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Por que as culturas bacterianas são necessárias?

Por que as culturas bacterianas são necessárias?


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Percebo que em muitos procedimentos de teste de bactérias a amostra precisa ser cultivada. Você coloca a amostra em ágar ou outro meio de crescimento e espera que as bactérias proliferem antes de examiná-las.

Por que isso é necessário? Se as bactérias estão presentes na amostra, você não pode simplesmente examinar a amostra diretamente com um microscópio para encontrá-las? É uma agulha em um problema de palheiro?

Por exemplo, uma bactéria listeria tem cerca de 1 micrômetro de tamanho e uma coloração de Gram positiva. Assim, com uma ampliação de 1000x, o organismo teria 1 mm de tamanho na objetiva, que é altamente visível. Mesmo com uma ampliação de 100x, você ainda deve ser capaz de ver um pequeno ponto e ser capaz de aumentar o zoom no ponto.


Com apenas um microscópio, você pode ser capaz de encontrar a bactéria, mas como saber que tipo de bactéria é?

Tirando Listeria, sob um microscópio, parece uma pequena haste. Bem, muitas outras bactérias também. Se você vê apenas aquela bactéria, você não pode pegá-la e fazer mais testes com ela, você só pode vê-la.

Portanto, fazemos culturas, onde as bactérias se multiplicam e formam colônias. Se eles crescem sob essas condições, já diz muito a você - muitas espécies de bactérias não vão desenvolver colônias em O tipo de colônia é outro fator na determinação de qual bactéria que estamos observando - ela tem bordas nítidas ou difusas, de que cor é, é "brilhante"?

E então, com essa cultura, mais testes podem ser feitos, como quais produtos químicos a bactéria nesta colônia pode quebrar, o que eles produzem, se eles podem ser manchados com certos corantes, etc. Muitas vezes isso é necessário porque as bactérias parecem muito iguais (redondos ou hastes).

Para Listeria especificamente, existem placas especiais usadas como meio de crescimento que tem certos produtos químicos adicionados que fazem suas colônias parecerem vermelho-violeta. Outras espécies bacterianas não mostrarão essa cor, mesmo que cresçam nas placas.


Linhas celulares e microrganismos não podem ser mantidos em cultura indefinidamente devido ao aumento gradual dos metabólitos tóxicos, uso de nutrientes e aumento no número de células devido ao crescimento. Uma vez que os nutrientes são esgotados e os níveis de subprodutos tóxicos aumentam, as bactérias na cultura noturna entram no fase estacionária, onde a proliferação é grandemente reduzida ou cessada (os platôs do valor de densidade celular). Quando os microrganismos desta cultura durante a noite são transferidos para o meio fresco, os nutrientes desencadeiam o crescimento do microrganismo e passa pelo fase de atraso, um período de crescimento lento e adaptação ao novo ambiente, e então o fase de registro, um período em que as células crescem exponencialmente. [1]

A subcultura é, portanto, usada para produzir uma nova cultura com uma densidade de células menor do que a cultura original, nutrientes frescos e nenhum metabólito tóxico, permitindo o crescimento contínuo das células sem risco de morte celular. A subcultura é importante para a proliferação (por exemplo, um microrganismo como E. coli) e células não proliferativas (por exemplo, glóbulos brancos diferenciados terminalmente). A subcultura também pode ser usada para cálculos da curva de crescimento (ex. Tempo de geração) [2] e obtenção de microrganismos em fase logarítmica para experimentos (ex. Transformação bacteriana). [3]

Normalmente, a subcultura é de uma cultura de um certo volume em meio de crescimento fresco de volume igual, o que permite a manutenção a longo prazo da linha celular. A subcultura em um volume maior de meio de crescimento é usada quando se deseja aumentar o número de células para, por exemplo, uso em um processo industrial ou experimento científico.

Freqüentemente, é importante registrar o número aproximado de divisões que as células tiveram na cultura, registrando o número de passagens ou subculturas. No caso de células de tecido vegetal, a variação somaclonal pode surgir durante longos períodos de cultura. Da mesma forma, em linhas de células de mamíferos, as aberrações cromossômicas têm uma tendência a aumentar com o tempo. Para os microrganismos, há uma tendência de adaptação às condições de cultura, o que raramente é exatamente como o ambiente natural do microrganismo, que pode alterar sua biologia.

O protocolo para a subcultura de células depende muito das propriedades das células envolvidas.

