os jovens desejados. A clonagem não parece oferecer nenhuma distinção única nesta área.

    A comercialização da clonagem traz consigo a possibilidade de fraude e de predar as emoções dos donos de animais enlutados. As empresas de clonagem devem deixar claro que a técnica produzirá outro indivíduo com a mesma genética do animal original; ela não “ressuscita” um animal ou cria um animal idêntico ao doador (por exemplo, com o mesmo padrão de pelagem ou personalidade). A melhor comparação a ser feita é a de um gêmeo idêntico nascido mais tarde, da mesma forma que os gêmeos idênticos que ocorrem naturalmente, eles serão muito semelhantes, mas também diferentes em muitos aspectos.


    Debate sobre a extinção: as espécies extintas devem ser revividas?

    Mamutes peludos prosperaram durante a última era do gelo, até que o rápido aquecimento planetário - que as evidências mais recentes sugerem que ocorreu após a queda de um meteoro - os matou há milhares de anos. (Imagem: Mauricio Anton, PLOS Biology)

    No mês passado, centenas de especialistas que estudam as interações entre humanos e ambientais pediram aos formuladores de políticas que tomassem medidas imediatas para conter a humanidade e formas ecologicamente destrutivas. Tendências aceleradas de extinção causada pelo homem, perda de ecossistema, mudança climática, poluição e consumo, os cientistas escreveram em uma declaração de consenso, & ldquo estão ameaçando os sistemas de suporte de vida dos quais todos dependemos. & Rdquo

    Se as taxas atuais de extinção continuarem, avisa o comunicado, poderemos ver a perda de 75% das espécies de vertebrados em três séculos.

    Enquanto os cientistas conservacionistas lutam para conter a perda catastrófica de biodiversidade, alguns biólogos sintéticos estão trabalhando para trazer espécies extintas de volta à vida. Você pode pensar que os dois grupos estariam trabalhando juntos. Mas, até recentemente, a maioria dos biólogos conservacionistas sabia pouco sobre o chamado movimento "Revive and Restore", que até a conferência TEDxDeExtinction em março, vinha se reunindo em grande parte a portas fechadas.

    Após uma reunião privada de pioneiros da & ldquode-extinction & rdquo na Harvard Medical School em fevereiro passado, a National Geographic Society e a San Francisco & rsquos Long Now Foundation reuniram biólogos moleculares e biólogos conservacionistas em outubro para discutir estratégias para ressuscitar espécies extintas. Os organizadores admitiram apenas um jornalista para a reunião de outubro e orquestraram a cobertura da mídia sobre a extinção com a conferência TEDx e uma reportagem de capa da National Geographic algumas semanas depois.

    O Projeto Revive and Restore é uma ideia do cofundador da Long Now Foundation, Stewart Brand, e de sua esposa Ryan Phelan, uma empreendedora em série que mais recentemente vendeu seu negócio de testes genéticos ao consumidor, DNA Direct para a empresa Fortune 500, Medco. Seus principais candidatos à extinção incluem o pombo-passageiro e o mamute-lanudo. Brand e Phelan promovem o projeto como uma forma de restaurar a diversidade genética perdida com sua missão de garantir o & ldquodeep enriquecimento ecológico por meio do renascimento de espécies extintas. & Rdquo

    Mas alguns que trabalham na linha de frente da conservação da biodiversidade estão céticos. Em um comentário publicado em abril, os principais cientistas conservacionistas observaram que poucos de seus colegas haviam considerado os efeitos potenciais da biologia sintética na conservação, mesmo que ela pudesse se transformar em quotransformação. as perspectivas de manutenção da biodiversidade. & rdquo Os autores delinearam várias maneiras pelas quais organismos extintos recriados poderiam afetar os objetivos estratégicos da biodiversidade - alguns positivos, muitos negativos. O que eles queriam dizer era que ninguém sabe, mas é melhor os biólogos conservacionistas começarem a prestar atenção (veja o gráfico abaixo).

    Exemplos de como a biologia sintética, prometida ou desenvolvida em escalas até modestas, pode afetar significativamente as Metas de Biodiversidade de AichiExemplos de como a biologia sintética, prometida ou desenvolvida em escalas até modestas, pode afetar significativamente as Metas de Biodiversidade de Aichi, adotadas pela Conferência de 2010 da Convenção sobre Biodiversidade das Partes. Clique na imagem para ver uma versão maior. (PLOS Biology, Redford et al.)

    Hank Greely, diretor da Stanford University & rsquos Center for Law and the Biosciences, admite uma fascinação de longa data com a perspectiva de reviver espécies extintas, mas não conseguia decidir se era realmente uma boa ideia. Por isso, ele organizou uma conferência em Stanford na semana passada e convidou filósofos, advogados, biólogos e profissionais da vida selvagem para pensar sobre as complexas questões éticas, jurídicas e políticas que a de extinção levanta.

    & ldquoAcho que um dos motivos pelos quais esse problema veio à tona tão rapidamente é que a tecnologia está convergindo com a frieza da ideia de trazer as coisas de volta, misturada com um sentimento de culpa que sentimos por levar as coisas à extinção, & rdquo Lei da Universidade de Kansas o professor Andrew Torrance me contou. Mas a extinção levanta vários “enigmas quodefinicionais”, disse ele nesta palestra. Os organismos extintos são OGM? Espécies invasivas?

    E onde uma espécie ressuscitada se encaixaria na legislação ambiental? O co-organizador da conferência Alex Camacho, diretor do UC Irvine & rsquos Law Center for Land, Environment and Natural Resources, disse que a Lei de Espécies Ameaçadas não tem estrutura para a extinção, uma vez que seus criadores não poderiam ter imaginado a perspectiva. Logo após o renascimento de um organismo, uma espécie poderia potencialmente ser listada como ameaçada de extinção, mas é a mesma espécie? Uma nova espécie? Uma espécie em extinção? A ESA define ameaçado de extinção como & ldquoin perigo de extinção em toda ou uma parte significativa de seu alcance. & Rdquo Mas qual é o seu alcance? Tem um alcance? Provavelmente não, se você tiver um organismo sentado em um laboratório, Camacho disse.

    Chuck Bonham, que dirige a agência estadual do Departamento de Pesca e Vida Selvagem, mas não estava representando a agência na conferência, lutou com as implicações de gerenciamento da extinção. & ldquoComo você pode ser extinto se estiver sempre disponível para o avivamento? & rdquo

    Tecnologia de extinção

    As tecnologias para recriar espécies extintas incluem reprodução, clonagem e engenharia genética. Embora todos tenham potencial para realizar a tarefa, disse Beth Shapiro, bióloga evolucionista e especialista em DNA antigo da Universidade da Califórnia em Santa Cruz, eles também têm desvantagens.

    Com a reprodução, os cientistas identificam características no parente vivo mais próximo e seletivamente reproduzem descendentes expressando características desejadas até que os animais se assemelhem a seus primos extintos. O sequenciamento de fragmentos de osso e dente de espécies extintas acelera o trabalho de localização de sequências genômicas semelhantes em descendentes intimamente relacionados. Cientistas da Holanda estão usando essa abordagem para recriar o auroque, gado selvagem europeu gigante que foi extinto em 1627, do gado doméstico. O gado tem um tempo de geração de três a seis anos. Tentar reviver mamutes de elefantes cada vez maiores e mais peludos, que começam a se reproduzir em média entre 20 e 25 anos, pode levar séculos.

    Mais problemática é a clonagem, em que os cientistas removem o núcleo de um óvulo, substituem-no pelo núcleo de uma célula doadora, ajustam-no para crescer como um embrião e o implantam em uma mãe substituta. O processo é altamente tenso. Dolly, a famosa ovelha clonada, foi a única ovelha nascida em 277 tentativas e mdashall os outros clones morreram no útero ou logo após o nascimento. No que & rsquos considerou a primeira extinção bem-sucedida usando este método, um íbex dos Pirenéus (uma grande cabra selvagem que foi extinta há menos de 15 anos) carregado por um cabrito híbrido, viveu 12 minutos, e todos em dificuldade respiratória aguda .

    Se os pesquisadores tentarem fazer isso com elefantes como substitutos, é provável que a mãe-elefante muito menor não se sairia bem carregando um mamute até o fim. * Isso não explica a ética de transformar tais animais sociais altamente inteligentes, que parecem lamentar a morte de seus parentes, em máquinas de ressurreição gigantesca.

    Um espécime do pombo-passageiro, (Ectopistes migratorius), no Zoológico e Jardim Botânico de Cincinnati. Os pombos-passageiros já chegaram a bilhões. A caça excessiva e a perda de habitat levaram a um declínio catastrófico em 20 anos e à extinção em 1914.

    Ambos os métodos, no entanto, requerem genomas intactos, o que significa que você deve congelar as linhas celulares retiradas das espécies antes que sejam extintas. & ldquoSe pretendemos desextinguir algo que é mais antigo do que algo que matamos recentemente, ficamos com o DNA antigo & rdquo, disse Shapiro. E isso significa lidar com pequenos fragmentos de DNA que muitas vezes estão contaminados com bactérias e outros contaminantes.

    Isso deixa a edição do genoma, encontrando as sequências que codificam as características de interesse e colando-as em um genoma existente. Mas os pesquisadores ainda estão refinando métodos para encontrar o lugar certo no genoma e entregar o DNA sem criar problemas como o câncer. Um problema ainda maior é descobrir quais partes do genoma tornam um mamute lanoso, a vaca do mar tão grande ou pombos passageiros se aglomeram, disse Shapiro. Mesmo se você pudesse reconstruir o genoma de uma espécie extinta, o salto para atribuir funções às sequências é enorme.

