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Como se obtém experimentalmente uma curva de dissociação hemoglobina-oxigênio?

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Sempre quis fazer estudos comparativos de ecofisiologia olhando para a afinidade hemoglobina-oxigênio de populações em ambientes diferentes, mas não consigo encontrar um protocolo para medir experimentalmente a relação. Alguém sabe onde posso encontrar um protocolo ou conhece um protocolo?

Estou assumindo que uma resposta incluiria qual seria a instrumentação necessária, em que condição o sangue precisa estar (fresco?), Se o heme está isolado (e se for, como) e como seria um esquema de amostragem apropriado .


Existem instrumentos disponíveis comercialmente para medir as curvas de saturação de oxigênio e hemoglobina. Sangue total ou sangue lisado pode ser usado; Eu esperaria que a instrumentação viesse com instruções específicas para a preparação da amostra porque pode depender do equipamento exato.

Esses dispositivos usam um espectrofotômetro para medir a saturação, aproveitando a mesma diferença de cor entre o sangue arterial e venoso que é visível ao olho humano.

Para coletar uma curva, você começa com a amostra saturada no ar ambiente ou oxigênio, e o instrumento gradualmente introduz nitrogênio para substituir o oxigênio, enquanto monitora as concentrações de oxigênio usando um eletrodo Clarke.

Aqui está um exemplo de papel que usa um desses dispositivos. Seus métodos precisos podem ou não ser apropriados para sua abordagem de pesquisa.

Referências


Head, C. A., Brugnara, C., Martinez-Ruiz, R., Kacmarek, R. M., Bridges, K. R., Kuter, D.,… & Zapol, W. M. (1997). Baixas concentrações de óxido nítrico aumentam a afinidade pelo oxigênio dos eritrócitos falciformes in vitro e in vivo. Journal of Clinical Investigation, 100 (5), 1193.


Capítulo 4 Transporte de oxigênio

Alguns comentários gerais sobre a troca e difusão gasosa serão feitos, seguidos por uma descrição de como o oxigênio é transportado no sangue. A ligação do oxigênio à hemoglobina será discutida, incluindo a curva de saturação (ou dissociação) de oxigênio e os fatores (efetores alostéricos) que fazem com que ela se desloque. A seguir, uma discussão sobre os efeitos do monóxido de carbono na ligação ao oxigênio será apresentada. Por fim, será apresentada uma descrição dos transportadores artificiais de oxigênio. A maioria desses tópicos é coberta em livros-texto padrão [6,10,54,113] e monografias sobre transporte de oxigênio [112].


Introdução

A pandemia de síndrome respiratória aguda grave coronavírus-2 (SARS-CoV-2) progrediu em todo o mundo com mais de 22 milhões de casos no momento em que este artigo foi escrito. Nos estágios iniciais da pandemia da doença SARS-CoV-2 (COVID-19), houve relatos de fenótipos clínicos únicos em pacientes afetados. Um estudo das experiências iniciais de pacientes gravemente enfermos na Itália descreveu uma forma atípica de síndrome da angústia respiratória aguda induzida por pneumonia viral (SDRA) com complacência pulmonar normal e baixa relação ventilação-perfusão. 1 Os relatórios iniciais sugeriram uma taxa de mortalidade muito alta (& gt80%) 2 para pacientes com insuficiência respiratória da doença SARSCoV-2 (COVID-19), em comparação com as taxas de mortalidade por SDRA pré-COVID-19 na faixa de 30-40%. 3 Uma síndrome clínica de hipoxemia & ldquosilent & rdquo ou & ldquohappy & rdquo foi amplamente observada, com pacientes exibindo dispneia mínima ou sinais de disfunção neurocognitiva apesar da hipoxemia grave detectada através da oximetria de pulso. 4 Vários pacientes hospitalizados com COVID-19 parecem ter ativação hemostática significativa, com prevalência de tromboembolismo venoso de 25-31% observada em algumas coortes. 5, 6 Estudos clínicos mais recentes mostraram que as necessidades de ventilação mecânica em pacientes com COVID-19 são semelhantes às de populações de pacientes inscritos em ensaios clínicos de SDRA sem COVID-19. 7, 8 Outros estudos observacionais relataram taxas de mortalidade para COVID-19 na faixa de 25-32%, semelhantes às taxas de mortalidade para SDRA não-COVID-19. 9, 10 Embora a fisiopatologia exata de COVID-19 permaneça um tópico de investigação ativa, evidências crescentes sugerem que a insuficiência respiratória em pacientes com COVID-19 se comporta de forma semelhante à insuficiência respiratória em pacientes com pneumonia viral grave que desencadeia SDRA. 11, 12 A incerteza no início desta pandemia, bem como algumas características persistentemente exclusivas da doença (por exemplo, aumento dos riscos tromboembólicos), levaram a um grande número de hipóteses propostas sobre os mecanismos fisiopatológicos do SARS-CoV-2.