Editar células não aderentes

Muitos tipos de células, em particular muitos microorganismos, crescem em solução e não aderidos a uma superfície. Esses tipos de células podem ser subcultivados simplesmente pegando um pequeno volume da cultura original e diluindo-o em meio de crescimento fresco. A densidade celular nessas culturas é normalmente medida em células por mililitro para grandes células eucarióticas, ou como densidade óptica para luz de 600 nm para células menores como bactérias. As células freqüentemente terão uma faixa preferencial de densidades para um crescimento ideal e a subcultura normalmente tentará manter as células nesta faixa.

Editar células aderentes

As células aderentes, por exemplo muitas linhas de células de mamíferos, crescem ligadas a uma superfície como o fundo do frasco de cultura. Esses tipos de células devem ser destacados da superfície antes que possam ser subcultivados. Para células aderentes, a densidade celular é normalmente medida em termos de confluência, a porcentagem da superfície de crescimento coberta pelas células. As células frequentemente terão uma faixa preferida de confluências para o crescimento ideal, por exemplo, uma linha de células de mamífero como HeLa ou Raw 264.7 geralmente prefere confluências acima de 10%, mas abaixo de 100%, e a subcultura normalmente tentará manter as células nesta faixa. Para a subcultura, as células podem ser destacadas por um de vários métodos, incluindo tratamento com tripsina para quebrar as proteínas responsáveis ​​pela aderência à superfície, quelação de íons de cálcio com EDTA que interrompe alguns mecanismos de aderência de proteína ou métodos mecânicos como lavagem repetida ou uso de um raspador de células. As células destacadas são então ressuspensas em meio de crescimento fresco e deixadas para estabelecer de volta em sua superfície de crescimento.


A importância das bactérias para os humanos

O leite de uma vaca saudável contém inicialmente muito poucas bactérias, que vêm principalmente da pele da vaca e dos procedimentos de manuseio do leite. O leite é um excelente meio de crescimento para inúmeras bactérias, e as bactérias podem aumentar rapidamente em número, a menos que o leite seja devidamente processado. O crescimento bacteriano pode estragar o leite ou mesmo representar um sério risco à saúde se houver bactérias patogênicas. Doenças que podem ser transmitidas de uma vaca infectada incluem tuberculose (Mycobacterium tuberculosis), febre ondulante (Brucella abortus), e febre Q (Coxiella burnetii) Além disso, febre tifóide (Salmonella typhi) pode ser transmitido através do leite de um manipulador de leite infectado. Os procedimentos de pasteurização aumentam a temperatura do leite para 63 ° C (145 ° F) por 30 minutos ou para 71 ° C (160 ° F) por 15 segundos, o que mata qualquer uma das bactérias patogênicas que possam estar presentes, embora esses procedimentos façam não matar todos os microorganismos.

Certas bactérias convertem o leite em laticínios úteis, como leitelho, iogurte e queijo. O leitelho cultivado comercialmente é preparado a partir do leite inoculado com uma cultura inicial de Lactococcus (usualmente L. lactis ou L. lactis cremoris) O iogurte e outros produtos lácteos fermentados são produzidos de maneira semelhante, usando diferentes culturas de bactérias. Muitos queijos também são produzidos pela ação de bactérias. Crescimento no leite de uma bactéria produtora de ácido, como L. lactis faz com que a caseína precipite como coalhada. Após a remoção da umidade e a adição de sal, a coalhada pode amadurecer pela ação de outros microrganismos. Bactérias diferentes conferem sabores e características diferentes aos alimentos, por exemplo, a mistura de Lactobacillus casei, Streptococcus thermophilus, e Propionibacterium shermanii é responsável pelo amadurecimento do queijo suíço e pela produção de seu sabor característico e grandes bolhas de gás. Além disso, Brevibacterium linhos é responsável pelo sabor do queijo Limburger e bolores (Penicillium espécies) são utilizadas na fabricação de queijos Roquefort e Camembert. Outros tipos de bactérias têm sido usados ​​há muito tempo na preparação e preservação de vários alimentos produzidos por meio da fermentação bacteriana, incluindo produtos em conserva, chucrute e azeitonas.