    Considerando todas essas questões, Shapiro disse: & ldquoAcho que devemos considerar profundamente porque queremos extinção de coisas. & rdquo

    E isso, para muitos que trabalham para conservar a biodiversidade, é a questão principal. "Os biólogos da preservação se preocupam com o fato de que, se as pessoas pensam que podemos reviver as espécies, elas se preocupam em proteger o que restou", disse Kate Jones, presidente conjunta de ecologia e biodiversidade da University of College London e da Zoological Society of London.

    Jones, que passou a maior parte de sua carreira pensando sobre o que faz as espécies se extinguirem, me disse que entende o apelo da desextinção. & ldquoQuem não ficaria animado com a perspectiva de ver um mamute? & rdquo ela permitiu. & ldquoMas os aspectos práticos de fazer isso são na verdade bastante assustadores. & rdquo E como estratégia de conservação, & ldquoit & rsquos é um pouco inútil. É fantasiado de conservação, mas não. & Rdquo

    Para Jones, isso não é uma questão de desextinção. & ldquoIt & rsquos sobre a criação de novas espécies. Eles & rsquore apenas OGMs espalhafatosos. & Rdquo

    Alguns biólogos conservacionistas experientes recusam-se a abordar o assunto porque acham que não é um debate legítimo, disse-me Jones. & ldquoMas acho que é meio inevitável que isso aconteça, seja Stewart Brand ou alguém em seu quintal. & rdquo

    Então, surge a questão do que fazer com uma espécie que você reviveu. Jamie Rappaport Clark, que atuou como chefe da US Fish and Wildlife sob a administração Clinton e agora lidera os Defenders of Wildlife, pediu aos defensores da extinção que considerem a política de reviver espécies. A extinção poderia justificar uma ação paralisante na restauração do habitat ou no salvamento de espécies, por exemplo. Isso teria condenado a pantera da Flórida, que recebeu um influxo de genes de pumas do Texas transportados por via aérea sob sua supervisão em um movimento desesperado para salvar o grande felino.

    She & rsquos também temia que a extinção fornecesse cobertura política para o esvaziamento da conservação. & ldquoEles & rsquoll dizem: & lsquoNão deveríamos & rsquot estar financiando a recuperação e prevenindo a extinção de espécies porque temos uma saída. & rsquo

    Pilha de crânios de bisões americanos esperando para serem triturados para fertilizantes, por volta de 1870. (Coleção histórica de Burton / Biblioteca Pública de Detroit / Domínio público)

    Durante uma mesa redonda, Brand levantou a perspectiva de trazer de volta o felino dente-de-sabre para a Califórnia para substituir os papéis ecológicos perdidos dos predadores, ponto em que Bonham saltou de sua cadeira, brincando, & ldquoI & rsquom fora daqui! & Rdquo

    Ele recuperou um pedaço de papel de sua pasta e voltou para contar a Brand uma história sobre o relacionamento difícil do público com predadores. & ldquoNós matamos o último lobo na Califórnia há cerca de 100 anos & rdquo Bonham disse. & ldquoUm mês depois de eu começar a trabalhar, recebemos nosso primeiro lobo de volta à Califórnia em 100 anos. & rdquo Metade do estado quer que ele crie uma reserva de lobos. A outra metade quer ver a história repetida. "Não estamos prontos", disse ele.

    Bonham leu uma passagem do plano de recuperação do urso pardo Fish and Wildlife de 1982. & ldquoEste é um animal que não pode comprometer ou ajustar seu modo de vida ao nosso. Não poderia por sua própria natureza, não poderia mesmo se nós permitíssemos a oportunidade, o que não fizemos. & Rdquo O único lugar para o urso pardo na Califórnia permanece na bandeira do estado. & ldquoComo no mundo você espera que um dente de sabre se saia melhor do que. o urso pardo? ”ele perguntou a Brand.

    Jones perguntou a Brand se alguma das preocupações levantadas pelos participantes da conferência sobre a desextinção alterou sua visão. "Ainda não", respondeu ele. "Isso me deixa mais determinado. Que tenhamos certeza de que todos entendam que a extinção e a conservação não são competitivas de forma alguma." Ele disse que agora há uma geração de crianças que querem ver mamutes peludos em um zoológico. "Quando o fizerem, acho que eles adotarão uma relação não trágica com a natureza e a conservação, com a sensação de que os humanos podem. Desfazer até mesmo danos sérios como a extinção."

    Elizabeth Hadly, uma paleontóloga de Stanford e Presidente de Biologia Ambiental Paul S. e Billie Achilles, ajudou a elaborar o recente apelo à ação para os formuladores de políticas. Ela acha que a inovação de laboratório, em vez da pesquisa no local, está por trás do impulso para a desextinção. O financiamento para ecologia e conservação empalidece em comparação com as grandes doações que financiam a genômica e a biologia sintética. Embora ela estivesse em Stanford, Hadly não compareceu à conferência. Dói pensar no que aquele dinheiro poderia fazer para proteger a espécie que já está aqui - alguns por um fio.

    Da mesma forma que matamos elefantes agora, não teremos mais nada em 10 ou 20 anos, disse ela. & ldquoE as pessoas estão falando sobre mamutes? Em primeiro lugar, eles estavam vivos na era do gelo. Este é o ambiente completamente errado para trazê-los de volta. & Rdquo

    Ela chama a desextinção de & ldquogee-whiz science em seu pior & rdquo e pensa que justificá-la em termos de diversidade genética e serviços ecossistêmicos não faz sentido.

    "Gastar dinheiro para reintroduzir espécies existentes recentemente perdidas & mdasheven California & rsquos grizzly bear & mdashand restaurar o habitat é um uso muito melhor de nosso tempo e energia", disse ela. "Sem a restauração do habitat", acrescentou ela, "os 750 gorilas das montanhas que sobraram no planeta não sobreviverão. Eu prefiro combinar as subespécies de tigre para criar um reservatório genético melhor do que trazer de volta algum organismo extinto. & Rdquo

    Clark, que passou sua carreira trabalhando com espécies à beira da extinção, ofereceu uma visão semelhante. & ldquoA verdadeira questão, & rdquo ela me disse, & ldquois por que gastaríamos toda essa energia e esforço para trazer de volta animais antigos, mas deixar tantos outros simplesmente desaparecer? & rdquo

    Ela tem passado muito tempo pensando sobre nossa obrigação moral para com as gerações futuras. & ldquoÉ para criar um casal de mamutes lanosos tristes que vivem em um zoológico? Ou é para salvar os lobos e a pantera e as areias de Delhi, moscas amantes das flores e os pesqueiros? & Rdquo

    Para Clark, não há dúvida. & ldquoNós precisamos fazer um trabalho melhor de administrar o que temos ", disse ela," antes de sairmos correndo atrás de experimentos científicos interessantes. & rdquo


    Qual é a lógica por trás do congelamento de óvulos se as células podem ser clonadas? - Biologia

    Copyright e cópia 1995 Lee M. Silver

    6. Mutagênese e transgênese

    6.1 Mutagênese clássica

    6.1.1 O teste de locus específico

    6.1.3 Recursos de rato mutante

    6.2 Manipulação de embriões: considerações genéticas

    6.2.1 Possibilidades experimentais

    6.2.2 Escolha de cepas para produção de ovos

    6.2.3 Otimizando a produção de embriões por superovulação

    6.2.4 O garanhão fértil

    6.2.5 Transferência de embriões para mães adotivas

    6.3 Camundongos transgênicos formados por injeção nuclear

    6.3.2 Rastreamento do transgene e detecção de homozigotos

    6.4 Mutagênese direcionada e substituição de genes

    6.4.2 Criação de & # 145 nocautes de gene & # 146

    6.4.3 Criação de mudanças sutis

    6.5 Outros usos de tecnologias transgênicas

    6.5.1 Mutagênese de inserção e captura de genes

    6.5.2 Um banco de dados e um repositório de ratos geneticamente modificados

    6.1 Mutagênese clássica

    6.1.1 O teste de locus específico

    Variação genética & # 151 a existência de pelo menos duas formas & # 151 é o ingrediente essencial presente em todos os experimentos genéticos. A variação fenotípica, em particular, é usada como um meio para descobrir a função normal de um alelo de tipo selvagem em muitos loci. Conforme discutido no primeiro capítulo deste livro, foi a disponibilidade de muitos fenótipos variantes no comércio extravagante de camundongos que tornou o camundongo doméstico um organismo ideal para estudos dos primeiros geneticistas. Em certo sentido, porém, o camundongo doméstico venceu por padrão porque, na ausência de domesticação e seleção artificial, a variação nas características visíveis a olho nu é extremamente rara e, portanto, outros pequenos mamíferos eram geneticamente intratáveis. Embora as variantes extravagantes de camundongos fornecessem material para uma série de estudos genéticos iniciais, o número de variantes diferentes ainda era limitado, e a taxa em que novas surgiam espontaneamente em colônias experimentais era excessivamente baixa: agora se sabe que, em média, apenas um gameta em 100.000 provavelmente carrega uma mutação detectável em um determinado locus.

    Durante a década de 1920, vários pesquisadores começaram a investigar os efeitos dos raios X na reprodução e no desenvolvimento. Em dois laboratórios, pelo menos, novos alelos mutantes foram recuperados na prole de pais irradiados, mas os pesquisadores não conseguiram fazer qualquer conexão entre a irradiação e a indução dessas mutações (Little e Bagg, 1924 Dobrovolskaia-Zavadskaia, 1927). A conexão foi finalmente feita por Muller que, em 1927, publicou seu artigo clássico explicando a indução de mutações hereditárias por raios-X (Muller, 1927). Desde aquela época, os geneticistas que estudam todos os principais organismos experimentais & # 151 de bactérias a camundongos & # 151 têm usado irradiação ionizante e vários produtos químicos como agentes de mutagênese para descobrir novos alelos como ferramentas para compreender a função do gene.