Figura 1. Descrição da fisiopatologia da infecção por SARS-CoV-2. Infecção através da os pulmões (setas abertas), resultando em hipoxemia (deixou) vs. direto & lsquoattack & rsquo por proteínas virais COVID-19 em glóbulos vermelhos (RBC) hemoglobina (Hb) como proposto por Liu e Li13 (direito, setas hash / caixas cinza). Vias hipotéticas cruzadas por X & rsquos vermelhos e destacadas em caixas cinzas não são suportadas por evidências clínicas disponíveis, in vitro / in vivo estudos, nossos resultados, nem mecanismos de interação viral com RBC. Veja o texto para detalhes.

Uma teoria amplamente proposta sustenta que as proteínas virais interagem diretamente com a hemoglobina humana (Hb) e facilitam a remoção do ferro do grupo protético da proteína heme, resultando na perda de hemoglobina funcional e no acúmulo tóxico de ferro. Essa teoria se originou de um manuscrito de Liu e Li 13 postado no servidor de pré-impressão ChemRxiv (mais de 1,89 milhão de visualizações do manuscrito em agosto de 2020). Este trabalho de Liu e Li, 13 que não foi revisado por pares e continua a ser citado, 14, 15 usa em sílico abordagens para modelar as interações entre várias proteínas virais e hemoglobina. Em resumo, o manuscrito sugere que as proteínas virais ORF1ab, ORF10 e ORF3a são derivadas de células plasmáticas infectadas e trabalham em conjunto para remover o heme da cadeia b da hemoglobina, retirar o ferro do heme e sequestrar a protoporfirina IX livre de ferro resultante ( PPIX). Os autores especulam que esse "ataque" coordenado de hemoglobina ocorre no plasma após a hemólise imunológica, resultando na liberação de quantidades tóxicas de ferro, diminuição dos níveis de hemoglobina funcional e distúrbio do metabolismo do heme. Finalmente, Liu e Li 13 afirmam ainda que as consequências de tal degradação da hemoglobina são responsáveis ​​por algumas das características clínicas irregulares relatadas no início da pandemia (Figura 1). Embora este trabalho tenha recebido atenção significativa de cientistas, médicos, imprensa e público em geral, o estudo avança uma teoria da interação viral com a hemoglobina que é inconsistente com os mecanismos bem caracterizados de degradação fisiológica do heme, 16 e, criticamente, avança a mecanismo fisiopatológico inconsistente com a apresentação clínica de pacientes com COVID-19. Aqui, comparamos os dados laboratoriais clínicos de pacientes confirmados com COVID-19 admitidos na unidade de terapia intensiva (UTI) do Centro Médico da Universidade de Pittsburgh (UPMC) com pacientes com SDRA, mas sem COVID-19. Esses dados empíricos desafiam a teoria de que as proteínas SARS CoV-2 removem diretamente o ferro da hemoglobina humana como um mecanismo fisiopatológico do COVID-19.