As toxinas de muitas bactérias patogênicas que são transmitidas nos alimentos podem causar intoxicação alimentar quando ingeridas. Estes incluem uma toxina produzida por Staphylococcus aureus, que causa um desconforto gastrointestinal rápido, grave, mas limitado, ou a toxina de Clostridium botulinum, que geralmente é letal. A produção da toxina do botulismo pode ocorrer em alimentos enlatados não ácidos que não foram completamente cozidos antes de serem selados. C. botulinum forma esporos resistentes ao calor que podem germinar em células bacterianas vegetativas que se desenvolvem no ambiente anaeróbio, que conduz à produção de sua toxina extremamente potente. Outras infecções de origem alimentar são, na verdade, transmitidas por um manipulador de alimentos infectado, incluindo febre tifóide, salmonelose (Salmonella espécies) e shigelose (Shigella dysenteriae).


Guardiões da Galáxia Microbiana

Em 1986, Yiu-Kwok Chan da Agriculture Canada identificou uma nova espécie bacteriana. Seguindo o protocolo padrão, ele o depositou na American Type Culture Collection (ATCC), um repositório onde os cientistas armazenam novas cepas microbianas. Ele ficou lá por décadas até 2020, quando foi notado por Roland Wilhelm, um pesquisador de pós-doutorado na Universidade Cornell, por ter uma notável semelhança com um grupo diferente de bactérias. Wilhelm obteve um frasco de cepa de Chan & rsquos da ATCC e usou a mais nova tecnologia de sequenciamento de DNA para confirmar que a cepa de 1986 era na verdade uma espécie de Paraburkholderia bactéria que ele estava estudando atualmente. Essa revelação só foi possível por causa do arquivo bacteriano, que serviu como uma conexão central entre esses dois pesquisadores em diferentes eras da ciência.

Acompanhar a evolução microbiana global é uma tarefa desafiadora. Os micróbios formam novas espécies mais rapidamente do que os humanos e muitos outros animais que se reproduzem sexualmente, e o número de espécies microbianas que os cientistas descobriram tem crescido constantemente ao longo dos anos. No entanto, algumas estimativas sugerem que as taxas de extinção bacteriana estão tão próximas da taxa de formação de novas espécies que a maioria das linhagens bacterianas que já existiram estão agora extintas. Micróbios são conhecidos por serem essenciais para o ciclo de nutrientes, produtividade agrícola e saúde do solo, produzindo antibióticos e compostos anticâncer e protegendo a saúde intestinal e o sistema imunológico. No entanto, ainda estamos explorando e aprendendo sobre o mundo microbiano, o que torna ainda mais importante pensar sobre a conservação microbiana.

As coleções de culturas preservam a diversidade microbiana, assim como um banco de sementes preserva a diversidade genética das plantas. O World Data Center for Microorganisms relata uma coleção de culturas microbianas em quase todas as partes do mundo e, juntas, elas contêm mais de dois milhões de culturas bacterianas, fúngicas e virais. Este número é apenas uma pequena fração da prolífica diversidade microbiana da Terra.

As coleções de cultura microbiana podem receber amostras de qualquer lugar do mundo, mas alguns locais produzem mais micróbios do que outros. A coleção de recursos microbianos de Jena recebe culturas de todo o mundo, mas principalmente de países asiáticos, de acordo com Michael Ramm, membro da equipe do JMRC. Alguns países ou instituições são atualmente hotspots de descoberta microbiana e abrigam esforços de isolamento em grande escala. Freqüentemente ouvimos sobre pontos críticos de biodiversidade e histórias de extinção como o pássaro dodô e rsquos, mas a conservação microbiana raramente faz parte das conversas públicas.

Uma razão pela qual não pensamos sobre a conservação microbiana é que a maioria dos micróbios é invisível a olho nu e difícil de crescer fora de seus habitats naturais, menos de 2% das bactérias ambientais podem ser cultivadas em laboratório. Isso torna o armazenamento e a cultura de micróbios um processo complicado que requer a descoberta de uma combinação elusiva de nutrientes, sais e condições atmosféricas. Pode levar meses ou até anos para os cientistas arrancarem um micróbio de seu habitat.