    Experimentos de mutagênese em camundongos em grande escala foram iniciados em dois laboratórios governamentais de "energia atômica": o Oak Ridge National Laboratory em Oak Ridge, Tennessee, nos EUA e a MRC Radiobiological Research Unit, primeiro em Edimburgo, Escócia, e depois em Harwell, Inglaterra , no Reino Unido Ambos os programas experimentais foram iniciados inicialmente após a Segunda Guerra Mundial como um meio de quantificar os efeitos de várias formas de radiação em ratos e, por extrapolação, em humanos, para melhor compreender as consequências da detonação de armas nucleares. O esforço dos EUA foi dirigido por W. L. Russell e o esforço britânico foi dirigido por T. C. Carter (Green e Roderick, 1966). Os cientistas de ambos os laboratórios rapidamente perceberam o potencial de seu recurso recém-criado de animais mutantes, e os dois laboratórios passaram a gerar mutações por agentes químicos também. Os estudos em grande escala conduzidos em Oak Ridge e Harwell & # 151, onde 10.000 a 60.000 animais de primeira geração foram normalmente analisados ​​em um protocolo experimental & # 151, forneceram a maioria dos dados empíricos atualmente disponíveis sobre os mecanismos e taxas em que as mutações são causada por todos os agentes mutagênicos bem caracterizados no camundongo.

    Os experimentos realizados por Russell e Carter, e outros colegas que seguiram seus passos, foram projetados para obter valores discretos para o potencial mutagênico de diferentes protocolos de radiação. Em vez de tentar examinar todos os animais para todos os efeitos de um protocolo de irradiação particular (como era comum em experimentos anteriores), esses geneticistas de camundongos escolheram olhar apenas para a pequena fração de animais que sofreram mutação em um pequeno conjunto de animais loci. A justificativa para o & teste de locus específico da cota foi que os efeitos em loci individuais poderiam ser mais facilmente quantificados e que os resultados limitados obtidos ainda poderiam ser extrapolados para uma estimativa dos efeitos do genoma completo. Russell decidiu que as taxas de mutação deveriam ser seguidas simultaneamente em um número suficiente de loci para distinguir e evitar problemas que poderiam ser causados ​​por variações locus a locus na sensibilidade a mutagênicos específicos. Ele decidiu ainda que o mesmo conjunto de loci deveria ser examinado em cada experimento realizado. Os sete loci escolhidos para serem seguidos no teste de locus específico foram definidos por mutações recessivas com fenótipos homozigóticos visíveis que foram facilmente distinguidos isoladamente uns dos outros e não tiveram efeito sobre a viabilidade ou fertilidade. Os sete loci são cutias (uma é o alelo recessivo não agouti), marrom (b), albino (c), diluir (d), orelha curta (se), diluição de olhos-de-rosa (p), e malhado (s) Foi construída uma "cepa de marcador" especial que era homozigótica para todos os sete loci.

    Em sua forma mais simples, o teste de locus específico é realizado através do acasalamento de fêmeas da cepa marcadora especial com machos completamente selvagens que foram previamente expostos a um potencial mutagênico. Na ausência de quaisquer mutações, a descendência deste cruzamento não expressará nenhum dos sete fenótipos visíveis na cepa mãe do marcador. No entanto, se o mutagênico induziu uma mutação em um dos loci específicos, o fenótipo mutante associado será descoberto. Este teste é muito eficiente porque requer apenas uma única geração de reprodução e o exame visual é tudo o que é necessário para pontuar cada animal.

    Embora mutações recessivas em todos os loci diferentes dos sete específicos não sejam detectadas na prole de primeira geração deste cruzamento, é possível detectar uma mutação dominante em qualquer locus, desde que seja viável e produza uma alteração grosseira no fenótipo heterozigoto, como uma mudança na cor do esqueleto ou da pelagem. Deve-se perceber que o efeito mais comum de qualquer mutagênico não direcionado será o de "desmontar" um gene e, na grande maioria dos casos, o alelo nulo resultante será recessivo para o tipo selvagem. Há, no entanto, uma classe muito pequena de loci nos quais alelos nulos agirão de forma dominante ou semidominante para o tipo selvagem. Estes fenótipos "hetero-insuficientes" são provavelmente causados ​​por uma sensibilidade de desenvolvimento à dosagem do produto génico. Entre as mais bem caracterizadas das mutações nulas dominantes estão as numerosas descobertas no T locus & # 151 que resulta em uma cauda curta & # 151 e o C locus & # 151 que resulta em manchas brancas na pelagem.

    As mutações podem ser induzidas por meios físicos e químicos. O meio físico é através da exposição de todo o animal à radiação ionizante de uma das três classes & # 151, raios X, raios gama ou nêutrons (Green e Roderick, 1966). O meio químico é injetar um reagente mutagênico no animal de modo que ele passe diretamente para as gônadas e para as células germinativas em diferenciação. O teste de locus específico forneceu uma estimativa da eficiência relativa com a qual cada reagente induz mutações. Sob diferentes protocolos de exposição, a irradiação X induziu mutações a uma taxa de 13 & # 15150 x 10 -5 por locus, o que é um aumento de 20 a 100 vezes em relação à frequência espontânea, mas ainda não alto o suficiente para ser usado por qualquer um, exceto as maiores instalações como meio de rotina para a criação de mutações (Rinchik, 1991). As mutações criadas pela irradiação são frequentemente grandes deleções ou outras lesões graves, como translocações ou rearranjos complexos.

    A classe de agentes químicos conhecidos que podem induzir mutações (conhecidas como mutagênicos) é muito grande e se expande o tempo todo. No entanto, dois produtos químicos em particular & # 151 etilnitrosoureia (ENU) e clorambucil (CHL) & # 151 foram considerados extremamente mutagênicos em células espermatogênicas de camundongo (Russell et al., 1979 Russell et al., 1989). Ambos os produtos químicos produzem rendimentos muito mais elevados de mutações do que qualquer forma de tratamento de radiação testada até agora (Russell et al., 1989). Doses ótimas de ENU ou CHL podem induzir mutações a uma frequência média por locus que é maior do que um em mil & # 151 150 x 10 -5 com ENU e 127 x 10 -5 por locus com CHL (Russell et al., 1982 Russell et al., 1989). Embora as taxas nas quais ENU e CHL induzam mutações sejam muito semelhantes, os tipos de mutações induzidas são bastante diferentes. Em geral, ENU causa lesões discretas que são frequentemente mutações pontuais (Popp et al., 1983), enquanto CHL causa lesões grandes que são frequentemente deleções multilocais (Rinchik et al., 1990a). Originalmente, pensava-se que a base para as diferenças mutacionais desse tipo era a natureza química do próprio mutagênico (Green e Roderick, 1966), mas isso não parece mais ser o caso. Em vez disso, agora parece que o estágio da célula germinativa em que a mutação surge é o principal determinante do tipo de lesão (Russell, 1990). A correlação observada entre a substância química e o tipo de lesão decorre do fato de que diferentes mutagênicos estão ativos em diferentes estágios da espermatogênese. Assim, ENU atua sobre espermatogônias pré-meióticas onde as mutações são provavelmente do tipo discreto, e CHL atua sobre espermátides redondas pós-meióticas onde as mutações são provavelmente do tipo de lesão grande (Russell et al., 1990).

    ENU foi o primeiro produto químico a ser identificado que era suficientemente mutagênico para ser usado por laboratórios menores em triagens de mutações em loci específicos ou regiões cromossômicas de interesse (Bode, 1984 Shedlovsky et al., 1988). ENU também tem sido usado em rastreios de variantes fenotípicas não específicas do locus que podem servir como modelos para várias doenças humanas (McDonald et al., 1990). Vários laboratórios estão começando a usar ENU para mutagênese de saturação de pequenas regiões cromossômicas definidas por deleções como uma ferramenta (entre várias outras complementares) para obter uma descrição física e genética completa de tal região (Shedlovsky et al., 1988 Rinchik et al., 1990b Rinchik, 1991). A justificativa para esses estudos é a crença de que muitos (embora não todos) genes podem ser descobertos fenotipicamente por mutações nocaute que são criadas para serem duplamente heterozigotas com uma deleção. A principal limitação do uso global desta abordagem é o número muito pequeno de regiões genômicas no camundongo em que grandes deleções foram caracterizadas.

    A disponibilidade para Drosófila geneticistas de deleções (ou deficiências como os povos da mosca os chamam) que abrangem quase todos os segmentos do genoma da mosca tem desempenhado um papel crítico na identificação e caracterização de um grande número de genes e na produção de mapas funcionais brutos e mapas de mutação de ponto de estrutura fina pela própria abordagem apenas descrito acima. Claramente, um método para acumular uma biblioteca semelhante de deleções para o mouse seria bem recebido. As mutações induzidas por raios X são frequentemente alterações genômicas em grande escala, incluindo translocações, inversões e deleções. Na verdade, a maioria das mutações de deleção de camundongos mantidas em estoques contemporâneos foram derivadas desta maneira. No entanto, o rendimento geral de deleções induzidas por raios-X é bastante baixo e, devido a outros problemas inerentes a esta abordagem, não é ideal para uso global.

    Em 1989, o clorambucil foi relatado como uma alternativa atraente aos raios X como um agente para a indução de alto rendimento de mutações de deleção no camundongo (Russell et al., 1989). A taxa de mutação por locus foi encontrada na ordem de um em 700 em células germinativas da classe das espermátides iniciais, e das oito mutações induzidas nesta fase que foram analisadas, todas foram deletadas para sequências de DNA em torno do marcador de locus específico ( Rinchik et al., 1990a). Este estudo também mostrou que as mutações induzidas por CHL estavam frequentemente associadas a translocações recíprocas. Este último achado é lamentável porque as translocações podem reduzir a fertilidade com conseqüentes efeitos negativos na propagação da cepa.