Função Hb e controle regulatório alostérico

As Hbs de vertebrados com mandíbula são heterotetrâmeros, compostas por duas subunidades do tipo α e duas do tipo β. Cada um dos polipeptídeos de subunidade contém um grupo heme ligado covalentemente (consulte o Glossário) que pode se ligar reversivelmente a um único O2 molécula quando o átomo de ferro está no estado ferroso (Fe 2+), portanto, a Hb tetramérica se liga a até quatro O2 moléculas. O tetrâmero de Hb, α2β2, consiste em dímeros αβ semirrígidos emparelhados que sofrem uma rotação simétrica durante a transição ligada à oxigenação na estrutura quaternária entre o estado 'R' de alta afinidade (oxigenado) e o estado 'T' de baixa afinidade (desoxigenado) (Fig. . 1A). A mudança ligada à oxigenação no equilíbrio conformacional T↔R é central para a alosteria homotrópica (O cooperativo2-ligação que decorre da interação subunidade-subunidade) e alosteria heterotrópica (regulação da reatividade do heme por ligantes que se ligam em locais remotos do bolso do heme) (Perutz, 1970 Baldwin e Chothia, 1979).

Regulação alostérica

A regulação da atividade da proteína pela ligação de uma molécula de cofator em um local diferente do local ativo da proteína, a ligação de cofatores alostéricos normalmente induz uma mudança na conformação da proteína.

Efeito Bohr

A modulação de Hb – O2 afinidade por mudanças no pH e CO2 contente. Na faixa fisiológica, o O2 afinidade da Hb de vertebrado está inversamente relacionada à acidez e ao CO2 concentração do sangue.

Equilíbrio de Donnan

Equilíbrio iônico obtido em uma solução eletrolítica quando os íons difusíveis e não difusíveis são separados por uma membrana semipermeável.

Um anel de porfirina que coordena um átomo de ferro no centro, serve como um grupo protético para Hb e outras hemoproteínas.

Alosteria homotrópica

Modulação da atividade da proteína pela ligação de um ligante que serve como substrato para a proteína (O2 no caso da Hb), mas que também serve como molécula reguladora. Por exemplo, heme – O2 a ligação a uma subunidade de Hb altera a reatividade do heme de outras subunidades na mesma montagem tetramérica.

Alosteria heterotrópica

A modulação da atividade da proteína pela ligação de um cofator que não é um substrato para os íons hidrogênio da proteína, íons cloreto e fosfatos orgânicos são exemplos de reguladores heterotrópicos da função da Hb.

A regulação alostérica da hemoglobina (Hb) –O2 afinidade. (A) A reação de oxigenação da Hb tetramérica (α2β2) envolve uma transição alostérica na estrutura quaternária do estado T de baixa afinidade para o estado R de alta afinidade. A transição T → R induzida por oxigenação envolve uma quebra de pontes salinas e ligações de hidrogênio dentro e entre as subunidades (quadrados abertos), dissociação de fosfatos orgânicos ligados alostericamente (OPHs), íons Cl - e prótons, e a liberação de calor (oxigenação heme é uma reação exotérmica). A ligação de prótons ligada à oxigenação ocorre em vários resíduos nas cadeias α e β, a ligação de Cl - ocorre principalmente nos grupos α-amino N-terminais das cadeias α e β, além de outros resíduos em ambas as cadeias, e a ligação de fosfato ocorre entre as cadeias β na cavidade central do tetrâmero de Hb. (B) O2 curvas de equilíbrio para Hb purificada na ausência de efetores alostéricos (Stripped) e na presença de íons cloreto (+ Cl -) e fosfatos orgânicos (+ OPH). A ligação preferencial de efetores alostéricos a desoxiHb estabiliza o estado T, mudando assim o equilíbrio alostérico em favor da estrutura quaternária de baixa afinidade. O O2 curvas de equilíbrio são, portanto, deslocadas para a direita (Hb-O2 afinidade é reduzida) na presença de tais efetores. Hb – O2 afinidade é indexada pelo P50 valor (linhas cinza tracejadas) - o PO2 em que a Hb está meio saturada. A forma sigmoidal do O2 curvas de equilíbrio refletem O cooperativo2 ligação, envolvendo um PO2mudança dependente de conformações de baixa afinidade para alta.

