Em formação

Aula 16: Replicação do DNA - Biologia

Aula 16: Replicação do DNA - Biologia


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Aula 16: Replicação de DNA

Aula 16: Replicação do DNA - Biologia

C2005 / F2401 '06 - Aula 1 6 - Última edição: 01/11/2006 18:28
Copyright 2006 Deborah Mowshowitz e Lawrence Chasin Departamento de Ciências Biológicas da Columbia University New York, NY.

I. Como o DNA bacteriano é transmitido? (Esta é uma repetição do tópico IV da aula 15).

A. Introdução à divisão celular - Como 1 célula faz 2?

1. Como você duplica o conteúdo das células? Considere o dogma central - nós cobrimos tudo - como dobrar DNA, RNA e proteína, e como regular a síntese protéica. Depois de dobrar a proteína (enzimas), isso permite dobrar tudo o mais, como carboidratos, lipídios, etc. Então, suponha que você dobre tudo na célula. Como você obtém 2 células de 1?

2. Por que a distribuição de DNA é a questão crítica - Fazer duas células a partir de uma se reduz a & quotuma vez que o programa é duplicado, como as duas cópias são distribuídas às células-filhas? & Quot Coisas que não fazem parte do programa (material genético) não precisam ser divididas exatamente, mas por causa do frango e problema de ovo, deve haver algum em cada célula filha. (Precisa de alguns ribossomos, RNA polimerase etc. em cada célula. Mas, contanto que você tenha alguns, e o material genético, você sempre pode fazer mais ribossomos, enzimas etc.)

B. Como os procariontes fazem isso? fissão binária - segregação regular do cromossomo circular ligado à membrana

1. Qual é a aparência do DNA (informação genética) de uma bactéria? Cada bactéria tem uma molécula de DNA circular de fita dupla = cromossomo o cromossomo está ligado à membrana celular.

2. Como o DNA cromossômico é distribuído.

uma. Para começar, você tem uma célula com um círculo de DNA de fita dupla anexado à membrana.

b. DNA replica por replicação birecional de DNA (dois garfos começam em uma única origem) - & gt dois círculos de fita dupla, ambos presos à membrana. (Ver Becker fig. 19-5 (17-5))

c. Os círculos se separam conforme a membrana é colocada entre os pontos de fixação do DNA à membrana - & gt dois círculos empurrados para extremidades opostas da célula. (Há também um processo ativo, diferente do crescimento da membrana, que separa as duas origens da replicação do DNA. Isso só foi descoberto recentemente.)

d. Para terminar, você só precisa estabelecer uma membrana (e parede) entre as duas metades da célula, cada uma contendo um círculo (= cromossomo de fita dupla completo). Este & # 8594 2 células completas.

e. Observe que isso não é mitose OU meiose é um processo diferente (fissão binária). Mitose e meiose ocorrem apenas em eucariotos, elas serão discutidas posteriormente.

f. Como o material genético nas duas células-filhas será comparado? Se não houver mutações, será o mesmo e todos os descendentes serão idênticos. Todos os descendentes produzidos desta forma (por reprodução assexuada de um único fundador) são chamados de clones. (Não importa se & quotfounder & quot é uma célula, molécula ou organismo.) Existe alguma maneira (além da mutação) de obter novas combinações de genes? Para misturar genes de clones separados? Isso requer sexo bacteriano.

II. Introdução ao sexo bacteriano e recombinação de amp.

A. Qual é a definição biológica de sexo? Qualquer método para trocar genes e / ou passar DNA de organismo para organismo. A mutação produz variantes, a reprodução sexual (re) embaralha-as e produz novas combinações.

Para fotos, consulte Purves 13.9 a 13.11 ou Becker 20-19 a 20-21 (18-19 a 18-21 na 5ª ed.)

O Problema 11-1, experimentos (1) a (3), dá exemplos de todos os três métodos. (Você tem que descobrir qual é qual.)

C. Plasmídeos vs Fragmentos. Veja o folheto 16B, abaixo.

1. Qual é a aparência dos pedaços de DNA transferidos? Duas possibilidades:

uma. Plasmídeos = pequenos minicromossomos circulares com sua própria origem de replicação.

b. Fragmentos = DNAs lineares curtos com (quase sempre) nenhuma origem de replicação.

2. Que diferença isso faz? Veja o folheto 16B, embaixo - & quotplasmídeo vs fragmento & quot.

uma. Plasmídeos são herdados - A descendência obtém cópias do cromossomo e a peça adicionada (o plasmídeo). Portanto, a progênie é diplóide parcial. Os plasmídeos são geralmente replicados e passados ​​para toda a progênie, como o cromossomo regular (mas não tão eficientemente, veja abaixo).

b. Fragmentos não são herdados - A peça adicionada (o fragmento) não é replicada e geralmente está degradada, portanto, apenas o cromossomo é transmitido. A progênie é haplóide.

III. Destino do DNA transferido - Detalhes para plasmídeos vs fragmentos

A. O que acontece com os plasmídeos?

1 . Importância das Origens. Os plasmídeos têm origens de replicação de DNA. Portanto, eles são replicados e transmitidos a quase todos os descendentes. (Fragmentos de DNA, por outro lado, geralmente não são replicados e são perdidos e / ou degradados com bastante rapidez, conforme explicado abaixo).

2. Terminologia (lembrete): Uma bactéria com um plasmídeo carregando alguns genes "extras" é chamada de diplóide parcial. O diplóide parcial possui duas cópias dos genes & quotextra & quot - uma cópia no plasmídeo e uma no cromossomo.

3. Por que os plasmídeos tendem a se perder. O controle da duplicação e distribuição de plasmídeos pode não ser tão rígido quanto para os cromossomos e / ou as consequências da perda não são tão graves. (Considere: o que acontece com uma célula que não obtém nenhum cromossomo? Nenhum plasmídeo?) Por causa de erros na replicação e / ou distribuição de plasmídeos, um descendente às vezes não obtém uma cópia do plasmídeo. A perda é um evento raro, mas os plasmídeos tendem a se perder grandeperíodos de tempo - à medida que as bactérias crescem, o número de bactérias sem plasmídeos aumenta gradualmente - A MENOS que haja seleção contra a perda do plasmídeo.

4. Detalhes de seleção. Seleção significa que há uma vantagem (para a bactéria) de reter o plasmídeo (ou uma desvantagem de perdê-lo), de modo que as bactérias com o plasmídeo tendem a sobreviver e as bactérias sem o plasmídeo tendem a morrer. As condições seletivas (como a presença de um antibiótico, a ausência de um aminoácido, etc.) não afetam a chance de que uma célula individual irá perder um plasmídeo, mas as condições seletivas Faz afetar a chance de sobrevivência de uma bactéria que perdeu seu plasmídeo.
Por exemplo, considere a resistência a antibióticos. Muitos genes que conferem resistência aos antibióticos (codificando para proteínas que destroem os antibióticos, impedem sua absorção, etc.) são encontrados em plasmídeos, não no cromossomo. Quando as bactérias (que carregam os genes de resistência em um plasmídeo) são cultivadas na presença de um antibiótico, há seleção contra bactérias que não são resistentes porque perderam seus plasmídeos. As bactérias sem plasmídeos morrem e apenas as bactérias que retiveram seus plasmídeos crescem. Portanto, virtualmente todas as bactérias da cultura possuem plasmídeos, geração após geração.
Se não houver antibiótico por perto, não haverá seleção contra as células que perderam seu plasmídeo (elas continuarão a crescer) e as bactérias na cultura perderão gradualmente seus plasmídeos. (Pode até haver seleção para perda de plasmídeos - na ausência de drogas, as células sem plasmídeos podem crescer mais rápido.) Observe que a seleção de bactérias portadoras de plasmídeos resistentes a drogas foi acidentalmente realizada (com muita eficiência) em hospitais.

Para revisar os plasmídeos, resolva o problema 11-2.