    Há esperança de que o CHL possa ser usado como um meio para gerar conjuntos de deleções sobrepostas que abrangem cromossomos inteiros (Rinchik e Russell, 1990). Projetos desse tipo exigirão grandes instalações para animais e recursos de apoio e, conseqüentemente, ficarão confinados a apenas um punhado de laboratórios. No entanto, uma vez que as linhagens de camundongos com exclusões foram criadas e caracterizadas, elas podem servir como um recurso para toda a comunidade.

    6.1.3 Recursos de rato mutante

    Uma vantagem de usar o mouse como sistema genético é o forte senso de comunidade que envolve a maioria dos trabalhadores no campo, e é no contexto dessa comunidade que as cepas que carregam muitas mutações diferentes & # 151 tanto espontâneas quanto induzidas por mutagênios & # 151 foram catalogados e preservados e estão disponíveis para todos os investigadores. Um catálogo contendo descrições detalhadas de todas as mutações de camundongos caracterizadas a partir de 1989 foi compilado por Margaret Green e está incluído como o capítulo central do Variantes e cepas genéticas do camundongo de laboratório editado por Mary Lyon e Tony Searle (Green, 1989). Este catálogo agora está disponível em formato eletrônico que é atualizado regularmente (consulte o Apêndice B). Claro, muitos mais animais mutantes são encontrados e caracterizados com o passar de cada ano, e uma lista atualizada é publicada anualmente no jornal Genoma do Rato. Esta lista contém informações sobre os investigadores individuais com os quais se deve entrar em contato para realmente obter os ratos mutantes.

    A maior coleção de cepas de camundongos mutantes é mantida no Laboratório Jackson sob os auspícios do & quotMouse Mutant Resource & quot (MMR), que atualmente é mantida sob a direção do Dr. Muriel Davisson (Davisson, 1990). Em 1990, mais de 250 genes mutantes foram mantidos neste recurso, respondendo por dois terços de todos os mutantes de camundongos conhecidos vivos na época (Davisson, 1990). A cada ano, os cuidadores de animais identificam 75 a 80 animais "desviantes" adicionais entre os dois milhões de camundongos produzidos pelas colônias de recursos animais do Jackson Laboratory & # 146s (Davisson, 1993). Aproximadamente 75% dos fenótipos desviantes têm uma base genética e estudos de reprodução são conduzidos para determinar se eles representam ou não mutações em loci previamente caracterizados. Se o fizerem, as amostras de DNA são recuperadas e as linhas são descartadas ou colocadas no Repositório de Embriões Congelados. Se uma mutação é nova, seu modo de transmissão (autossômico / ligado ao X, dominante / recessivo) é determinado, o efeito fenotípico da mutação é caracterizado e é mapeado para uma localização cromossômica específica com o uso de protocolos de reprodução para ser descrito na seção 9.4 (Davisson, 1990 Davisson, 1993). As descrições de todas as mutações recentemente caracterizadas são publicadas e as cepas de camundongos mutantes são disponibilizadas para compra por meio do catálogo padrão do Jackson Laboratory. Em 1992, mais de 35.000 ratos do MMR foram distribuídos a investigadores em todo o mundo (Davisson, 1993).

    As limitações de espaço tornam impossível para o MMR manter estoques de reprodução de camundongos que contêm todos os genes mutantes conhecidos, com o número total se expandindo a cada ano. Felizmente, os estoques mutantes que atualmente não são solicitados pelos pesquisadores podem ser mantidos (a um custo mínimo) na forma de embriões congelados. A importância do congelamento de embriões como protocolo de armazenamento não pode ser subestimada. Repetidamente, os pesquisadores moleculares modernos voltaram a usar mutações descritas há muito tempo como ferramentas críticas na análise de loci humanos e de camundongos recém-clonados.

    6.2 Manipulação de embriões: considerações genéticas

    6.2.1 Possibilidades experimentais

    A tecnologia básica necessária para obter embriões pré-implantação do trato reprodutivo feminino, para cultivá-los por curtos períodos de tempo em placas de Petri e, em seguida, colocá-los de volta em mães adotivas onde podem crescer e se desenvolver em camundongos viáveis ​​está disponível desde 1950 (Hogan et al., 1994). Nos anos seguintes, essa tecnologia básica foi usada em uma série de diferentes tipos de experimentos destinados a manipular o processo de desenvolvimento ou o próprio genoma embrionário. Os embriões podem ser dissolvidos em células individuais que podem ser recombinados em novas combinações para iniciar o desenvolvimento de camundongos quiméricos. Os pronúcleos e núcleos podem ser trocados de um embrião inicial para outro para examinar as contribuições relativas do citoplasma e do genoma para determinados fenótipos, bem como para investigar aspectos de impressão genômica e partenogênese. O DNA estranho pode ser injetado diretamente nos pronúcleos para integração estável nos cromossomos, o que pode levar à formação de animais transgênicos. Finalmente, as células embrionárias podem ser convertidas em células de cultura de tecidos (chamadas células-tronco embrionárias [ES]), onde a substituição de genes direcionados pode ser realizada. As células ES selecionadas podem ser combinadas com embriões normais para formar animais quiméricos que podem passar o locus alvo através de sua linha germinativa. Essas possibilidades experimentais são discutidas com mais detalhes posteriormente neste capítulo. Esta seção trata simplesmente de considerações genéticas envolvidas na escolha de camundongos a serem usados ​​para a geração e gestação de embriões para vários fins experimentais.

    6.2.2 Escolha de cepas para produção de ovos

    6.2.2.1 Considerações gerais

    Uma série de fatores desempenhará um papel na seleção de uma linhagem apropriada de fêmeas que contribuirá com os ovos a serem usados ​​como material experimental. Em primeiro lugar, em todos os casos, é importante que os ovos sejam fortes o suficiente para resistir aos danos das manipulações a que serão submetidos. Em segundo lugar, o protocolo experimental específico pode impor a necessidade de óvulos com qualidades especiais determinadas geneticamente. Terceiro, nos casos em que um grande número de ovos é necessário, será importante que a cepa seja aquela que responde bem à superovulação, conforme discutido na próxima seção. Finalmente, há uma questão de restrições genéticas à descendência que surgirão da manipulação.

    No que diz respeito a este último critério, para alguns experimentos será importante manter um controle estrito sobre a base genética de embriões a serem usados ​​para manipulação genômica. Nestes casos, os embriões consanguíneos devem ser derivados de cruzamentos entre dois membros da mesma linhagem consanguínea. Se esses embriões forem usados ​​para a introdução da linha germinativa de material genético estranho, os animais transgênicos resultantes serão verdadeiramente coisogênicos com a linhagem consanguínea original.

    Para outros experimentos, homogeneidade genética estrita não será necessária. Nestes casos, é possível usar embriões F 2 de fêmeas F 1 superovuladas que foram acasaladas com machos F 1 do mesmo genótipo autossômico. Este protocolo de reprodução é frequentemente preferível ao uso de uma abordagem estritamente consanguínea ou uma abordagem aleatória. Em primeiro lugar, em contraste com a abordagem de reprodução aleatória, ainda se mantém um certo grau de controle sobre a entrada genética, uma vez que apenas alelos derivados de uma ou ambas as cepas consanguíneas usadas para gerar os pais F 1 estarão presentes em qualquer locus em cada embrião. Em segundo lugar, em contraste com a abordagem consanguínea, o uso de fêmeas e embriões com genótipos heterozigotos permite a expressão do vigor híbrido em todos os níveis do processo reprodutivo. Em particular, embriões heterozigotos são menos propensos a serem feridos por manipulações in vitro.

    6.2.2.2 A cepa FVB / N é ideal para a produção de camundongos transgênicos

    Uma cepa consanguínea que foi desenvolvida relativamente recentemente a partir de uma colônia de camundongos não consanguíneos com uma longa história de reprodução em laboratório no NIH tem características especiais de interesse particular para pesquisadores interessados ​​na produção de camundongos transgênicos: esta cepa é chamada de FVB / N. A cepa FVB / N é única em vários aspectos importantes (Taketo et al., 1991). Primeiro, seu tamanho médio de ninhada de 9,5 (com um intervalo de até 13) é significativamente maior do que aquele encontrado com qualquer outra linhagem consanguínea bem conhecida (ver Tabela 4.1). Em segundo lugar, óvulos fertilizados derivados de mães FVB / N têm pró-núcleos muito grandes e visualmente proeminentes - essa característica é única entre as cepas consanguíneas conhecidas e facilita muito a injeção de DNA. Finalmente, a fração de embriões injetados que sobrevivem em animais nascidos vivos também é muito maior do que a observada com todas as outras cepas consanguíneas. Por essas razões, o FVB / N rapidamente se tornou a cepa de escolha para uso na produção de animais transgênicos.

    6.2.3 Otimizando a produção de embriões por superovulação

    Embora seja possível recuperar na ordem de 6 a 10 ovos diretamente de fêmeas endogâmicas individuais ou F 1, é possível obter números muito maiores & # 151 até 60 ovos por animal & # 151 induzindo um estado de superovulação. Para muitos experimentos, é importante começar com um grande número de embriões com superovulação, pode-se reduzir drasticamente o número de fêmeas necessárias para produzir esse grande número. A superovulação é induzida pela administração de duas injeções intraperitoneais precisamente sincronizadas de reagentes de gonadotrofina comercialmente disponíveis que imitam hormônios naturais de camundongo e iniciam a maturação de um número aberrantemente grande de folículos de ovo. A superovulação, como a ovulação normal, causa tanto um estímulo ao interesse do macho no acasalamento quanto a receptividade da fêmea aos machos interessados. O protocolo é descrito em detalhes no manual de embriologia de camundongo por Hogan e colegas (1994).