A regulação alostérica da hemoglobina (Hb) –O2 afinidade. (A) A reação de oxigenação da Hb tetramérica (α2β2) envolve uma transição alostérica na estrutura quaternária do estado T de baixa afinidade para o estado R de alta afinidade. A transição T → R induzida por oxigenação envolve uma quebra de pontes salinas e ligações de hidrogênio dentro e entre as subunidades (quadrados abertos), dissociação de fosfatos orgânicos ligados alostericamente (OPHs), íons Cl - e prótons, e a liberação de calor (oxigenação heme é uma reação exotérmica). A ligação de prótons ligada à oxigenação ocorre em vários resíduos nas cadeias α e β, a ligação de Cl - ocorre principalmente nos grupos α-amino N-terminais das cadeias α e β, além de outros resíduos em ambas as cadeias, e a ligação de fosfato ocorre entre as cadeias β na cavidade central do tetrâmero de Hb. (B) O2 curvas de equilíbrio para Hb purificada na ausência de efetores alostéricos (Stripped) e na presença de íons cloreto (+ Cl -) e fosfatos orgânicos (+ OPH). A ligação preferencial de efetores alostéricos ao desoxiHb estabiliza o estado T, mudando assim o equilíbrio alostérico em favor da estrutura quaternária de baixa afinidade. O O2 curvas de equilíbrio são, portanto, deslocadas para a direita (Hb-O2 afinidade é reduzida) na presença de tais efetores. Hb – O2 afinidade é indexada pelo P50 valor (linhas cinza tracejadas) - o PO2 em que a Hb está meio saturada. A forma sigmoidal do O2 curvas de equilíbrio refletem O cooperativo2 ligação, envolvendo um PO2mudança dependente de conformações de baixa afinidade para alta.

Alosteria homotrópica

Onde SO2 é a saturação fracionária, PO2 é a pressão parcial de O2 em Torr, P50 é o PO2 em que Hb é 50% saturado, e n é o coeficiente de cooperatividade. A equação de Hill é estendida pela equação de Adair mais complexa (Adair, 1925), que expressa SO2 como a função de PO2 e constantes de associação para ligar cada um dos quatro O2 moléculas por tetrâmero de Hb.

Alosteria heterotrópica

Mecanismos heterotrópicos de regulação da Hb-O2 afinidade envolve a ligação ligada à oxigenação de ligantes não heme, como H +, Cl -, CO2, lactato e fosfatos orgânicos. Os locais de ligação para esses efetores alostéricos estão localizados principalmente nos terminais N e C das subunidades da globina e na cavidade central carregada positivamente do tetrâmero de Hb (Arnone, 1972 Arnone e Perutz, 1974 O'Donnell et al., 1979 Nigen et al., 1980). Diferentes fosfatos orgânicos atuam como efetores alostéricos nas hemácias definitivas de diferentes grupos de vertebrados terrestres: 2,3-difosfoglicerato (2,3-DPG) em mamíferos, pentafosfato de inositol (IPP) em aves, trifosfato de adenosina (ATP) e guanosina trifosfato (GTP) em répteis não aviários e ATP e DPG em anfíbios (Rapoport e Guest, 1941 Benesch e Benesch, 1967 Bartlett, 1980 Hazard e Hutchison, 1982 Weber, 1995 Weber e Fago, 2004). Essas moléculas de polifosfato ligam-se eletrostaticamente a uma constelação de resíduos catiônicos que revestem a fenda entre as cadeias β do desoxiHb, estabilizando assim o estado T através da formação de pontes de sal dentro e entre as subunidades das cadeias α e β (Arnone, 1972 Arnone e Perutz, 1974). A ligação de fosfato tem o efeito de reduzir Hb-O2 afinidade mudando o equilíbrio conformacional em favor do estado T de baixa afinidade que esta transição alostérica na estrutura quaternária promove O2 descarregando para as células dos tecidos respiratórios. Como os fosfatos orgânicos são ânions não difusíveis, as mudanças em sua concentração intracelular também exercem um efeito indireto sobre o O2 afinidade ao perturbar o equilíbrio de Donnan (consulte o Glossário) dos prótons através da membrana dos glóbulos vermelhos, pois as mudanças no pH celular modulam a Hb-O2 vinculação por meio do efeito Bohr (consulte o Glossário).