B. O que acontece aos fragmentos de DNA que são transferidos / transmitidos?

1. A pergunta - Para que servem os fragmentos ? Os plasmídeos podem ser replicados e transmitidos a todos os descendentes (veja acima), mas o que acontece com os fragmentos? Os fragmentos geralmente não têm uma origem de replicação, portanto, não são replicados. (Veja o folheto 16B inferior - "plasmídeo vs fragmento".) Além disso, os fragmentos lineares são geralmente degradados por enzimas, portanto, não só não são replicados - eles são degradados e os nucleotídeos são reciclados. Então, para que servem os fragmentos?

2. A resposta - recombinação. Partes de um fragmento podem ser unidas ao DNA do cromossomo e substituir a peça equivalente (homóloga). (Veja o final do folheto 16A.) Este processo é chamado de & quotcruzando & quot ou & quotgenética recombinação & quot - ele produz um cromossomo com uma nova combinação de genes. O novo cromossomo ou bactéria é, portanto, chamado de "recombinante". (Purves 13.9)

uma. Como funciona a recombinação? Isso requer duas coisas.

  • Enzimas para emparelhar, cortar e unir os dois DNAs envolvidos.

  • Homologia entre os dois DNAs.

(1). Definição: Os DNAs devem ser homólogos a fim de emparelhar para que o cruzamento possa ocorrer. O que significa homologia? Significa muito semelhante, mas não necessariamente o mesmo. Os DNAs que carregam os mesmos genes (que codificam as mesmas proteínas) são chamados de homólogos. Os DNAs homólogos carregam os mesmos genes na mesma ordem (digamos, para beta-galactosidase ou triptofano sintetase, etc.), mas não necessariamente os mesmos versõesdos genes.

(2) Um exemplo: Um DNA pode carregar a informação para fazer (por exemplo) uma forma de trip sintetase ou & # 946-galactosidase e o DNA homólogo pode carregar a informação para fazer uma versão ligeiramente diferente da mesma enzima. As duas formas do DNA serão quase, mas não exatamente iguais, e as duas formas da proteína também serão muito semelhantes.

Outro exemplo: considere o gene (seção do DNA) que codifica a cadeia beta da hemoglobina. Uma versão do gene (& # 946UMA) carrega a informação para formar a cadeia beta da hemoglobina A (glutâmica na posição 6) enquanto outra versão do mesmo gene (& # 946S) carrega a informação para formar a cadeia beta da hemoglobina S (valina na posição 6). Essas duas versões do gene (& # 946UMA e & # 946S) são homólogos. Eles não codificam para duas proteínas diferentes - o código dos dois DNAs para duas versões diferentes do mesmo proteína - dois tipos diferentes de cadeias beta que diferem em apenas um ou dois aminoácidos em centenas. (Observação: as bactérias não produzem hemoglobina, este exemplo foi usado porque a HbA e a HbS foram discutidas anteriormente.)

(3) . Alelos. Diferentes versões alternativas do mesmo gene são conhecidas como alelos. Por exemplo, & # 946UMA e & # 946S são dois alelos diferentes do mesmo gene. No diagrama na parte inferior de 16A, & quotD & quot e & quotd & quot representam dois alelos do gene & quotDee & quot; & quotB & quot e & quotb & quot; dois alelos do gene & quotBee & quot; e assim por diante. D e d poderiam codificar para duas versões diferentes de alguma enzima, digamos, & # 946-galactosidase B e b poderiam codificar para duas versões diferentes de outra enzima, e assim por diante. As duas formas da enzima codificada por "D" e "d" devem ser muito semelhantes na sequência de aminoácidos e podem ou não ter funções muito semelhantes.

(4). Por que a homologia é necessária? O cruzamento entre genes não homólogos embaralharia a informação genética, o cruzamento entre genes homólogos não, porque troca partes equivalentes de informação. As proteínas de recombinação devem se ligar a DNAs homólogos e alinhá-los antes que o corte e o splicing possam ocorrer.

c. Enzimas. As enzimas que ajudam a emparelhar, cortar e unir o DNA são necessárias para a recombinação. Observe que são necessários dois eventos de corte e emenda para trocar uma seção no fragmento por uma seção no cromossomo.

d. Quando ocorre a recombinação?

4. Como o DNA é transferido de uma bactéria para outra

A. Transformação (também chamada de transfecção, especialmente em eucariotos)

1. Significado histórico. Explicado muito antes no curso (aula 10), que ocorre a transformação, a transformação pelo DNA foi uma das primeiras linhas de evidência de que o DNA é o material genético. Como o DNA de uma célula (digamos um PS + - veja a aula 10) converte ou transforma outra célula, digamos de PS- em PS +?

2. Processo Básico - Ver Purves 13.10 (a) ou Becker 20-19 (a) [18-19 (a)]

uma. Uma célula (o doador) morre e libera seu DNA cromossômico (que é dividido em fragmentos lineares). O DNA é liberado e quebrado naturalmente ou pelo cientista que está fazendo o experimento.

b. Outra célula (o receptor) assume o DNA liberado do meio, então o receptor tem um cromossomo completo mais um fragmento. (Veja o folheto 16A inferior - "integração do fragmento".) Observe que a transformação (como mostrado aqui) envolve a transferência de fragmentos lineares de DNA como vs transferência de um plasmídeo. Os plasmídeos podem ser transferidos por transformação em experimentos de laboratório, mas provavelmente não são frequentemente transferidos dessa forma na natureza.

c. Como a transformação é detectada? Por uma mudança no fenótipo do destinatário. No exemplo em 16A, o DNA do doador carrega o alelo B e o receptor original tinha o alelo b. Se a transformação ocorrer, o receptor será convertido de b em B. Para que a transformação seja detectada, a mudança no genótipo de b para B deve causar alguma mudança no fenótipo que possa ser medida - por exemplo, deve conferir a capacidade de crescer sob novos condições, ou a capacidade de formar colônias de diferentes formatos e / ou a capacidade de causar doenças (como para PS- a PS +), etc.

Para revisar a transformação, consulte o problema 11-1.

B. Conjugação - uma espécie de acasalamento entre dois tipos de bactérias. Veja Purves 13.11 ou Becker fig. 20-20 e 20-21 (18-20 e 18-21).

4. Cópia do DNA, não original, é transferida . Se a única cópia do DNA for transferida, isso pode ser suicídio. Assim, uma cópia é transferida, seja uma cópia de um plasmídeo ou uma cópia de parte do cromossomo. Portanto, o receptor pode obter um fragmento (de uma cópia de parte do cromossomo do doador) ou um plasmídeo. Veja Becker fig. 20-21 (18-21).

5. É necessário contato célula a célula. A conjugação, ao contrário da transformação, requer contato célula-célula e o DNA (cópia) é passado através de uma ponte que se forma temporariamente entre o par de células que se acasalam. Observe que a transferência é sempre de F + ou Hfr para F-, nunca o contrário ou de F + para F +, F- para F- etc. Para fotos, consulte Becker fig. 20-20 (18-20) ou Purves 13.8.

6 Como os plasmídeos adquirem genes, como aqueles que codificam para resistência a medicamentos? Provavelmente cruzando com o cromossomo. Um único evento de corte e emenda entre dois círculos (como o cromossomo bacteriano e um plasmídeo) gera um grande círculo. Esse tipo de recombinação ocorre, juntando os dois círculos. O processo pode ser revertido, regenerando os dois círculos individuais. Se forem cometidos erros durante o evento de corte e emenda & quotreverse & quot, parte do DNA que costumava estar no cromossomo acabará no plasmídeo (ou vice-versa). Pensa-se que este processo (de unir e depois desmontar os dois círculos) é o que transfere os genes do cromossomo para o plasmídeo. A conjugação pode então transferir uma cópia do plasmídeo (com os genes adicionados), passando os genes adicionados de bactéria para bactéria como em (3) acima.