Os pesquisadores precisam de repositórios como coleções de cultura global para garantir a preservação a longo prazo das culturas preciosas que podem ser cultivadas. Kirk Broders, curador da NRRL Culture Collection em Peoria, Illinois, está entusiasmado com o potencial de tais coleções. & ldquoComo conectar-se e fornecer recursos para pesquisadores de todo o mundo que estão conduzindo pesquisas interessantes. é a parte mais emocionante do meu trabalho. Há também a alegria simples de cultivar, cultivar e admirar o colorido zoológico de lindos fungos e bactérias. & Rdquo

Superficialmente, pode parecer que essas coleções estão catalogando culturas como um museu microbiano. No entanto, o verdadeiro valor desses repositórios está em seu potencial para a ciência - o próximo novo antibiótico, um composto que cura o câncer, ou um micróbio que reduz as emissões de gases de efeito estufa pode estar escondido nesses frascos. “Na ciência, pode ser difícil prever quais cepas biológicas podem se tornar clinicamente significativas”, diz Sarah Alexander, curadora da Coleção Nacional de Culturas Tipo (NCTC). & ldquoQuando um cientista deposita cepas, este material está disponível para a próxima geração de cientistas e sempre será recuperável. & rdquo

As coleções permitem que os cientistas se certifiquem de que a cepa com a qual estão trabalhando hoje é a mesma que foi usada em um estudo de 30 anos atrás, como na história de Wilhelm & rsquos. É por isso que muitas coleções de cultura estão começando a apertar as restrições para que uma cepa enviada seja reconhecida como membro oficial da coleção. No passado, o exame microscópico de uma cultura pode ter se mostrado suficiente, mas repositórios como o NRRL agora estão começando a exigir uma medida de segurança adicional que evita a contaminação: a sequência do gene da cepa enviada deve corresponder ao que o cientista encontrou no laboratório. Muitos micróbios também podem evoluir muito rapidamente, e mesmo alguns meses de vida no laboratório podem fazer uma cepa parecer diferente de quando foi identificada pela primeira vez. Assim que um microbiologista verifica se as sequências gênicas correspondem, as cepas são armazenadas por criopreservação, o processo de armazenamento de longo prazo usando temperaturas ultracold ou congelamento instantâneo com nitrogênio líquido.

As coleções de cultura são entidades claramente críticas que ajudam a tornar a ciência mais aberta, colaborativa e reproduzível. Eles preservam a diversidade microbiana atual da Terra e podem conter as chaves microscópicas para resolver muitos desafios globais urgentes. Eles também são as bibliotecas do mundo microbiano e cada cepa tem uma história única - o primeiro isolado bacteriano no NCTC foi isolado de um soldado da Primeira Guerra Mundial e está sendo usado para combater a disenteria. Alexandre conhece a história e a promessa das linhagens. & ldquoA manutenção, preservação e crescimento da coleção que contém mais de 6.000 cepas de mais de 900 espécies bacterianas diferentes é um privilégio. Uma coleção de cultura é um repositório biológico. por meio do qual podemos preservar essas exposições vivas para garantir que estejam disponíveis para pesquisa. & rdquo


É um fator ambiental essencial que pode influenciar o crescimento dos organismos. A maioria dos patógenos cresce a 37 ° C (temperatura corporal). As bactérias são categorizadas em três grupos com base na faixa de temperatura ideal

  • Mesófilo: A faixa de temperatura ideal para mesófilos é de 25 ° C a 40 ° C. A maioria das bactérias patogênicas pertence a este grupo.
  • Psicrófilo: A temperatura ideal para psicrófilos está abaixo de 20 °
  • Termófilo: A faixa de temperatura ideal para termófilos é de 55 0 C a 80 0 Ex: Bacillus stearothermophilus.

O pH é um fator essencial para o crescimento dos micróbios. As bactérias podem ser capazes de produzir vários ácidos orgânicos que reduzem o pH do meio e também restringem o crescimento de outras bactérias. Além disso, alguns constituintes do meio podem ser afetados por baixo pH. Portanto, manter o pH ótimo é muito importante para obter o crescimento adequado dos organismos. Os patógenos geralmente requerem pH neutro (7,2). No entanto, bactérias industrialmente importantes, como Lactobacillus lactis requer um pH mais baixo para um crescimento ideal.


O que é cultura?

A cultura microbiana é um método de cultivo e manutenção de microrganismos em condições de laboratório para diferentes fins. As culturas são cultivadas em meios sólidos, semissólidos e líquidos com base no tipo e na finalidade da cultura do microrganismo. As culturas são fornecidas com os nutrientes necessários e as condições de crescimento exigidas pelos microrganismos. Existem diferentes componentes de um meio de cultura, como fonte de energia, fonte de carbono, fonte de nitrogênio, minerais, micronutrientes, água, agente de solidificação, etc. A temperatura ideal, oxigênio e pH devem ser ajustados de acordo com o tipo de microrganismo cultivado.