    Como esperado, o número médio de ovos induzido pela superovulação é altamente dependente da cepa. Mulheres com idade apropriada das cepas B6, BALB / cByJ, 129 / SvJ, CBA / CaJ, SJL / J e C58 / J podem ser induzidas a ovular de 40 a 60 ovos (Hogan et al., 1994). No outro extremo, as fêmeas das cepas A / J, C3H / HeJ, BALB / cJ, 129 / J 129 / ReJ, DBA / 2J e C57L / J não respondem bem ao protocolo de superovulação, produzindo apenas 15 ou menos ovos por rato. A resposta da cepa FVB / N à superovulação está entre a produção de 25 embriões ou menos por fêmea (Taketo et al., 1991). Para a geração de camundongos transgênicos, no entanto, esta única característica negativa de FVB / N é superada pelas outras características desta cepa discutidas acima.

    Um aspecto interessante da resposta alta versus baixa à superovulação é que em dois casos, as sub-linhagens derivadas da mesma linhagem consanguínea original (BALB / cByJ versus BALB / cJ e 129 / SvJ versus 129 / J) expressam tais fenótipos claramente distintos. Esta descoberta sugere que mudanças sutis no genótipo podem ter consequências dramáticas na expressão deste traço reprodutivo específico.

    Uma descoberta crítica de importância prática e teórica é que as fêmeas híbridas F 1 nem sempre expressam uma resposta melhor à superovulação do que seus pais consanguíneos. Por exemplo, o híbrido F 1 B6D2F 1 comumente usado, que é formado por um cruzamento entre um ovulador alto (B6) e um ovulador baixo (DBA / 2J), expressa o fenótipo de ovulação baixo (Hogan et al., 1994). Essa observação vai contra o vigor do híbrido e sugere que a base genética para esse fenótipo pode ser muito mais específica e limitada do que para outros fenótipos gerais de viabilidade e fertilidade. Além disso, esta observação sugere que, para os principais genes envolvidos, os alelos & quot; quothigh ovulatory & quot; são recessivos.

    Dois híbridos F 1 foram determinados empiricamente para expressar uma superovulação de alto nível & # 151 [BALB / cByJ x B6] e [B6 x CBA / CaJ] (Hogan et al., 1994). Também é muito provável que os híbridos F 1 derivados de cruzamentos entre qualquer um dos respondentes altos listados acima também sejam eles próprios respondedores elevados. Muitos desses híbridos F 1 podem ser adquiridos diretamente de fornecedores de animais, no entanto, na maioria dos casos, os fornecedores não podem fornecer um dia exato de nascimento, que é necessário para determinar o momento ideal de uso.

    6.2.4 O garanhão fértil

    As fêmeas que sofreram ovulação & # 151 natural ou induzida & # 151 devem ser acasaladas com um "macho reprodutor fértil" para produzir zigotos que podem ser usados ​​para injeção nuclear ou outros fins. Conforme discutido anteriormente, é sempre preferível usar um macho reprodutor fértil com o mesmo genótipo da fêmea, seja ele consanguíneo ou um híbrido F 1. Obviamente, é importante usar animais visivelmente saudáveis ​​na flor da idade, entre 2 e 8 meses de idade. Além disso, a experiência anterior costuma ser um bom indicador de desempenho futuro. Os machos que acasalaram com sucesso sob demanda no passado (conforme indicado por um tampão vaginal) provavelmente farão o mesmo no futuro, por esse motivo, devem ser mantidos registros sobre o desempenho de cada macho usado para esse propósito. Para melhores resultados, deve-se colocar apenas um macho e uma fêmea em cada gaiola e, após um acasalamento bem-sucedido, o macho deve ter um descanso de dois a três dias.

    6.2.5 Transferência de embriões para mães adotivas

    6.2.3.1 Escolha de cepa

    Uma vez que os embriões tenham sido manipulados em cultura, eles devem ser colocados de volta no trato reprodutivo de um mãe adotiva onde eles podem continuar seu desenvolvimento em animais nascidos vivos totalmente formados. Uma vez que a mãe adotiva contribui apenas com um útero, e não com material genômico, para a prole modificada, sua constituição genética não deve ser escolhida de acordo com os mesmos critérios usados ​​para animais na maioria dos outros protocolos experimentais. Apenas duas considerações são importantes na escolha de uma mãe adotiva. Em primeiro lugar, e mais importante, ela deve ter uma ótima aptidão reprodutiva e características de "maternidade". Isso pode ser realizado com um híbrido F 1 entre duas cepas consanguíneas padrão [B6 x CBA é recomendado (Hogan et al., 1994), mas outros farão também] ou com cepas exangues disponíveis em vários criadores comerciais. As melhores mães adotivas são aquelas que já deram à luz e criaram pelo menos uma ninhada com sucesso, portanto, muitas vezes é útil testar candidatos em potencial, submetendo-os a um ciclo de gravidez / maternidade / desmame.

    Uma segunda consideração é se o investigador será capaz de distinguir filhotes nascidos naturalmente daqueles que foram criados. Este é um fator apenas quando a mãe adotiva foi acasalada com um macho estéril a fim de induzir o estado necessário de pseudogravidez, e há dúvidas se o macho foi devidamente esterilizado. O método mais simples para distinguir os dois tipos de descendência potencial é por uma diferença de cor da pelagem, por exemplo, albino versus pigmentado. Se os embriões experimentais são derivados de pais não portadores de albinos, então tanto a mãe adotiva quanto seu parceiro estéril (discutido abaixo) podem ser escolhidos a partir de cepas albinas comercialmente disponíveis, como CD-1 (Charles River Breeding Laboratories) ou camundongos Swiss Webster (da Taconic Farms). Quando se tem certeza de que o macho reprodutor estéril é realmente estéril, as diferenças de cor da pelagem são menos críticas, desde que existam diferenças de DNA bem definidas se surgir a necessidade inesperada de distinguir os genótipos de descendentes nascidos naturalmente potenciais dos descendentes transferidos experimentalmente.

    6.2.3.2 Indução de pseudogravidez e o macho estéril

    Em mulheres humanas, o ambiente uterino torna-se receptivo à implantação de óvulos fertilizados como consequência direta da indução hormonal da ovulação. Em camundongos e na maioria dos outros mamíferos não primatas, o ambiente uterino se torna receptivo à implantação em resposta a um grau suficiente de estimulação sexual. Além disso, essa estimulação também causa alterações hormonais que alteram o ciclo estral normal, sob a suposição de que ocorrerá uma gravidez. Quando uma resposta estimuladora bem-sucedida ocorre na ausência de fertilização, diz-se que a fêmea está em um estado de "pseudogravidez". Somente mulheres pseudopravidas permitirão a implantação e o desenvolvimento bem-sucedidos de embriões adotados. A pseudogravidez pode ser alcançada de duas maneiras: (1) acasalando-se com um homem estéril ou (2) por meio do uso de ferramentas de masturbação feminina, como hastes vibratórias inseridas na vagina (West et al., 1977). A maioria dos pesquisadores descobriu que os acasalamentos naturais produzem uma porcentagem maior de pseudopravidades do que os substitutos humanos.

    Os machos estéreis podem ser derivados geneticamente ou cirurgicamente. A derivação genética requer uma colônia de reprodução de camundongos duplamente heterozigotos para mutações pseudo-alélicas no cromossomo 17 em uma região conhecida como t complexo (Silver, 1985). Animais com o genótipo T/t w2 (disponíveis no Laboratório Jackson) são intercruzados com o propósito de manter a cepa e também para a produção de machos estéreis, conforme diagramado na figura 6.1.

    Para aqueles sem os recursos ou pessoal necessário para criar machos geneticamente estéreis, a única outra opção é a vasectomia cirúrgica, que envolve a ruptura dos canais deferentes em ambos os lados do corpo (Hogan et al., 1994). A escolha da linhagem de camundongo a ser usada é baseada em critérios análogos àqueles estabelecidos para a escolha de uma mãe adotiva, exceto que a capacidade de acasalamento deve ser considerada no lugar da capacidade de maternidade. Os híbridos F 1 padrão, bem como os animais "criados ao acaso", podem todos ser usados ​​com sucesso. Quando se trata de escolher entre machos individuais dentro de uma linhagem particular, deve-se usar os mesmos critérios descritos na seção 6.2.2.2 para a escolha de machos reprodutores férteis. Além disso, o pré-acasalamento de machos "quotsteris" com fêmeas férteis serve para confirmar o sucesso da vasectomia.

    6.3 Camundongos transgênicos formados por injeção nuclear

    Existem dois problemas inerentes a todos os métodos de mutagênese clássica. O primeiro problema é que o processo é totalmente aleatório. Assim, deve-se começar projetando um ensaio de triagem para permitir a detecção de mutações no locus de interesse e, em seguida, deve-se esperar o aparecimento de animais mutantes em uma frequência que seja igual ou superior à taxa usual por locus . Se um alelo mutante não consegue produzir um fenótipo que pode ser detectado pela tela, ele não será detectado. Finalmente, mesmo quando alelos mutantes são detectados, a lesão subjacente geralmente não pode ser determinada sem clonagem e posterior caracterização molecular.