Os resultados de um experimento de acasalamento típico são apresentados no problema 11-9 . Lembre-se de que, em um Hfr, a cópia do cromossomo começa no meio do F integrado e segue em uma direção. O gene cromossômico que é copiado (e transferido) primeiro é determinado por onde o fator F é integrado ao cromossomo. A ordem de cópia e transferência depende da orientação do F no cromossomo. (O F pode ser inserido "voltado" para os dois lados. Em termos de modelo de tubo de borracha, a seta no meio do F pode apontar no sentido horário ou anti-horário ao redor do grande círculo.)

Para comparar transformação e conjugação, tente o problema 11-3. Um problema adicional envolvendo transformação é 11-15, partes A e B.

C. Transdução e ciclo de vida viral: (Para ciclo de vida viral, consulte o folheto 16 A ou Purves 13.2). Para transdução, veja Becker fig. 20-19b (18-19b). Os principais pontos a serem observados sobre o ciclo de vida são os seguintes:

1. Estrutura & amp Inércia - Os vírus têm um tipo de ácido nucléico (DNA ou RNA, de fita simples ou dupla) que serve como informação genética, e uma casca de proteína (ou cabeça). Os vírus têm informações genéticas, mas não têm meios de expressá-las - nenhum ribossomo, nenhuma maneira de gerar ATP. Consulte Purves 13.2 para alguns exemplos de estruturas de vírus.

2. Especificidade do hospedeiro depende da proteína da casca - a ligação do vírus à superfície da célula hospedeira requer a correspondência entre as estruturas complementares na proteína principal e a superfície da célula, quais células um vírus irá atacar, é amplamente determinado por essas interações.

3. Como o vírus assume o controle . Em muitos vírus, apenas o ácido nucleico entra na célula hospedeira. Uma vez dentro, o ácido nucleico viral usa as enzimas (e o ATP) do hospedeiro para a transcrição e tradução de sua própria informação genética. A informação genética viral direciona a síntese de materiais (principalmente proteínas) para favorecer sua própria reprodução em detrimento da reprodução do hospedeiro. Alguns vírus produzem proteínas que quebram o DNA do hospedeiro, outros produzem enzimas que ajudam a lisar (quebrar) a célula hospedeira, etc. Veja Purves 13.3 para saber como o bacteriófago (vírus bacteriano) assume 13,4 e 13,5 para ciclos de humanos mais complexos vírus.

4. Reprodução da linha de montagem. Os vírus geralmente se reproduzem em uma linha de montagem - eles acumulam suprimentos de todas as partes (ácido nucléico e proteínas estruturais) e, em seguida, os montam como uma última etapa. Eles não dobram de tamanho e depois se dividem pela metade da mesma forma que as células. Este método de automontagem significa que os vírus recombinantes podem ser montados em um tubo de ensaio a partir de fontes separadas de proteínas + ácido nucléico (modificado em um laboratório).

5. Lytic Cycle & amp Plaques.

uma. A reprodução do vírus é um ciclo. Uma partícula de vírus infecta uma célula, o vírus se reproduz dentro da célula, a célula infectada libera partículas virais descendentes que infectam células vizinhas e assim por diante. Muitos vírus lisam (se abrem) e matam suas células hospedeiras, outros não matam a célula hospedeira, mas fazem com que ela liberte partículas virais.

b. Lysis. Quando as células hospedeiras lisam (se abrem) e liberam partículas virais descendentes, o ciclo resultante é chamado de ciclo lítico. Se os vírus estão crescendo sobre uma camada sólida de bactérias (& quot; gramado & quot), o resultado é uma placa - um buraco no gramado que está cheio de vírus descendentes. Uma única bactéria em uma placa de Petri forma uma colônia (um caroço) - um único vírus bacteriano pousando em um gramado de bactérias forma uma placa (buraco).

c. Descoberta de 'Phage'. Os vírus bacterianos foram descobertos pela capacidade de formar placas. Eles foram chamados de "bacteriófagos" porque eram "buracos" no gramado das bactérias. (Observação: o termo bacteriófago - ou fago, para abreviar - é usado apenas para vírus bacterianos. Os vírus que infectam outros organismos são chamados de vírus, não fagos.)

6 . Transdução --Por causa do método de linha de montagem de reprodução viral, pedaços de ácido nucléico bacteriano podem, às vezes, ser acondicionados acidentalmente dentro de um revestimento viral. Esse vírus é um 'fago falso' - na verdade, é um invólucro de vírus contendo DNA bacteriano, não viral. Se essa partícula de vírus (falsa) infectar outro hospedeiro, ela entrega o DNA bacteriano ao segundo hospedeiro e não destrói a célula receptora. Este é um caso de transdução - o vírus agiu como um agente involuntário de transferência de DNA bacteriano. (Purves 13,10 (b))

Para revisar o ciclo lítico, consulte o problema 11-4.

7. Ciclo lisogênico

uma. Integração. Alguns vírus podem se tornar parte do cromossomo hospedeiro cruzando o DNA viral e o DNA bacteriano - o processo é paralelo ao modo como um plasmídeo como o fator F se junta ao cromossomo bacteriano. (Os vírus, como os plasmídeos, podem pegar genes bacterianos pelo reverso desse processo.)

b. Lisogenia. O vírus integrado pode permanecer inativo por longos períodos de tempo. Esse estado dormente é conhecido como lisogenia, e uma bactéria com um vírus integrado e dormente é considerada lisogênica (capaz de entrar no ciclo lítico). O que impede o vírus de produzir proteínas virais e entrar no ciclo lítico? Uma proteína repressora produzida pelo próprio vírus. (Esta proteína repressora não é alostérica, deve ser destruída para inativada. A degradação da proteína repressora permite que o vírus saia do estado dormente e entre no ciclo lítico.) Jacob, Lwoff e Monod receberam o Prêmio Nobel de Fisiologia em 1965 por descobrir como os repressores controlam os operons e a lisogenia.

c. Retrovírus. Esses são vírus (não necessariamente de procariotos) que contêm RNA na partícula viral. Quando o RNA entra na célula, ele usa uma enzima especial produzida pelo vírus, a transcriptase reversa, para fazer uma cópia do DNA do RNA. (A transcriptase reversa é transportada para o hospedeiro dentro da partícula viral.) O DNA então se insere no cromossomo do hospedeiro e permanece dormente, da mesma forma que um vírus lisogênico. HIV, o vírus que causa a AIDS, é um retrovírus humano. A transcriptase reversa obtida de retrovírus é usada em laboratório como uma ferramenta importante para fazer cópias de DNA de RNA. (Os exemplos serão discutidos na próxima vez.) Para o ciclo de vida do HIV, consulte Purves 13.5. O Prêmio Nobel de Fisiologia de 1975 foi concedido a Dulbecco, Temin & amp Baltimore em 1975 pela descoberta da transcriptase reversa em vírus causadores de tumor.

8. Cruzamentos virais --Se uma célula for infectada simultaneamente com duas variantes (mutantes) do mesmo vírus, pode ocorrer cruzamento e / ou complementação entre os dois vírus durante o curso da infecção. Veja Becker fig. 20-18 para recombinação. (O reasortment também pode ocorrer no caso do vírus da gripe, que tem um genoma de RNA segmentado em 8 pedaços. Consulte a página do CDC para obter mais detalhes. Para o ciclo de vida de um vírus de RNA, consulte Purves 13.4). Discutimos como ocorre o crossing-over, mas o que é complementação e como você a distingue da recombinação?

V. Complementação e Recombinação - as consequências de ter DNA "extra".

1. A configuração física: Você precisa de duas cópias dos genes que deseja testar. Uma célula bacteriana normal é haplóide - tem uma cópia de cada gene ou trecho de DNA. Portanto, você precisa de um diplóide parcial com algum DNA & quotextra & quot. Isso pode ocorrer como resultado de engenharia genética, conjugação, transformação, etc., e a peça "extra" pode ser um plasmídeo ou um fragmento. (Portanto, a diploidia parcial pode ser um estado permanente ou temporário.) O diploide parcial tem uma cópia da maioria dos genes (no cromossomo), mas tem duas cópias de alguns genes. Para esses poucos genes, há uma cópia do (s) gene (s) no cromossomo e uma cópia no DNA extra.