Considerando que a cooperatividade é responsável pela forma do O2 curva de equilíbrio, o O2 afinidade de Hb determina a posição da curva ao longo do x-eixo. Conforme mostrado na Fig. 1B, a curva é deslocada para a direita [correspondendo a uma redução em Hb-O2 afinidade (aumentada P50)] ou à esquerda [correspondendo a um aumento de Hb – O2 afinidade (diminuída P50)] em resposta a mudanças na temperatura, pH e concentrações eritrocíticas de íons Cl - e fosfatos orgânicos.


Hipoxia

J.F. Nunn MD, PhD, FRCS, FFARCS, FFARACS (Hon), FFARCSI (Hon.), Em Applied Respiratory Physiology (Terceira Edição), 1987

Po celular 2

O Po celular 2 é o ponto de partida para a consideração quantitativa da hipóxia. A fosforilação oxidativa para formar ATP ocorre na mitocôndria e continuará até Po 2 de cerca de 0,13 kPa, ou 1 mmHg (página 241). Po 2 gradientes dentro da célula são considerados na página 201, e há razão para acreditar que os neurônios não funcionarão mais quando o Po 2 em sua superfície é reduzido abaixo de cerca de 2,7 kPa (20 mmHg). Po 2 varia de uma célula para outra e também é diferente em diferentes partes da mesma célula. Existem, portanto, dificuldades insuperáveis ​​em definir ou medir 'o Po do tecido 2’.


Resumo

A hemoglobina é uma proteína encontrada nos glóbulos vermelhos composta por duas subunidades alfa e duas beta que circundam um grupo heme contendo ferro. O oxigênio se liga prontamente a este grupo heme. A capacidade do oxigênio de se ligar aumenta à medida que mais moléculas de oxigênio são ligadas ao heme. Estados de doença e condições alteradas no corpo podem afetar a capacidade de ligação do oxigênio e aumentar ou diminuir sua capacidade de se dissociar da hemoglobina.

O dióxido de carbono pode ser transportado pelo sangue por meio de três métodos. É dissolvido diretamente no sangue, ligado às proteínas plasmáticas ou hemoglobina ou convertido em bicarbonato. A maior parte do dióxido de carbono é transportada como parte do sistema de bicarbonato. O dióxido de carbono se difunde nas células vermelhas do sangue. No interior, a anidrase carbônica converte dióxido de carbono em ácido carbônico (H2CO3), que é subsequentemente hidrolisado em bicarbonato (HCO - 3) e H +. O íon H + se liga à hemoglobina nas hemácias e o bicarbonato é transportado para fora das hemácias em troca de um íon cloreto. Isso é chamado de deslocamento de cloreto. O bicarbonato deixa as células vermelhas do sangue e entra no plasma sanguíneo. Nos pulmões, o bicarbonato é transportado de volta para as células vermelhas do sangue em troca de cloreto. O H + se dissocia da hemoglobina e se combina com o bicarbonato para formar ácido carbônico com a ajuda da anidrase carbônica, que catalisa ainda mais a reação para converter o ácido carbônico de volta em dióxido de carbono e água. O dióxido de carbono é então expelido dos pulmões.