    O segundo problema com a mutagênese clássica é que as mutações induzidas não são marcadas de forma alguma para fornecer uma entrada molecular em um locus que ainda não foi clonado. Assim, se um novo locus é descoberto por uma mutação induzida que causa um fenótipo interessante, ele só pode ser abordado por meio de genes candidatos e abordagens de clonagem posicional da mesma forma que qualquer outro locus definido fenotipicamente. Além disso, no caso de mutações induzidas por ENU, os alelos mutantes e de tipo selvagem são provavelmente indistinguíveis molecularmente, com exceção de um único nucleotídeo que pode ou não afetar um local de restrição.

    Pode-se imaginar dois tipos de abordagens mutagênicas que seriam mais ideais para os dois tipos diferentes de situações em que as mutações podem fornecer ferramentas para a análise molecular do desenvolvimento e outros aspectos da biologia dos mamíferos. Por um lado, uma abordagem de mutagênese aleatória é adequada para a elucidação de novos loci, desde que o alelo mutante seja marcado para permitir o acesso molecular direto. Por outro lado, para analisar melhor um locus já clonado e caracterizado, gostaríamos de gerar animais que expressam erroneamente o locus de alguma maneira definida. As tecnologias de inserção de transgene e direcionamento de genes forneceram aos geneticistas as ferramentas necessárias para atingir esses dois objetivos.

    Em 1981, cinco laboratórios independentes relataram a inserção de DNA estranho na linha germinal de camundongo através da microinjeção de ovos de uma célula (Costantini e Lacy, 1981 Gordon e Ruddle, 1981 Harbers et al., 1981 Wagner et al., 1981a Wagner et al., 1981b). Embora a incorporação de DNA exógeno na linha germinal por meio de infecção viral de embriões tenha sido relatada anteriormente (Jaenisch, 1976), os relatórios de 1981 implicaram pela primeira vez que o DNA de qualquer fonte poderia ser usado para transformar o genoma do camundongo. A aparência da genética do rato mudou para sempre com o desenvolvimento desta ferramenta poderosa. Uma ciência estritamente observacional foi repentinamente lançada no reino da engenharia genética, com todas as suas vastas implicações. A inserção de material genético na linha germinal de camundongos tornou-se agora suficientemente rotineira para que a metodologia seja detalhada em vários & quotcookbooks & quot (Wassarman e DePamphilis, 1993, Hogan et al., 1994) e animais projetados são fornecidos como um serviço comercial por uma série de empresas.

    O termo transgênico foi criado para descrever animais que possuem sequências estranhas inseridas de forma estável em seu genoma por meio de intermediários humanos. Os animais transgênicos podem ser criados por microinjeção ou infecção viral de embriões, ou através da manipulação em cultura de "células ES" do tipo embrionário que são subsequentemente incorporadas de volta ao embrião adequado para pastoreamento na linha germinal. A última tecnologia será discutida em uma seção seguinte. Aqui, vou me concentrar em animais transgênicos criados por injeção direta de DNA em embriões.

    O animal inicial que se desenvolve a partir de cada ovo micro-manipulado é chamado de fundador. Mesmo quando vários embriões foram todos injetados ou infectados com o mesmo DNA estranho, o local de integração & # 151 ou locus transgene & # 151 em cada fundador será diferente. No entanto, todos os animais transgênicos que descendem de um único fundador compartilharão o mesmo locus transgene. Protocolos para a criação de camundongos transgênicos e revisões extensivas da tecnologia e seus usos foram descritos em outro lugar (Palmiter e Brinster, 1986 Wassarman e DePamphilis, 1993 Hogan et al., 1994). As regras para nomear loci transgênicos e animais transgênicos são apresentadas na seção 3.3.5.

    Com os protocolos atuais para a criação de camundongos transgênicos por microinjeção de embriões, o local de integração não é pré-determinado e, para todos os efeitos práticos, deve ser considerado aleatório. A microinjeção permite adicionar, mas não subtraia o material genético de maneira dirigida se um experimento específico levar à inserção de uma nova versão de um gene de camundongo no genoma, esse novo alelo estará presente além do par diplóide normal. Consequentemente, apenas as formas dominantes ou co-dominantes de expressão fenotípica serão detectáveis ​​a partir do transgene.

    A tecnologia de microinjeção de embriões pode ser usada para explorar muitos aspectos diferentes da biologia do camundongo e da regulação gênica. Uma classe de experimentos abrange aqueles que visam determinar os efeitos da expressão de um produto gênico natural de uma maneira não natural. Ao combinar o gene de interesse com regiões regulatórias escolhidas de outros genes, pode-se fazer com que camundongos transgênicos expressem o produto em um nível mais alto do que o normal, ou em tecidos alternativos ou estágios de desenvolvimento. Os fenótipos mutantes que resultam de tais formas aberrantes de expressão podem ser usados ​​para elucidar a função normal do gene de tipo selvagem. Experimentos desse tipo podem ser usados, por exemplo, para demonstrar a capacidade de alguns genes de induzir mudanças específicas de desenvolvimento e a natureza oncogênica de outros quando são expressos de forma aberrante. Muitos outros tipos de perguntas podem ser respondidos com essa abordagem.

    Em outra classe de experimentos, pode-se dissecar a função de uma região reguladora formando construções entre ela e um gene repórter cuja expressão pode ser facilmente testada no (s) tecido (s) apropriado (s). Com uma série de linhas transgênicas que possuem formas parcialmente deletadas ou mutadas de uma região reguladora, pode-se identificar quais sequências de DNA estão envolvidas na ativação e desativação de genes em diferentes tecidos ou estágios de desenvolvimento.

    Uma terceira classe de experimentos visa corrigir um defeito genético em um camundongo mutante por meio da inserção genômica de um transgene de tipo selvagem. Este uso da tecnologia transgênica fornece os meios mais poderosos disponíveis para provar que um gene candidato clonado é de fato idêntico ao locus responsável por um determinado fenótipo mutante. Além disso, a correção de defeitos genéticos em modelos de mamíferos é um prelúdio necessário para qualquer tentativa de realizar estudos semelhantes em humanos.

    Uma consideração importante em todos os experimentos transgênicos decorre da observação de que a localização cromossômica real em que um transgene se insere pode desempenhar um papel determinante em sua expressão. Isso será prontamente aparente nos casos em que diferentes linhas fundadoras com o mesmo transgene mostram diferentes padrões de expressão do transgene. A razão para tais diferenças específicas da cepa é que algumas regiões cromossômicas são normalmente mantidas em configurações de cromatina que podem agir para suprimir a atividade do gene. Diferentes construções de transgene mostrarão diferentes níveis de sensibilidade à supressão da atividade quando pousarem em tais regiões.

    Outro problema potencial pode resultar da inserção do transgene em um locus endógeno de funcionamento normal com consequências imprevistas. Em aproximadamente 5 a 10% de todos os casos estudados até o momento, descobriu-se que a homozigosidade para um locus transgene particular causa letalidade ou alguma outra anomalia fenotípica (Palmiter e Brinster, 1986). Esses fenótipos recessivos são provavelmente devido à interrupção de algum gene vital normal. Em casos menos frequentes, um transgene pode pousar em um local que é flanqueado por um intensificador endógeno que pode estimular a atividade do gene em estágios ou tecidos inadequados. Isso pode levar à expressão de fenótipos dominantes que não são estritamente resultado do próprio transgene. Por todas essas razões, é crítico analisar os dados de três ou mais linhas fundadoras com a mesma construção do transgene antes de chegar a conclusões sobre o efeito, ou a falta dele, no fenótipo do camundongo.

    Na grande maioria dos casos analisados ​​até o momento, a interrupção das sequências endógenas causada pela integração do transgene não teve efeito aparente no fenótipo. No entanto, a ausência de um fenótipo detectável não significa necessariamente que o transgene foi integrado em uma região não funcional do genoma. Conforme discutido no capítulo 5, apenas um pequeno subconjunto de todos os genes de mamíferos são realmente vital, e os efeitos sutis no fenótipo provavelmente passarão despercebidos se alguém realizar apenas um exame superficial de animais transgênicos. Assim, a frequência real de mutagênese de inserção resultante da microinjeção do embrião é provavelmente significativamente maior do que os números indicam.

    6.3.2 Rastreamento do transgene e detecção de homozigotos

    A menos que uma inserção transgênica particular cause um fenótipo dominante facilmente detectável, a presença do transgene em um animal é mais facilmente determinada por meio de análise de DNA. Para testar um grande número de camundongos, a melhor fonte de DNA são cortes de cauda ou orelhas (Gendron-Maguire e Gridley, 1993). A presença ou ausência do transgene pode ser demonstrada de forma mais eficiente com um método de análise de PCR que se baseia em sequências alvo específicas do transgene.

    O animal fundador de uma linha transgênica será heterozigoto para o locus de inserção do transgene. O segundo homólogo será associado a um alelo "tipo selvagem" não interrompido (+) neste locus, enquanto o cromossomo interrompido carregará um transgene (Tg) alelo. Contanto que o transgene seja transmitido à prole de um heterozigoto (Tg/ +) pai, será necessário testar cada animal individual de cada nova geração quanto à presença do transgene. Por esta razão, seria útil gerar animais homozigotos para o alelo do transgene, uma vez que todos os descendentes de cruzamentos entre homozigotos Tg/Tg os animais também seriam homozigotos e não haveria necessidade de teste de DNA.

    Em casos raros, homozigoto Tg/Tg os animais serão fenotipicamente distintos de seus Tg/ + coortes. Essa observação geralmente é uma boa indicação de que o transgene interrompeu a função de um locus endógeno por meio do processo de integração. Se o fenótipo homozigoto recessivo for letal, será obviamente impossível gerar uma linhagem homozigótica de animais. Caso contrário, o fenótipo pode eliminar a necessidade de análise de DNA. Na grande maioria dos casos, no entanto, homozigotos Tg/Tg os animais serão indistinguíveis no fenótipo de heterozigotos Tg/ + animais, e sem fenótipo recessivo, a identificação de animais homozigotos não será direta.