2. A questão: Agora, suponha que cada cópia diplóide do DNA (presente em duas cópias) tenha uma mutação, de modo que nenhum dos DNAs sozinho tenha informações genéticas corretas e funcionais para realizar alguma função. (Ou seja, nenhum DNA pode codificar para as proteínas e / ou RNAs necessários para realizar alguma função). A célula com as duas cópias diferentes será capaz de realizar a função de que estamos falando?

Veja o folheto 16B para 4 casos possíveis, A a D. Em A e C, há apenas um gene a ser considerado (ou o número de genes é irrelevante); nos casos B e D, há dois genes a serem considerados.

Observe que cada linha no diagrama do folheto representa uma molécula de DNA de fita dupla e que os dois DNAs mostrados em cada caso devem ser homólogos. As 2 linhas em cada caso NÃO são as duas vertentes de uma dupla hélice. Isso significa que o crossing over (recombinação) requer o corte e a junção de moléculas de DNA de fita dupla; estamos ignorando os detalhes de como isso funciona. (Isso é discutido longamente em Genética.)

B. Como você pode restaurar a função?

uma. Como funciona: Se o cruzamento pode ocorrer entre os dois DNAs, então você pode regenerar um DNA que não tem mutações cortando e unindo os dois DNAs. Isso funcionará desde que as duas mutações estejam em lugares diferentes no DNA (não sobrepostos) como nos casos A, B e D. Não importa se as duas mutações estão no mesmo gene ou não - desde que como não se sobrepõem, o cruzamento pode produzir um recombinante normal sem mutações.

b. Quando você precisa de recombinação (como vs complementação) para restaurar a função? A recombinação geralmente é a única maneira de restaurar a função (a longo prazo) se houver uma mutação no cromossomo e outra em um fragmento. O cruzamento deve gerar um cromossomo não mutante. (Não ajuda ter um fragmento não mutante, pois o fragmento será perdido se não for integrado.) Observe que pode ser necessário mais de um evento de corte e emenda para gerar um cromossomo recombinante.

c. Frequência. Se as 2 mutações estiverem próximas uma da outra no DNA, o cruzamento entre elas será raro. (Mais sobre a frequência de passagem em uma palestra ou duas.) No entanto, geralmente é possível selecionar e detectar até mesmo recombinantes muito raros, estabelecendo condições em que apenas o recombinante crescerá. (Observe que a complementação não depende de um evento raro.)

uma. Como funciona: Se ambos os DNAs podem permanecer na célula, e cada um tem uma mutação em uma unidade funcional diferente (caso B), então a célula com os dois DNAs mutantes deve ser capaz de funcionar normalmente. Em outras palavras, se cada DNA tem uma mutação em um gene diferente, os dois DNAs entre eles têm pelo menos uma cópia boa de cada gene, podem fazer todos os RNAs e peptídeos necessários e podem fazer o trabalho que precisa ser feito. Neste caso, diz-se que os dois DNAs mutantes se complementam. (O gene superior esquerdo & quotcobre & quot para o inferior esquerdo, que é mutante, e o gene inferior direito cobre para o superior direito, que é mutante.)

b. Quando não funciona: Se dois DNAs estiverem presentes, mas ambos tiverem mutações no mesmo gene (não necessariamente no mesmo lugar), como no caso D, a complementação não restaurará a função. A célula tem duas cópias defeituosas (e nenhuma cópia boa) de um gene e o trabalho correspondente não será realizado.

c. Frequência: Um evento raro não é necessário aqui - contanto que ambos os DNAs estejam presentes e tenham defeitos complementares, a função será restaurada.

  • Com um plasmídeo: a complementação geralmente ocorre entre uma mutação no cromossomo e uma mutação em um plasmídeo porque ambos os DNAs podem permanecer indefinidamente - o plasmídeo e o cromossomo podem ser replicados e transmitidos à progênie.
  • Com um fragmento: Transiente a complementação pode ocorrer entre uma mutação no cromossomo e uma mutação em um fragmento de DNA adicionado. A complementação com um fragmento não dura muito e não é transmitida à progênie, pois o fragmento está degradado e / ou não replicado.

Para obter mais detalhes sobre como diferenciar complementação e recombinação, consulte o gráfico no folheto 16B e tente os problemas restantes no conjunto de problemas 11. Um bom lugar para começar é com os problemas 11-5 e 11-6.

3. Complementação e recombinação podem ocorrer tanto com vírus quanto com bactérias. Dois mutantes do mesmo vírus podem infectar uma célula ao mesmo tempo. Isso permite que você teste a ocorrência de complementação e / ou recombinação entre os dois DNAs mutantes.

Para ver um exemplo, consulte o problema 11-8. (Para mais problemas envolvendo compl. & Amp recomb. Em vírus, consulte 11-10 a 11-13.)

4. Terminologia. Isso pode não ser abordado em aula, mas é útil para entender a complementação.
uma. Cistron. O termo & quotgene & quot é usado de mais de uma maneira. O termo "cistron" é usado (como um termo mais específico do que gene) para significar um trecho de DNA que codifica para um componente de função (um componente = um polipeptídeo, ou um tRNA, etc.) Todas as mutações que NÃO complementam cada uma outros são atribuídos ao mesmo & quotgrupo de implementação & quot (ver d abaixo) e devem estar localizados no mesmo cistron.

b. Genótipo e fenótipo. Dois mutantes podem ter a mesma aparência e / ou função (digamos, ambos ser his- ou incapazes de fazer a dele) e ter mutações diferentes em seu DNA. Portanto, você deve distinguir entre genótipo (estado do DNA) e fenótipo (estado de função e / ou aparência). Os testes descritos aqui permitem obter informações sobre os genótipos de 2 mutantes com o mesmo fenótipo (digamos his- para bactérias ou falha na formação de placas no caso de vírus). Os mutantes têm defeitos no mesmo gene? Em caso afirmativo, os defeitos estão no mesmo lugar no DNA? Veja os problemas para exemplos.

c. Complementação. O termo "complementação" é normalmente usado para se referir à restauração da função quando duas cópias mutantes separadas do DNA estão presentes em uma única célula. (É assim que é usado em todos os problemas.) No entanto, o termo às vezes é usado para se referir a uma situação ligeiramente diferente na qual a função é restaurada pela adição de DNA adicional (normal) a uma célula com uma mutação. Nestes casos, várias partes diferentes de DNA são adicionadas, para ver qual (is) "complementa" ou restaura a função. Apenas pedaços de DNA adicionado com boas cópias do gene mutante irão "cobrir" ou "complementar" a mutação. Esse tipo de experimento é usado para identificar um pedaço de DNA que carrega uma cópia normal de um gene.

d. Grupos de complementação. Mutantes com o mesmo fenótipo são frequentemente atribuídos a "grupos de complementação". Todos os mutantes que não se complementam são atribuídos ao mesmo grupo. Todos os mutantes em um grupo de complementação devem ter mutações no mesmo gene e geralmente têm um defeito no mesmo polipeptídeo. Isso permite que você descubra quantos genes / polipeptídeos são necessários para realizar uma função específica. Suponha que você tenha muitos mutantes com um fenótipo específico - todos são defeituosos na mesma função geral, mas não necessariamente na mesma etapa. (Por exemplo, você tem muitos seus - mutantes - todos são incapazes de sintetizar histidina.) Você atribui os mutantes a grupos de complementação e, a partir do número de grupos, pode descobrir quantos genes / polipeptídeos são necessários para realizar a função (capacidade de sintetizar o seu).

Da próxima vez: Conclua a genética viral e bacteriana (se necessário) e, em seguida, as enzimas de restrição e a engenharia genética.

Copyright 2006 Deborah Mowshowitz e Lawrence Chasin Departamento de Ciências Biológicas da Universidade de Columbia, Nova York, NY.


Capítulo 16 - A base molecular da herança

  • O emparelhamento específico de bases nitrogenadas no DNA foi o flash de inspiração que levou Watson e Crick à dupla hélice correta.
  • O possível mecanismo para a próxima etapa, a replicação precisa do DNA, ficou claro para Watson e Crick a partir de seu modelo de dupla hélice.