Condições patológicas que afetam o ODC

Anemia

Como discutido anteriormente, o conteúdo de oxigênio no sangue é diretamente proporcional à concentração de hemoglobina e, conseqüentemente, a anemia (e a policitemia) tem efeitos amplamente previsíveis sobre a CDO. Em termos simples, uma redução da concentração de hemoglobina para metade do valor normal é acompanhada por uma redução semelhante no conteúdo de oxigênio arterial com nenhuma (ou muito pouca) alteração na% de saturação ou PaO2 ( Figura 2 ). Apesar da redução do transporte de oxigênio pelo sangue, o consumo de oxigênio nos tecidos provavelmente apresentará poucas alterações e é mantido por vários fatores compensatórios, incluindo maior débito cardíaco e maior extração de oxigênio pelos tecidos. Consequentemente, o sangue & # x0201creserve & # x0201d de oxigênio é diminuído e o conteúdo de oxigênio venoso, saturação e pressão parcial estão todos abaixo do normal.

ODCs em um sujeito teórico com concentração de anemia e hemoglobina (Hb) de 7,5 & # x02005g & # x02009 & # x022c5 & # x02009dL & # x022121 em comparação com a concentração de hemoglobina normal de 15 & # x02005g & # x02009 & # x022c5 & # x02009dL & # x0221121 & # x022c121. Quando o conteúdo de oxigênio é plotado contra PO2 a curva na anemia é reduzida em 50%, refletindo a redução pela metade da capacidade de transporte de oxigênio (oxigênio dissolvido é ignorado) quando SaO2 é traçado, as curvas anêmicas e normais são sobrepostas.

Hemoglobinopatias

Foi descrito um grande número de hemoglobinas anormais determinadas geneticamente, sendo uma das mais conhecidas a HbS, encontrada em pacientes com doença falciforme. Em indivíduos com hemoglobinopatia, as moléculas anormais compreendem uma proporção variável da hemoglobina total e, conseqüentemente, os efeitos são igualmente variáveis. Em comparação com a HbA adulta normal, as moléculas de hemoglobina anormais estão associadas a alterações do ODC que podem ser para a direita (hemoglobinas de baixa afinidade de oxigênio) ou para a esquerda (hemoglobinas de alta afinidade de oxigênio). A posição do ODC pode ser quantificada pelo P50, que é medido em vitro como a pressão parcial de oxigênio em uma saturação de 50%. o P50 de sangue adulto normal é de aproximadamente 26 & # x02005mmHg hemoglobinas de baixa afinidade são caracterizadas por P50 e hemoglobinas de alta afinidade por um nível inferior ao normal P50. Essas hemoglobinas anormais podem ter consequências importantes para o fornecimento de oxigênio aos tecidos, mas seus efeitos são atenuados por vários mecanismos compensatórios, um dos quais é a concentração de hemoglobina. Moléculas de alta afinidade - & # x000, por definição, liberam oxigênio menos prontamente do que o normal e, como a hipóxia tecidual é um estímulo para a produção de hemoglobina, os indivíduos afetados costumam ter policitemia. Em contraste, aqueles com hemoglobinas de baixa afinidade são geralmente anêmicos.

Envenenamento por monóxido de carbono

O CO compete reversivelmente com o oxigênio pelos sítios de ligação na molécula de hemoglobina, mas a hemoglobina tem uma afinidade muito maior (cerca de 200 vezes) para o primeiro e uma grande proporção dos sítios de ligação serão ocupados pelo CO, mesmo em baixa pressão parcial de CO. Além disso, a presença de carboxihemoglobina resulta em um deslocamento da ODC para a esquerda, comprometendo ainda mais o fornecimento de oxigênio aos tecidos.