    Uma abordagem para confirmar o genótipo de um presuntivo Tg/Tg animal é baseado na genética estatística. Nesse caso, a confirmação é realizada estabelecendo-se um acasalamento entre o suposto homozigoto e um parceiro + / + não transgênico. Se o animal em questão for apenas um Tg/ + heterozigoto, seria de se esperar números iguais de Tg/ + e + / + prole. Por meio do método de análise de qui-quadrado descrito na seção 9.1.3, pode-se calcular que, se pelo menos 13 descendentes nascerem e todos carregarem o transgene, a probabilidade de um genótipo heterozigoto é menor que um em mil. Se até mesmo um único animal for obtido sem o transgene, o genótipo parental & # 146s quase certamente será Tg/ +. Os testes estatísticos deste tipo devem ser realizados de forma independente para cada presuntivo Tg/Tg animal. Uma vez homozigoto Tg/Tg machos e fêmeas foram confirmados, eles podem ser re-acasalados entre si como os fundadores de uma cepa transgênica homozigótica.

    Uma segunda abordagem para demonstrar a homozigose do transgene requer a clonagem de uma sequência endógena do genoma do camundongo que flanqueia o local de inserção do transgene. Essa tarefa geralmente não é simples porque o material transgênico pode estar presente em várias cópias que são misturadas com sequências endógenas localmente reorganizadas. No entanto, com a clonagem de qualquer sequência endógena próxima, obtém-se uma ferramenta de mapeamento que, em teoria, pode ser usada para distinguir ambos os alelos discutidos e não interrompidos no locus transgene através do uso de uma das várias técnicas descritas no capítulo 8 para detectar polimorfismos de DNA "codominantes". Com essa ferramenta, e um ensaio associado, a homozigosidade para o alelo do transgene seria demonstrada pela ausência do alelo não interrompido de tipo selvagem. Infelizmente, esta abordagem exigiria a geração de um clone endógeno separado para cada linha transgênica a ser estudada. Os protocolos para localizar o local de inserção do transgene dentro do mapa de ligação do mouse são discutidos na seção 7.3.2.

    6.4 Mutagênese direcionada e substituição de genes

    Embora a tecnologia de inserção do transgene descrita na seção anterior forneça uma ferramenta poderosa para a análise da ação do gene em todo o organismo, ela tem uma séria limitação por não fornecer um mecanismo para a geração direcionada de alelos recessivos. Esta limitação pode ser superada com uma tecnologia conhecida de várias formas como direcionamento de genes, mutagênese direcionada ou substituição de genes & # 151, o assunto desta seção. Esta poderosa tecnologia permite que os investigadores gerem mutações direcionadas em qualquer locus clonado. Esses novos alelos mutantes podem ser passados ​​através da linha germinal para produzir um número ilimitado de descendentes mutantes, e diferentes mutações podem ser combinadas com variantes em outros loci para estudar as interações gênicas.

    Esta ferramenta definitiva de engenharia genética nasceu através da combinação de várias tecnologias que se desenvolveram independentemente nos 10 a 20 anos anteriores, incluindo cultura de células-tronco embrionárias e recombinação homóloga, com manipulação de embriões de camundongo e formação de quimera (Sedivy e Joyner, 1992 fornecem uma excelente revisão de todos os aspectos deste campo). Dois laboratórios independentes, chefiados por Oliver Smithies e Mario Cappechi, finalmente conseguiram reunir todas essas várias tecnologias em meados da década de 1980 (Capecchi, 1989 Smithies, 1993).

    Um, embora não o único, apelo da tecnologia de direcionamento de genes é a capacidade de criar modelos de camundongos para doenças humanas específicas (Smithies, 1993). Mas, em essência, o direcionamento de genes pode fornecer aos investigadores ferramentas poderosas para estudar qualquer gene clonado.Embora os padrões de expressão de RNA e proteínas forneçam pistas para os estágios e tecidos nos quais os genes estão ativos, é apenas com as mutações que um verdadeiro entendimento da função pode ser obtido (Chisaka e Capecchi, 1991).

    Depois de elogiar o direcionamento de genes, é importante avisar os usuários em potencial dessa tecnologia que sua aplicação não é isenta de problemas. Primeiro, um investigador deve atingir um alto nível de competência e experiência com vários protocolos distintos e tecnicamente exigentes, o que requer um investimento significativo de tempo e energia. Em segundo lugar, há a natureza inconstante da própria tecnologia, conforme discutido abaixo. No entanto, o punhado de laboratórios inicialmente capazes de direcionar genes com sucesso expandiu-se rapidamente com o treinamento de novos jovens pesquisadores, e essa expansão provavelmente continuará muito mais com a recente publicação de vários volumes excelentes contendo capítulos detalhados sobre protocolos experimentais (Joyner, 1993 Wassarman e DePamphilis, 1993 Hogan et al., 1994).

    6.4.2 Criação de & # 145 nocautes de gene & # 146

    Uma vez que um determinado gene foi clonado e caracterizado, as etapas envolvidas na obtenção de um camundongo com um nulo mutação no locus correspondente pode ser resumida como segue. Primeiro, deve-se projetar e construir um vetor de direcionamento apropriado no qual o gene de interesse foi interrompido com um marcador selecionável positivo no protocolo mais comumente usado, um marcador selecionável negativo também é adicionado em uma posição que flanqueia a sequência do gene. O marcador selecionável positivo mais comumente usado é a resistência à neomicina (neo), e o marcador selecionável negativo mais comumente usado é a timidina quinase (tk) gene.

    A segunda etapa envolve a introdução do vetor de direcionamento em uma cultura de embrionário scélulas tem (ES) (geralmente derivadas da cepa 129) seguida pela seleção para aquelas células nas quais o marcador selecionável positivo interno se tornou integrado ao genoma sem o marcador selecionável negativo de flanco. A terceira etapa envolve a triagem de clones que integraram o vetor por recombinação homóloga em vez da recombinação não homóloga mais comum em sítios genômicos aleatórios. Uma vez que os "clones direcionados" tenham sido identificados, a quarta etapa envolve a produção de embriões quiméricos por meio da injeção das células ES mutadas na cavidade interna de um blastocisto (geralmente da cepa B6) e a colocação desses embriões quiméricos de volta em mães adotivas que os trazem a termo. Uma abordagem alternativa desenvolvida recentemente para a formação de quimera por meio da agregação e incorporação espontânea de células ES em embriões em estágio de clivagem tem a vantagem de não exigir equipamento de microinjeção sofisticado (Wood et al., 1993).

    O experimento é considerado um sucesso se as células ES entrarem com sucesso na linha germinativa dos animais quiméricos, conforme demonstrado pela reprodução. Se o gene interrompido é de fato transmitido através da linha germinativa, a primeira geração de descendentes do fundador quimérico incluirá animais heterozigotos que podem ser cruzados para produzir uma segunda geração com indivíduos homozigotos para o gene mutado. As regras de nomenclatura que são usadas para nomear todas as mutações recém-criadas são descritas na seção 3.4.4.

    6.4.3 Criação de mudanças sutis

    Uma segunda geração de estratégias de recombinação homóloga foi desenvolvida para permitir a colocação de pequenas mutações específicas em um locus sem a presença concomitante de rompimento de marcadores selecionáveis ​​intragênicos. A capacidade de criar mudanças sutis em um gene pode fornecer ao investigador as ferramentas necessárias para dissecar a função de um produto gênico, um aminoácido de cada vez. Várias abordagens diferentes para esse objetivo foram descritas. O mais promissor deles, chamado de & quothit and run, & quot é baseado na geração de linhagens de células ES que sofreram recombinação homóloga com um vetor de direcionamento, seguido pela seleção de um evento de recombinação intracromossômica que elimina os marcadores selecionáveis ​​e deixa para trás apenas o mutado forma do gene (Joyner et al., 1989 Hasty et al., 1991 Valancius e Smithies, 1991 Fiering et al., 1993).

    Infelizmente, no momento em que este livro foi escrito, o bater e correr protocolos ainda são extremamente exigentes e com cada experimento, um investigador irá obter apenas um único alelo mutante no locus de interesse. Uma estratégia alternativa é dividir o problema em duas tarefas distintas: (1) eliminar o gene completamente em uma cepa por recombinação homóloga padrão e (2) a produção independente de uma ou mais linhagens transgênicas que contêm versões mutantes sutilmente alteradas do gene. Ao cruzar a linha de knock-out com uma das linhagens transgênicas, torna-se possível gerar uma nova linha de animais em que o alelo de tipo selvagem original foi substituído (embora não no mesmo local) por um alelo de transgene especialmente projetado . Existem várias vantagens nessa aproximação. Em primeiro lugar, a metodologia necessária para simplesmente eliminar um gene é mais direta e melhor desenvolvida no momento em que este livro foi escrito do que a metodologia de bater e correr. Em segundo lugar, o direcionamento de genes em células ES requer muito mais tempo e esforço do que a produção de camundongos transgênicos por injeção nuclear. Assim, quando um investigador deseja estudar uma variedade de alelos em um locus específico, será muito mais fácil criar uma única linha de camundongos por direcionamento de gene e, em seguida, cruzá-la com diferentes linhagens transgênicas. A única desvantagem potencial para esta abordagem é que a construção do transgene pode não ser regulada adequadamente e padrões precisos de expressão podem não ocorrer no animal, mesmo quando o transgene está ligado ao seu próprio promotor / intensificador.