Durante a replicação do DNA, o emparelhamento de bases permite que as fitas existentes de DNA sirvam como modelos para novas fitas complementares.

  • Em um segundo artigo, Watson e Crick publicaram sua hipótese de como o DNA se replica.
    • Essencialmente, como cada fita é complementar à outra, cada uma pode formar um modelo quando separada.
    • A ordem das bases em uma fita pode ser usada para adicionar bases complementares e, portanto, duplicar os pares de bases exatamente.
    • Um de cada vez, os nucleotídeos se alinham ao longo da fita modelo de acordo com as regras de emparelhamento de bases.
    • Os nucleotídeos são ligados para formar novas fitas.
    • Em seus experimentos, eles rotularam os nucleotídeos das fitas antigas com um isótopo pesado de nitrogênio (15N), enquanto quaisquer novos nucleotídeos eram indicados por um isótopo mais leve (14N).
    • Fios replicados podem ser separados por densidade em uma centrífuga.
    • Cada modelo - o modelo semiconservador, o modelo conservador e o modelo dispersivo - fez previsões específicas sobre a densidade das fitas de DNA replicadas.
    • A primeira replicação no meio 14N produziu uma banda de DNA híbrido (15N-14N), eliminando o modelo conservador.
    • Uma segunda replicação produziu DNA leve e híbrido, eliminando o modelo dispersivo e dando suporte ao modelo semiconservador.

    Uma grande equipe de enzimas e outras proteínas realiza a replicação do DNA.

    • A E. coli leva 25 minutos para copiar cada um dos 5 milhões de pares de bases em seu único cromossomo e se dividir para formar duas células-filhas idênticas.
    • Uma célula humana pode copiar seus 6 bilhões de pares de bases e se dividir em células-filhas em apenas algumas horas.
    • Este processo é extremamente preciso, com apenas um erro por dez bilhões de nucleotídeos.
    • More than a dozen enzymes and other proteins participate in DNA replication.
    • Much more is known about replication in bacteria than in eukaryotes.
      • The process appears to be fundamentally similar for prokaryotes and eukaryotes.
      • These enzymes separate the strands, forming a replication “bubble.”
      • Replication proceeds in both directions until the entire molecule is copied.
      • At the origin sites, the DNA strands separate, forming a replication “bubble” with replication forks at each end.
      • The replication bubbles elongate as the DNA is replicated, and eventually fuse.
      • The rate of elongation is about 500 nucleotides per second in bacteria and 50 per second in human cells.
      • Each has a nitrogenous base, deoxyribose, and a triphosphate tail.
      • ATP is a nucleoside triphosphate with ribose instead of deoxyribose.
      • The exergonic hydrolysis of pyrophosphate to two inorganic phosphate molecules drives the polymerization of the nucleotide to the new strand.
      • Each DNA strand has a 3’ end with a free hydroxyl group attached to deoxyribose and a 5’ end with a free phosphate group attached to deoxyribose.
      • The 5’ --> 3’ direction of one strand runs counter to the 3’ --> 5’ direction of the other strand.
      • A new DNA strand can only elongate in the 5’ --> 3’ direction.
      • The DNA strand made by this mechanism is called the leading strand.
      • Unlike the leading strand, which elongates continuously, the lagging stand is synthesized as a series of short segments called Okazaki fragments.
      • They can only add nucleotides to the 3’ end of an existing chain that is base-paired with the template strand.
      • The primer is 5–10 nucleotides long in eukaryotes.
      • RNA polymerases can start an RNA chain from a single template strand.
      • Another DNA polymerase, DNA polymerase I, replaces the RNA nucleotides of the primers with DNA versions, adding them one by one onto the 3’ end of the adjacent Okazaki fragment.
      • This untwisting causes tighter twisting ahead of the replication fork, and topoisomerase helps relieve this strain.
      • The lagging strand is copied away from the fork in short segments, each requiring a new primer.
      • For example, helicase works much more rapidly when it is in contact with primase.

      Enzymes proofread DNA during its replication and repair damage in existing DNA.

      • Mistakes during the initial pairing of template nucleotides and complementary nucleotides occur at a rate of one error per 100,000 base pairs.
      • DNA polymerase proofreads each new nucleotide against the template nucleotide as soon as it is added.
      • If there is an incorrect pairing, the enzyme removes the wrong nucleotide and then resumes synthesis.
      • The final error rate is only one per ten billion nucleotides.
      • DNA molecules are constantly subject to potentially harmful chemical and physical agents.
        • Reactive chemicals, radioactive emissions, X-rays, and ultraviolet light can change nucleotides in ways that can affect encoded genetic information.
        • DNA bases may undergo spontaneous chemical changes under normal cellular conditions.
        • Each cell continually monitors and repairs its genetic material, with 100 repair enzymes known in E. coli and more than 130 repair enzymes identified in humans.
        • A hereditary defect in one of these enzymes is associated with a form of colon cancer.
        • DNA polymerase and ligase fill in the gap.
        • These individuals are hypersensitive to sunlight.
        • Ultraviolet light can produce thymine dimers between adjacent thymine nucleotides.
        • This buckles the DNA double helix and interferes with DNA replication.
        • In individuals with this disorder, mutations in their skin cells are left uncorrected and cause skin cancer.

        The ends of DNA molecules are replicated by a special mechanism.

        • Limitations of DNA polymerase create problems for the linear DNA of eukaryotic chromosomes.
        • The usual replication machinery provides no way to complete the 5’ ends of daughter DNA strands.
          • Repeated rounds of replication produce shorter and shorter DNA molecules.
          • In human telomeres, this sequence is typically TTAGGG, repeated between 100 and 1,000 times.
          • Telomeric DNA tends to be shorter in dividing somatic cells of older individuals and in cultured cells that have divided many times.
          • If the chromosomes of germ cells became shorter with every cell cycle, essential genes would eventually be lost.
          • There is now room for primase and DNA polymerase to extend the 5’ end.
          • It does not repair the 3’-end “overhang,” but it does lengthen the telomere.
          • Telomere length may be a limiting factor in the life span of certain tissues and of the organism.
          • Cells from large tumors often have unusually short telomeres, because they have gone through many cell divisions.
          • This overcomes the progressive shortening that would eventually lead to self-destruction of the cancer.
          • Immortal strains of cultured cells are capable of unlimited cell division.

          Lecture Outline for Campbell/Reece Biology, 7th Edition, © Pearson Education, Inc. 16-1


          Inscreva-se gratuitamente para ver:

          • Este documento e mais de 3 milhões de documentos e flashcards
          • Guias de estudo de alta qualidade, notas de aula, exames práticos
          • Pacotes de curso escolhidos a dedo por editores, oferecendo uma revisão abrangente de seus cursos
          • Melhores notas garantidas