Os índices usuais de oxigenação são potencialmente enganosos no envenenamento por CO em particular, PaO2 é provável que permaneça normal e a saturação também pode parecer normal quando medida como SpO2 já que a maioria dos oxímetros de pulso (que utilizam apenas dois comprimentos de onda de luz) medem a carboxihemoglobina junto com a oxihemoglobina. & # x000adDistinction é & # x000adpossível usando um oxímetro de pulso de CO específico, que utiliza vários comprimentos de onda, mas tais dispositivos não estão amplamente disponíveis [5]. Na suspeita de intoxicação por CO, a carboxihemoglobina deve ser medida em uma amostra de sangue por espectrofotometria de comprimento de onda múltiplo, incorporada nos modernos analisadores de gases sanguíneos. A ligação do CO à hemoglobina é reversível e pode ser reduzida aumentando o valor inspirado (e consequentemente o arterial) PO2. Pacientes com intoxicação por CO são, portanto, tratados com a maior concentração possível de oxigênio inspirado, às vezes o oxigênio hiperbárico é empregado com o fundamento de que quanto maior o PaO2, mais moléculas de CO serão deslocadas de haemo & # x000adglobina e que o aumento na quantidade muito pequena de oxigênio dissolvido em níveis muito elevados PaO2, pode ajudar a sustentar a vida [6].


Degradação

Assim que os glóbulos vermelhos completam sua vida, eles são absorvidos pelas células do sistema reticuloendotelial, principalmente no fígado e no baço. Essas células destroem os glóbulos vermelhos e a hemoglobina sofre degradação.

As partes heme e globina são separadas. As cadeias de globina são recicladas ou quebradas em aminoácidos individuais pela ação de enzimas proteases.

Os grupos heme são degradados para formar bilirrubina pelas enzimas microssomais nos macrófagos. A degradação do heme envolve as seguintes etapas

  • A enzima heme oxigenase converte heme em biliverdina
  • A enzima biliverdina redutase reduz a biliverdina para formar bilirrubina

A bilirrubina assim formada é liberada no sangue. Como a bilirrubina é insolúvel em água, ela é imediatamente ligada pela albumina para formar um complexo bilirrubina-albumina. Este complexo transporta a bilirrubina para os hepatócitos, onde é convertida em diglucuronídeo de bilirrubina solúvel em água. O diglucuronido de bilirrubina é então liberado na bile.

A bilirrubina é convertida em alguns outros metabólitos à medida que passa pelo sistema digestivo.


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Quando usados ​​em combinação com o All-in-One SYBR & reg Green qPCR Mix, os primers All-in-One oferecem alto desempenho confiável e reproduzível em ensaios quantitativos de PCR.

Curvas de amplificação
Curvas de fusão Resultado da validação da eletroforese em gel de agarose

Figura 3. Quarenta e cinco pares de primers qPCR All-in-One & trade específicos de gene foram experimentalmente validados para produzir um único pico de curva de dissociação e gerar uma única amplificação do tamanho correto para os genes-alvo. Um pool de cDNA, contendo produtos transcritos reversamente de RNA total de 10 tecidos humanos diferentes (pulmão, fígado, testículo, ovário, baço, cérebro, placenta, pâncreas, coração e mamário), foi usado como o modelo de validação qPCR. qPCR foi realizada usando primer 0,2 & microM com 2X All-in-One qPCR Mix. As reações foram incubadas durante 10 min. a 95 & degC, seguido por 40 ciclos de 95 & degC por 10 seg. 60 e degC, 20 seg. e 72 e degC, 15 seg. usando o instrumento Bio-Rad iQ5. No final do último ciclo, a temperatura foi aumentada de 72 para 95 ° C para produzir uma curva de fusão. Curvas de amplificação, curvas de fusão e eletroforese em gel de agarose (resultado de validação para positivo na faixa ímpar e nenhum controle de modelo (NTC) na faixa par) mostrado para as 10 amostras.