    Mesmo quando um laboratório domina todos os protocolos necessários para realizar o direcionamento de genes, a diferença entre o sucesso e o fracasso ainda pode ser uma questão de sorte. Alguns sítios de DNA parecem altamente impermeáveis ​​à recombinação homóloga, enquanto sítios a alguns quilobases de distância podem ser muito mais abertos à integração. Mas mesmo no mesmo local, a frequência de eventos de recombinação homóloga versus não homóloga pode variar por um fator de dez de um dia para o outro (Snouwaert et al., 1992).

    No momento em que este livro foi escrito, muitos dos fatores responsáveis ​​pelo sucesso permanecem desconhecidos. No entanto, um fator crítico que recentemente se tornou evidente é a necessidade de usar o DNA de origem para a construção de direcionamento que foi clonada da mesma cepa de camundongos usada para a derivação da linha de células ES na qual a construção será colocada (van Deursen e Wieringa, 1992). Em outras palavras, os níveis mais altos de substituição de genes são obtidos quando o DNA de entrada é isogênico com o DNA alvo. Aparentemente, o processo de recombinação homóloga é muito sensível aos polimorfismos de nucleotídeos infrequentes que são susceptíveis de distinguir diferentes cepas consanguíneas umas das outras. Na maioria dos casos hoje, as linhas de células ES foram derivadas da cepa de camundongo 129 / SvJ (mas veja a subseção 6.4.5 abaixo) e, portanto, é geralmente sábio construir construções de DNA com clones obtidos de 129 bibliotecas genômicas.

    O camundongo 129 / SvJ original, e aquele ainda disponível no Laboratório Jackson, tem uma pelagem esbranquiçada causada por homozigose para a diluição do olho-de-rosa (p) mutação e heterozigosidade forçada para a chinchila (c CH ) e albino (c) alelos no locus albino ligado (cch p/c p) Em contraste, o "camundongo 129" que serve como fonte da maioria das linhas de células ES usadas para recombinação homóloga tem uma cor de pelagem agouti de tipo selvagem. Qual é a base para essa diferença?

    A resposta é histórica e está centrada no trabalho de Leroy Stevens, um geneticista do câncer, agora aposentado, que trabalhou no Laboratório Jackson. Stevens observou que a cepa 129 / SvJ era única na ocorrência de teratomas testiculares espontâneos em uma taxa incomumente alta de 3 a 5% em animais machos. Como meio de entender melhor os parâmetros genéticos responsáveis ​​pela incidência do tumor, Stevens estabeleceu para determinar se qualquer uma de uma variedade de mutações de locus único bem caracterizadas que afetam a incidência do tumor ou a diferenciação de células germinativas interagiria com o genoma 129 de maneira a aumentar ou diminuir a frequência natural de formação de tumor nesta cepa. Uma das mutações que ele testou foi Steel (Sl), que desempenha um papel importante na diferenciação de células germinativas, bem como de melanócitos e células hematopoéticas. o Sl a mutação expressa um fenótipo visível dominante & # 151, o clareamento da cor da pelagem agouti preta de tipo selvagem normal, de modo que tenha uma aparência "sutil" e uma redução do pigmento na metade distal da cauda. Infelizmente, é impossível ver essa alteração fenotípica no cch p / c p revestimento de camundongos 129 / SvJ que já apresentam uma perda quase completa da produção de pigmento. Assim, para seguir o retrocruzamento de Sl em 129 / SvJ, foi necessário substituir os alelos mutantes no c e p loci com alelos de tipo selvagem. É o triplo congênico 129 / Sv-Sl / + , + c + p linha produzida por Stevens que atuou como o fundador para todos os & quot129 camundongos & quot que foram usados ​​no trabalho com células ES.

    6.5 Outros usos de tecnologias transgênicas

    6.5.1 Mutagênese de inserção e captura de genes

    Conforme indicado anteriormente neste capítulo, um produto colateral de muitos experimentos transgênicos é a geração de camundongos nos quais a inserção de um transgene interrompeu um gene endógeno com um efeito conseqüente no fenótipo. Ao contrário das mutações espontâneas ou induzidas por mutagénios, as "mutações quotinsercionais" deste tipo são directamente susceptíveis de análise molecular porque o locus interrompido está marcado com a construção do transgene. Mutações de inserção inesperadas forneceram identificadores moleculares instantâneos não apenas para novos loci interessantes, mas também para loci clássicos que não haviam sido clonados anteriormente (Meisler, 1992).

    Quando a mutagênese por inserção, ao invés da análise de uma construção de transgene particular, é o objetivo de um experimento, pode-se usar protocolos experimentais alternativos que são direcionados diretamente para a interrupção do gene. As principais estratégias atualmente em uso são baseadas na introdução em células ES de construções repórter beta-galactosidase que não possuem um promotor (Gossler et al., 1989, Friedrich e Soriano, 1991) ou são interrompidas por um íntron (Kramer e Erickson, 1981 ) As construções podem ser introduzidas por transfecção de DNA ou no contexto de um retrovírus (Robertson, 1991). Somente quando uma construção se integra a um gene em atividade transcricional é que a beta-galactosidase funcional é produzida e as células produtoras podem ser facilmente reconhecidas por um ensaio de cores. Obviamente, a produção de "beta-gal" normalmente significa que o produto normal do gene interrompido não pode ser feito e, portanto, este protocolo fornece um meio para o isolamento direto de células ES com mutações marcadas em genes que funcionam em células embrionárias. As células mutantes podem ser incorporadas em embriões quiméricos para a produção final de animais mutantes homozigotos que exibirão o fenótipo causado pela ausência do locus interrompido. Toda essa tecnologia, conhecida como "captura de gene" (Joyner et al., 1992), é claramente superior aos métodos tradicionais para a produção de mutações em novos loci que usam mutagênicos químicos ou irradiação.

    6.5.2 Um banco de dados e um repositório de ratos geneticamente modificados

    Um banco de dados computadorizado (chamado TBASE) foi desenvolvido para ajudar os investigadores a catalogar as cepas que eles produzem e encontrar cepas potencialmente úteis produzidas por outros (Woychik et al., 1993). O banco de dados está disponível na Internet por meio do Johns Hopkins Computational Biology Gopher Server e está vinculado aos bancos de dados de mouse on-line mantidos pelo Jackson Laboratory Informatics Group.

    Embora a tecnologia de substituição de genes tenha sido empregada com sucesso por mais e mais laboratórios, ainda é o caso, e provavelmente continuará sendo, que uma enorme quantidade de tempo e esforço é gasta na produção de cada cepa de camundongo recém-projetada. Claramente, não faz sentido derivar cepas com a mesma substituição de gene mais de uma vez. No entanto, com os altos custos de cuidado e manutenção dos animais, muitas vezes é difícil para os pesquisadores manter cepas que não estão mais usando ativamente. Além disso, muitas colônias de pesquisa individuais estão contaminadas por vários vírus e, como tal, instalações livres de vírus relutam em importar ratos de qualquer lugar que não seja de negociantes de renome. O Laboratório Jackson recentemente veio em seu socorro, estabelecendo uma câmara de compensação para preservar o que provavelmente será a mais útil dessas cepas para outros membros da comunidade de pesquisa em todo o mundo. Pela primeira vez, a JAX importará ratos de um grande número de pesquisadores individuais. Cada cepa será derivada por cesariana em uma instalação de barreira livre de germes e será disponibilizada por um custo nominal, sem restrição experimental, para todos os membros da comunidade de pesquisa.

    Com as várias tecnologias que agora foram desenvolvidas para manipular os genomas de células embrionárias combinadas com ferramentas moleculares cada vez mais sofisticadas, pode-se afirmar sem exagero que o céu é o limite para o que pode ser feito com o mouse como modelo de sistema genético . É sempre impossível prever o que o futuro reserva, mas pode-se imaginar o uso de tecnologias de adição e substituição de genes como ferramentas de rotina para avaliar as funções de segmentos sequenciais de DNA obtidos caminhando ao longo de cada camundongo e cromossomo humano. Com relatórios recentes de sucesso na inserção de moléculas de DNA intactas do tamanho de YAC de 250 kb ou mais de comprimento na linha germinativa de animais transgênicos, torna-se possível analisar pedaços ainda maiores de DNA para a presença de elementos genéticos interessantes (Jakobovits et al. ., 1993 Schedl et al., 1993). Na verdade, é apenas com experimentos desse tipo que será possível descobrir completamente todas as vias pelas quais um gene é regulado e todas as vias pelas quais um produto gênico pode funcionar. Assim como o estudo de neurônios isoladamente não pode fornecer uma pista para a consciência humana, o estudo de genes individuais fora de todo o animal não pode fornecer uma pista para a rede de interações necessária para o crescimento e desenvolvimento de um camundongo inteiro ou pessoa.


    Uma nova vida

    Alguns dizem que não, clonar é brincar de Deus e vai acabar mal. A seleção natural significa que os fortes sobrevivem e os fracos morrem. A clonagem interfere neste processo e não funcionará. Mesmo se clonarmos com sucesso animais extintos ou em perigo, eles não sobreviveriam na natureza. E se o fizerem, eles afetarão os ecossistemas existentes e colocarão em perigo outras espécies.

    Outros dizem que sim, não temos apenas o dever de fazê-lo: nosso planeta depende da reversão da taxa de extinção. Os humanos degradaram habitats e mataram milhares de espécies. À medida que a biodiversidade diminui, as espécies restantes se tornam ainda mais vulneráveis ​​a doenças, desastres ambientais e mudanças climáticas. Ao diversificar o pool genético, a clonagem pode salvaguardar o futuro da vida na Terra.


    Assista o vídeo: Tira dúvidas: Qual é a lógica por trás do Plano Nacional de Imunização? - Jornal Minas (Dezembro 2022).