          GEN 3022 1st Edition Lecture 16 Outline of Last Lecture I Structure of bacterial chromosomes a Location b Overall shape structure i Loop domains ii DNA supercoiling II Organization of Eukaryotic chromosomes a Chromosome replication and segregation i Three types of DNA sequences b Compaction of DNA i Process interphase and metaphase ii Heterochromatin iii Euchromatin III Nucleosomes a Definition b Components i Histone proteins ii DNA Outline of Current Lecture I Overview of DNA replication These notes represent a detailed interpretation of the professor s lecture GradeBuddy is best used as a supplement to your own notes not as a substitute II III IV V VI VII VIII IX a Replication patterns i Antiparallel ii Chargraff s rule iii Semiconservative b Summary Proposed models of DNA replication a Conservative model b Semiconservative model c Dispersive model Experiment a E coli growth b Light and half heavy DNA types Origin of bacterial DNA replication a Origin of replication oriC b Patterns of bacterial DNA replication Synthesis of new DNA strands a DNA helicase b Topoisomerase II DNA gyrase c Primase d DNA Polymerases e Ligase Synthesis a Leading strands b Lagging strands c DNA polymerase I action d DNA ligase action Fidelity mechanisms a High fidelity in DNA replications i Three reasons b Proofreading activity of DNA polymerase Eukaryotic genomes Telomeres and DNA replication a Telomeric sequences b Telomerase c Telomere length and cancer Current Lecture I Overview of DNA replication a Replication patterns i Antiparallel one strand runs 5 to 3 and the other 3 to 5 ii Chargraff s rule A T C G iii Semiconservative one parent strand and one daughter strand II III IV V VI b Summary i Two complementary strands of DNA separate ii Each serves as a template strand for the synthesis of new complementary daughter DNA strands Proposed models of DNA replication a Conservative model both parental strands stay together after DNA replication b Semiconservative model the double stranded DNA contains one parental and one daughter strand following replication c Dispersive model parental and daughter DNA segments are interspersed in both strands following replication Experiment a E coli growth Meselson and Franklin Stahl investigated DNA replication using E coli i E coli was grown in the presence of a heavy isotope of nitrogen so that the population of cells all had heavy labeled DNA ii E coli was switched to a medium with only light isotope of nitrogen iii Density of resulting generations was analyzed to determine the pattern of replication b Light and half heavy DNA types i The first generation s DNA types were consistent with the dispersive model and semiconservative model but the second generation s types were only consistent with the semi conservative model Origin of bacterial DNA replication a Origin of replication oriC since bacterial chromosomes are circular there is only one origin of replication called the origin of Chromosomal replication oriC b Patterns of bacterial DNA replication synthesis of DNA proceeds bidirectionally around the chromosome until the replication forks meet and replication is terminated Synthesis of new DNA strands a DNA helicase responsible for separating the two template strands into a replication fork b Topoisomerase II DNA gyrase unwinds negative supercoiling of DNA so that it can be separated for replication c Primase creates RNA primer segments that covalently link to the template strand and are later removed by DNA polymerase I d DNA Polymerases responsible for DNA synthesis work in the 5 to 3 direction only and cannot initiate transcription DNA polymerase III is responsible for the most synthesis e Ligase covalently links Okazaki fragments of lagging strand by catalyzing formation of the phosphodiester bond Synthesis VII VIII IX a Leading strand strand that gets synthesized continuously using one RNA primer from 5 to 3 towards replication fork b Lagging strand strand that gets synthesized in fragments from 5 to 3 away from the replication fork c DNA polymerase I action removes RNA primer and fills in the gaps with newly synthesized DNA d DNA ligase action covalently links Okazaki fragments after DNA polymerase I fills in the gaps that are created by the removal of RNA primer Fidelity mechanisms a High fidelity in DNA replications mistakes during DNA replication are extremely rare DNA polymerase III makes only one mistake per every 108 bases made i Three reasons stability of base pairing structure of DNA polymerase active site proofreading function of DNA polymerase b Proofreading activity of DNA polymerase DNA polymerases can identify a mismatched nucleotide and remove it from the daughter strand The enzyme uses a 3 to 5 exonuclease activity to digest the newly made strand until the mismatched nucleotide is removed Eukaryotic genomes a Unlike bacterial genomes eukaryotic chromosomes are long and linear as opposed to circular b As a result they also have many origins of replication about every 100 000 base pairs Telomeres and DNA replication a Telomeric sequences i Sequences at the end of a chromosome that codes for the stop of replication ii Typically consist of moderately repetitive tandem arrays with a 3 overhang that is 12 16 nucleotides in length These nucleotides are generally many guanine and thymine b Telomerase i Since DNA polymerases can only work in the 5 to 3 direction and cannot initiate DNA synthesis a special enzyme telomerase is needed to complete replication ii There is not enough DNA at the end of a strand to allow for RNA primer to attach which prevents DNA replication from completion iii Telomerase builds on to the end of a DNA strand to allow for RNA primer to bind and for replication to finish c Telomere length and cancer i Telomere DNa is about 8 000 at birth and can shorten to 1 500 bp in an elderly person ii Telomeres shorten in actively dividing cells which makes some cells senescent loss of ability to divide Insertion of highly active telomeres can block senescence iii Cancer cells commonly carry mutations increasing activity of telomerase which prevents telomere shortening and senescence May be a target for anti cancer drug treatments


          AP Lecture Guide 16 – The Molecular Basis of Inheritance

          search was on for the chemical mechanism of inheritance. What are the two components of the chromosome?

          2. From initial logic, which component would be the most likely candidate for the genetic

          3. What did Griffith, Avery, and others accomplish with bacteria?

          4. Define transformation. _______________________________________________________

          5. What did the experiments done by Alfred Hershey and Martha Chase show?

          6. What are Chargaff’s rules?

          7. If a species has 35% adenine in its DNA, determine the percent of the other three bases.

          8. What was the role of Maurice Wilkins and Rosalind Franklin in determining the structure of

          9. Use the diagram to describe the structure of DNA. Include several comments.

          10. What is the advantage of the double stranded aspect of the DNA? ____________________

          11. Which model of DNA replication is accepted? ____________________________________

          12. What happens at the DNA replication fork?

          13. Make a list of the enzymes involved in replication and their role.

          14. Why does the DNA have to add nucleotides in the 5’ to 3’ direction?

          15. Label the diagram of DNA replication. Include the directions and the terms.

          16. Describe the “priming of the DNA” before replication. _______________________________

          17. List some of the steps involved in DNA repair. ____________________________________

          18. What is the problem that occurs at the ends of the chromosome during replication?

          19. What is a telomere and its role in cell division. ____________________________________

          20. Why was there no selection pressure for prokaryotes to evolve a telomere-like solution on

          their chromosome? _________________________________________________________

          21. Why is telomerase an active area in cancer research? _____________________________


          Lecture 16: DNA replication - Biology

          Chapter 7 --- DNA Replication

          Read about the complications involved in trying to replicate double-stranded DNA

          • The two strands are anti-parallel and this polarity has to be maintained
          • Requires energy for unwinding in addition to the reactions of adding the nucleotides
          • Single-stranded DNA will hybridize with itself if there is any complementarity
          • There are a number of reactions involved, thus it must require an number of enzymes
          • Replication errors occur, thus there have to be correction mechanisms
          • Some DNA is circular, some is linear and very, very long, so there are major physical constraints on how this can proceed.

          What is semi-conservative replication?

          • See figures 7-1 and 7-2.
          • Note the need for un-winding and then re-winding of the strands
          • Remember that DNA polymerase only moves in one direction: 5 3

          Replication of Circular DNA theta replication -- q replication

          • See figure 7-3 and 7-4
          • Helicase is the basic un-winding enyme, but this introduces significant super-coiling effects
          • Supercoiling is corrected by Topoisomerase
            • Topoisomerase I nicks one strand and relaxes the supercoil
            • Topoisomerase II Gyrase cuts both strands

            The picture you see is a three-dimensional reconstruction of a topoisomerase determined using data from X-ray crystallographic studies (blue, red, and yellow regions) from these data researchers can pinpoint the location of nearly every atom in the protein. The topoisomerase is modeled in the process of gripping a broken DNAduplex (shown in green) and transporting a second duplex (the multicolored rosette). This is part of the work carried out in the laboratory of JamesBerger in the Department of Molecular and Cell Biology .

            Once thought to be mere laboratory curiosities, topoisomerases are now known to be essential for the livelihood of all organisms, from viruses and bacteria to humans. Moreover, it is now known that topoisomerases are targets for a large number of clinically used drugs, including anticancer agents and antibiotics. These drugs block the enzyme after it has cleaved the DNA, causing lethal breaks in the organism's chromosome. Understanding the molecular mechanisms behind the drug's action remains an important research goal, one in which the power of X-ray crystallography will play a critical role to resolve drug/topoisomerase interactions at atomic resolution.