* A amplificação não específica e a ausência de dímeros de primer são garantidas quando os primers de PCR validados All-in-One e a mistura de PCR são usados ​​juntos.
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Resultados

A estratégia do sistema de três equações

Como podem estimativas confiáveis ​​para o eu, KR e KT Parâmetros mecanísticos MWC das curvas de saturação de hemoglobina podem ser obtidos? Como apontado acima, estimativas confiáveis ​​para o Lc 4 e LKR 4 parâmetros compostos podem ser obtidos ajustando os dados de saturação de hermoglobina (como uma função de [S]) a uma equação MWC modificada [33]. o Lc 4 e LKR 4 parâmetros, com seus valores estimados, representam duas equações com três incógnitas. Percebendo os valores dos três eu, KR e KT parâmetros de cada curva de saturação de hemoglobina nos conjuntos de dados, portanto, requer uma terceira equação. Usando a condição inicial de meia saturação (onde), adicionamos uma terceira expressão delineando a dependência do ponto médio de transição MWC ([P50] MWC) no eu, KR e KT parâmetros do modelo. Um sistema de três equações (TES) com três incógnitas é assim obtido que é tratável para uma solução analítica (ver Métodos). Os extensos conjuntos de dados evolutivos e fisiológicos para a hemoglobina compilados na meta-análise da função da hemoglobina [33] oferecem a possibilidade de testar o desempenho da estratégia TES. Estimativas para os valores do composto Lc 4 e LKR 4 e p50 parâmetros para 27 curvas de saturação de oxigênio de hemoglobina de mamíferos, todas obtidas em condições fisiológicas semelhantes (o conjunto de dados evolutivo), e para curvas de saturação de oxigênio da hemoglobina humana obtidas em uma variedade de condições experimentais (eu.e., pH diferente, CO2 pressão e concentrações de 2,3-bisfosfoglicerato (2,3-BPG), o conjunto de dados fisiológicos) foram relatados anteriormente [33].

A estratégia TES produz estimativas confiáveis ​​para os parâmetros MWC das curvas do conjunto de dados evolutivos da hemoglobina

A estratégia acima foi inicialmente aplicada ao conjunto de dados evolutivos da hemoglobina. Cada curva de saturação de oxigênio de hemoglobina de mamífero é caracterizada pelas três equações acima, com seus y1, y2 e y3 valores listados na ref. [33]. Resolver tal sistema de três equações para cada hemoglobina de mamífero no conjunto de dados deve render até quatro raízes para cada parâmetro, como esperado para um sistema de equações à quarta potência. De fato, dos 27 sistemas de equações resolvidos para o conjunto de dados evolucionário, 17 apresentaram duas raízes reais distintas e duas raízes não reais. Outros 10 sistemas apresentaram apenas uma raiz real e duas raízes imaginárias, aparentemente refletindo a convergência das duas raízes reais. Valores para as duas raízes reais do eu, KR e KT os parâmetros para todas as 27 curvas de saturação do conjunto de dados são relatados na Tabela 1. Como pode ser visto, os dois conjuntos de soluções reais são claramente distintos um do outro. Enquanto um conjunto é revelado eu, KR e KT valores que parecem fisiologicamente corretos (Tabela 1, colunas da direita em vermelho), o outro não (Tabela 1, colunas da esquerda). Por exemplo, a hemoglobina eu os valores do conjunto de soluções fisiologicamente corretas variaram de 10 4 -10 9, como normalmente relatado na literatura [3,11], enquanto aqueles do conjunto não fisiológico todos agrupados em torno eu =

1 (Tabela 1). O mesmo é verdade para a afinidade relativa c parâmetro (= KR/KT) Considerando que no conjunto fisiologicamente correto, a faixa obtida de c valores (10 −2 –10 −3) foi compatível com os valores relatados para hemoglobina [3,11], o conjunto de solução não fisiológica exibiu valores de razão de afinidade muito mais elevados para quase todas as curvas, no intervalo de 0,1–0,3 (Tabela 1 ) Além disso, os 17 sistemas de mamíferos que compõem o conjunto de solução fisiologicamente sólida continham três triplicados independentes para hemoglobina humana, obtidos de diferentes laboratórios (ver referências na Tabela 1), fornecendo assim um controle interno para validar nossa estratégia. Como pode ser visto na Tabela 1, relativamente semelhantes eu e c os valores foram obtidos para cada repetição nos triplicados humanos que estão em boa concordância com os relatados na literatura (