            Photo submitted by James Berger

            • Replication starts at the Origin of Replication Ori
            • Two types of replication (Figure 7-6)
              • De Novo which needs primers (RNA primers)
              • Rolling circle Covalent Extension (Figure 7-9)
                • OriC (Chromosomal origin of replication) is about 250 bp long see fig 7-7
                • It contains recognition sites for DNA binding proteins: Dna A and ATP
                  • This binding causes the denaturation of A+T rich sections of the ori and opens a bubble
                  • Unwinding in both directions is accomplished by helicase
                  • ssb single-stranded DNA binding proteins bind to the single strands and keep them from re-annealing
                  • RNA Primers are made:
                    • RNA polymerase on the leading strand
                    • RNA primase on the lagging strand

                    o Polymerase I and II can be largely thought of as repair enzymes

                    o Polymerase III is the major replication enzyme

                    Require a primer which provides a free 3 -OH group to hook the next nucleotide onto

                    Look over fig 7-11 to see the significance of a primer

                    Note that synthesis occurs 5 3 (fig 7-12)

                    Both pol I and pol III have proofreading ability

                    Called 3 5 exonuclease activity

                    If wrong base inserted, i.e., no base-pairing after synthesis, the pol goes backwards and chews out the mis-matched base and tries again. (See fig 7-13)

                    pol I only: has 5 3 exonuclease activity: It can chew up any DNA that it bumps into AS it is synthesizing new DNA.

                    This is important in a technique known as nick-translation (See fig. 7-14).

                    Compare the differences between pol I and pol III in table 7-1, page 131.

                    The Mechanics of Replication

                    o Study figure 7-15 and note that this scheme is impossible because:

                    All the known DNA replicating enzymes use the 3 -OH group as the growing end. (The 5 -PO4 end does not grow or elongate!)

                    o Instead, the scenario shown in figure 7-16 is believed to be the most common DNA replication mechanism. This is called the discontinuous model :

                    Lagging strand with many start sites. The direction of synthesis is away from the crotch of the replication fork.

                    Many fragments called Okazaki fragments

                    Leading strand with one start site. The direction of synthesis is towards the crotch of the replication fork

                    o Pulse and pulse-chase experiments showed that new DNA consisted of two populations: Short and long, consistent with this model (fig 7-17 and below):

                    o Short pieces of RNA (1 to 60 bases long) serve as the primer for DNA synthesis. The primer is made by one of two enzymes:

                    RNA polymerase (rifampicin sensitive) makes the primer for the leading strand

                    Primase (rifampicin resistant) makes the primer for the lagging strand

                    Primase forms a complex with the helicase called the Primosome

                    Pol III continues to synthesize until it hits a previously made piece of RNA

                    Pol III drops off and Pol I takes over: since it has 5 3 exonuclease activity, it can chop out the RNA primer until it gets to the DNA.

                    Pol I drops off and ligase seals the gap.

                    Note that the process is Bidirectional! See fig 7-22 and fig 7-24.

                    In E. coli, replication proceeds at 10 5 nucleotides per minute. That is 1667 nucleotides per second.


                    16.5. DNA Replication in Eukaryotes

                    Os genomas eucarióticos são muito mais complexos e maiores em tamanho do que os genomas procarióticos. O genoma humano tem três bilhões de pares de bases por conjunto haplóide de cromossomos e 6 bilhões de pares de bases são replicados durante a fase S do ciclo celular. Existem múltiplas origens de replicação no cromossomo eucariótico, os humanos podem ter até 100.000 origens de replicação. A taxa de replicação é de aproximadamente 100 nucleotídeos por segundo, muito mais lenta do que a replicação procariótica. Na levedura, que é um eucarioto, sequências especiais conhecidas como Sequências de Replicação Autônoma (ARS) são encontradas nos cromossomos. Estes são equivalentes à origem de replicação em E. coli .

                    O número de DNA polimerases em eucariotos é muito mais do que procariotos: 14 são conhecidos, dos quais cinco têm papéis importantes durante a replicação e foram bem estudados. Eles são conhecidos como pol α , pol β , pol γ , pol δ , e pol ε .

                    As etapas essenciais de replicação são as mesmas dos procariotos. Antes que a replicação possa começar, o DNA deve ser disponibilizado como modelo. O DNA eucariótico é ligado a proteínas básicas conhecidas como histonas para formar estruturas chamadas nucleossomos. A cromatina (o complexo entre DNA e proteínas) pode sofrer algumas modificações químicas, de modo que o DNA pode ser capaz de deslizar para fora das proteínas ou ser acessível às enzimas do mecanismo de replicação do DNA. Na origem da replicação, um complexo de pré-replicação é feito com outras proteínas iniciadoras. Other proteins are then recruited start the replication process.

                    Uma helicase usando a energia da hidrólise do ATP abre a hélice do DNA. Bifurcações de replicação são formadas em cada origem de replicação conforme o DNA se desenrola. A abertura da dupla hélice causa enrolamento excessivo, ou superenrolamento, no DNA antes da bifurcação de replicação. Estes são resolvidos com a ação de topoisomerases. Os primers são formados pela enzima primase e, usando o primer, o DNA pol pode iniciar a síntese. Enquanto a fita principal é continuamente sintetizada pela enzima pol δ , a fita retardada é sintetizada por pol ε . Uma proteína de grampo deslizante conhecida como PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) mantém o DNA pol no lugar para que ele não deslize para fora do DNA. RNase H remove o primer de RNA, que é então substituído por nucleotídeos de DNA. Os fragmentos de Okazaki na fita retardada são unidos após a substituição dos primers de RNA por DNA. The gaps that remain are sealed by DNA ligase, which forms the phosphodiester bond (Figure 16.15).

                    Figure 16.15. Eukaryotic DNA replication is similar to that of baterial prokaryotes.

                    Telomere replication

                    Ao contrário dos cromossomos procarióticos, os cromossomos eucarióticos são lineares. As you’ve learned, the enzyme DNA pol can add nucleotides only in the 5′ to 3′ direction. Na fita principal, a síntese continua até que o final do cromossomo seja alcançado. Na fita retardada, o DNA é sintetizado em trechos curtos, cada um dos quais é iniciado por um primer separado. Quando a bifurcação da replicação atinge o final do cromossomo linear, não há lugar para um primer ser feito para o fragmento de DNA a ser copiado no final do cromossomo. Essas extremidades, portanto, permanecem desemparelhadas e, com o tempo, podem ficar progressivamente mais curtas à medida que as células continuam a se dividir.

                    Figure 16.16. The telomeres, colorized pink in this electronmicrograph, are non-gene repetative sequences at the ends of chromosomes. Telomeres are sometimes called the DNA’s aglets after the plastic ends of shoe laces since they both have a protective function.

                    The ends of the linear chromosomes are known as telomeres (Figure 16.16), which have repetitive sequences that code for no particular gene. De certa forma, esses telômeros protegem os genes de serem excluídos conforme as células continuam a se dividir. Em humanos, uma sequência de seis pares de bases, TTAGGG, é repetida de 100 a 1000 vezes. The discovery of the enzyme telomerase (Figure 16.17) helped in the understanding of how chromosome ends are maintained. o telomerase enzyme contains a catalytic part and a built-in RNA template. It attaches to the end of the chromosome, and complementary bases to the RNA template are added on the 3′ end of the DNA strand. Once the 3′ end of the lagging strand template is sufficiently elongated, DNA polymerase can add the nucleotides complementary to the ends of the chromosomes. Assim, as extremidades dos cromossomos são replicadas.

                    A telomerase é normalmente ativa em células germinativas e células-tronco adultas. Não é ativo em células somáticas adultas. For her discovery of telomerase and its action, Elizabeth Blackburn (Figure 16.18) received the Nobel Prize for Medicine and Physiology in 2009.


                    • The two DNA strands run in opposite or antiparallel directions, and therefore to continuously synthesize the two new strands at the replication fork requires that one strand is synthesized in the 5’to3′ direction while the other is synthesized in the opposite direction, 3’to 5′.
                    • However, DNA polymerase can only catalyze the polymerization of the dNTPs only in the 5’to 3’direction.
                    • This means that the other opposite new strand is synthesized differently. Mas como?
                    • By the joining of discontinuous small pieces of DNA that are synthesized backward from the direction of movements of the replication fork. These small pieces or fragments of the new DNA strand are known as the Okasaki Fragments.
                    • The Okasaki fragments are then joined by the action of DNA ligase, which forms an intact new DNA strand known as the lagging strand.
                    • The lagging phase is not synthesized by the primer that initiates the synthesis of the leading strand.
                    • Instead, a short fragment of RNA serves as a primer (RNA primer) for the initiation of replication of the lagging strand.
                    • RNA primers are formed during the synthesis of RNA which is initiated de novo, and an enzyme known as primase synthesizes these short fragments of RNA, which are 3-10 nucleotides long and complementary to the lagging strand template at the replication fork.
                    • The Okazaki fragments are then synthesized by the extension of the RNA primers by DNA polymerase.
                    • However, the newly synthesized lagging strand is that it contains an RNA-DNA joint, defining the critical role of RNA in DNA replication.

                    Figure: Okazaki fragments. Image Source: David O Morgan.


                    DNA Replication in Prokaryotes

                    Prokaryotic DNA is replicated by DNA polymerase III in the 5′ to 3′ direction at a rate of 1000 nucleotides per second.

                    Objetivos de aprendizado

                    Explain the functions of the enzymes involved in prokaryotic DNA replication

                    Principais vantagens

                    Pontos chave

                    • Helicase separates the DNA to form a replication fork at the origin of replication where DNA replication begins.
                    • Replication forks extend bi-directionally as replication continues.
                    • Okazaki fragments are formed on the lagging strand, while the leading strand is replicated continuously.
                    • DNA ligase seals the gaps between the Okazaki fragments.
                    • Primase synthesizes an RNA primer with a free 3′-OH, which DNA polymerase III uses to synthesize the daughter strands.

                    Termos chave

                    • Replicação de DNA: a biological process occuring in all living organisms that is the basis for biological inheritance
                    • helicase: an enzyme that unwinds the DNA helix ahead of the replication machinery
                    • origem de replicação: a particular sequence in a genome at which replication is initiated

                    DNA Replication in Prokaryotes

                    DNA replication employs a large number of proteins and enzymes, each of which plays a critical role during the process. One of the key players is the enzyme DNA polymerase, which adds nucleotides one by one to the growing DNA chain that are complementary to the template strand. The addition of nucleotides requires energy this energy is obtained from the nucleotides that have three phosphates attached to them, similar to ATP which has three phosphate groups attached. When the bond between the phosphates is broken, the energy released is used to form the phosphodiester bond between the incoming nucleotide and the growing chain. Em procariotos, três tipos principais de polimerases são conhecidos: DNA pol I, DNA pol II e DNA pol III. DNA pol III is the enzyme required for DNA synthesis DNA pol I and DNA pol II are primarily required for repair.

                    There are specific nucleotide sequences called origins of replication where replication begins. No E. coli, which has a single origin of replication on its one chromosome (as do most prokaryotes), it is approximately 245 base pairs long and is rich in AT sequences. A origem da replicação é reconhecida por certas proteínas que se ligam a este local. An enzyme called helicase unwinds the DNA by breaking the hydrogen bonds between the nitrogenous base pairs. A hidrólise do ATP é necessária para este processo. As the DNA opens up, Y-shaped structures called replication forks are formed. Two replication forks at the origin of replication are extended bi-directionally as replication proceeds. Single-strand binding proteins coat the strands of DNA near the replication fork to prevent the single-stranded DNA from winding back into a double helix. DNA polymerase is able to add nucleotides only in the 5′ to 3′ direction (a new DNA strand can be extended only in this direction). Também requer um grupo 3 & # 8242-OH livre ao qual pode adicionar nucleotídeos formando uma ligação fosfodiéster entre a extremidade 3 & # 8242-OH e o fosfato 5 & # 8242 do próximo nucleotídeo. This means that it cannot add nucleotides if a free 3′-OH group is not available. Another enzyme, RNA primase, synthesizes an RNA primer that is about five to ten nucleotides long and complementary to the DNA, priming DNA synthesis. A primer provides the free 3′-OH end to start replication. DNA polymerase then extends this RNA primer, adding nucleotides one by one that are complementary to the template strand.

                    DNA Replication in Prokaryotes: A replication fork is formed when helicase separates the DNA strands at the origin of replication. The DNA tends to become more highly coiled ahead of the replication fork. Topoisomerase breaks and reforms DNA’s phosphate backbone ahead of the replication fork, thereby relieving the pressure that results from this supercoiling. Single-strand binding proteins bind to the single-stranded DNA to prevent the helix from re-forming. Primase synthesizes an RNA primer. DNA polymerase III uses this primer to synthesize the daughter DNA strand. On the leading strand, DNA is synthesized continuously, whereas on the lagging strand, DNA is synthesized in short stretches called Okazaki fragments. DNA polymerase I replaces the RNA primer with DNA. DNA ligase seals the gaps between the Okazaki fragments, joining the fragments into a single DNA molecule.

                    O garfo de replicação se move a uma taxa de 1000 nucleotídeos por segundo. DNA polymerase can only extend in the 5′ to 3′ direction, which poses a slight problem at the replication fork. As we know, the DNA double helix is anti-parallel that is, one strand is in the 5′ to 3′ direction and the other is oriented in the 3′ to 5′ direction. One strand (the leading strand), complementary to the 3′ to 5′ parental DNA strand, is synthesized continuously towards the replication fork because the polymerase can add nucleotides in this direction. The other strand (the lagging strand), complementary to the 5′ to 3′ parental DNA, is extended away from the replication fork in small fragments known as Okazaki fragments, each requiring a primer to start the synthesis. Okazaki fragments are named after the Japanese scientist who first discovered them.

                    The leading strand can be extended by one primer alone, whereas the lagging strand needs a new primer for each of the short Okazaki fragments. The overall direction of the lagging strand will be 3′ to 5′, while that of the leading strand will be 5′ to 3′. The sliding clamp (a ring-shaped protein that binds to the DNA) holds the DNA polymerase in place as it continues to add nucleotides. A topoisomerase impede o enrolamento excessivo da dupla hélice do DNA à frente da bifurcação de replicação, pois o DNA se abre, causando cortes temporários na hélice do DNA e selando-a novamente. À medida que a síntese prossegue, os primers de RNA são substituídos por DNA. The primers are removed by the exonuclease activity of DNA pol I, while the gaps are filled in by deoxyribonucleotides. The nicks that remain between the newly-synthesized DNA (that replaced the RNA primer) and the previously-synthesized DNA are sealed by the enzyme DNA ligase that catalyzes the formation of phosphodiester linkage between the 3′-OH end of one nucleotide and the 5′ phosphate end of the other fragment.

                    The table summarizes the enzymes involved in prokaryotic DNA replication and the functions of each.

                    Replicação de DNA procariótica: enzimas e suas funções: The enzymes involved in prokaryotic DNA replication and their functions are summarized on this table.


                    Bruce Alberts

                    Bruce Alberts is currently the Chancellor’s Leadership Chair in Biochemistry and Biophysics for Science and Education at the University of California, San Francisco, and served as Editor-in-Chief of Science Magazine (2008-2013), President of the National Academy of Sciences (1993-2005), and United States Science Envoy (2009-2011). Alberts, who has dedicated his career to promoting science education and international… Continue Reading


                    DNA Replication Summary

                    Francis Leroy / Getty Images

                    DNA replication is the production of identical DNA helices from a single double-stranded DNA molecule. Each molecule consists of a strand from the original molecule and a newly formed strand. Prior to replication, the DNA uncoils and strands separate. A replication fork is formed which serves as a template for replication. Primers bind to the DNA and DNA polymerases add new nucleotide sequences in the 5′ to 3′ direction.

                    This addition is continuous in the leading strand and fragmented in the lagging strand. Once elongation of the DNA strands is complete, the strands are checked for errors, repairs are made, and telomere sequences are added to the ends of the DNA.


                    Assista o vídeo: Do DNA à Proteína (Outubro 2022).