Existem diferentes tipos de culturas microbianas, por exemplo, cultura em lote, cultura contínua, cultura stab, cultura em placa de ágar, cultura em caldo, etc. De acordo com a composição do meio de cultivo, existem diferentes tipos de meios de cultura conhecidos como meios sintéticos, semi - meios sintéticos e meios naturais. As culturas microbianas são preparadas em condições estéreis dentro de uma câmara especial chamada fluxo de ar laminar. O meio de cultivo e os utensílios de vidro são esterilizados antes da inoculação do microrganismo desejado. Em condições estéreis adequadas, o microrganismo alvo é transferido para o meio nutriente esterilizado e incubado em temperatura ideal. Dentro do meio, o microorganismo crescerá e se multiplicará usando os nutrientes fornecidos.

Figura 3: Uma cultura bacteriana na placa


Foco do Cientista Criativo 3.1

Carl Fliermans e sua pesquisa sobre Legionella

O Dr. Carl B. Fliermans é ecologista microbiano da DuPont e faz parte do conselho consultivo técnico do Institute for Creation Research. Ele possui um Ph.D. em microbiologia pela Indiana University, e uma bolsa de pós-doutorado no National Institutes of Health. O Dr. Fliermans é o cientista que primeiro isolou a bactéria “Doença do Legionário”. Ele publicou mais de 60 trabalhos e é membro da Sociedade Americana para o Avanço da Ciência, do Instituto Americano de Ciências Biológicas e da Sociedade Americana de Microbiologia, entre outros. Dr. Fliermans é um cristão que acredita que o Criador o guiou em sua descoberta de Legionella.

Manchete de jornal de agosto de 1976: “Doença misteriosa atinge legionários”

Em uma das entradas mais dramáticas de qualquer doença na arena da saúde pública, a doença dos legionários apareceu na Convenção do Bicentenário dos Estados Unidos da Legião Americana, de 21 a 23 de julho de 1976, na Filadélfia. Quase 5.000 legionários participaram da reunião de três dias, com mais de 600 hospedados no elegante mas envelhecido Bellevue Stratford Hotel. Antes mesmo de fazer o check-out do hotel, vários legionários começaram a se sentir mal com sintomas semelhantes aos da gripe. Na terça-feira, 27 de julho, apenas quatro dias depois de deixar a Filadélfia, um veterano da Força Aérea que havia se hospedado no Bellevue Stratford durante a convenção morreu em um hospital em Sayre, PA. Ele foi o primeiro de mais de 30 legionários a sucumbir a uma pneumonia letal que a mídia rapidamente chamou de "doença do legionário". Qual foi a causa desta nova doença?

  • Foi biológico ou químico?
  • De onde veio o patógeno, se houver um?
  • Como a doença se espalhou?
  • Como a doença pode ser prevenida?

Essas questões-chave e outras se tornaram o foco de uma investigação intensa que resultou na descoberta, em janeiro de 1977, de que uma bactéria Gram-negativa em forma de bastonete causava a doença. A bactéria foi nomeada Legionella pneumophila. Bons microbiologistas como o Dr. Joseph McDade e mais tarde o Dr. Fliermans consideraram fontes patogênicas na natureza, rotas de transmissão para pessoas suscetíveis e meios de prevenir a disseminação de patógenos. Seu processo ilustra como as técnicas clássicas são usadas para provar a causa de uma doença específica.

Investigação da etiologia da doença dos legionários e resume os postulados de Koch.

A ilustração acima rastreia a investigação da etiologia da doença dos legionários e resume os postulados de Koch. A doença do legionário foi reconhecida pela primeira vez em agosto de 1976. Passaram-se mais de seis meses antes que os postulados de Koch fossem cumpridos e Legionella pneumophila foi declarado o agente etiológico da doença. Em primeiro lugar, se o agente etiológico fosse biológico, então era preciso descobrir que o agente estava regularmente associado à doença. Tecidos de biópsias pulmonares e amostras de escarro foram examinados para um microrganismo recorrente. Um bastão Gram-negativo com tendência a formar filamentos longos e enrolados foi detectado de forma consistente nas amostras. Em segundo lugar, a bactéria recém-descoberta foi isolada em cultura pura em laboratório. Isso exigia aprendizado L. pneumophilaNecessidades nutricionais de e projetar meios de crescimento especiais que atendam a esses requisitos, apoiando o crescimento da bactéria. Terceiro, um animal suscetível era necessário para demonstrar que L. pneumophila pode produzir doenças, particularmente uma doença respiratória semelhante à doença do legionário em humanos. A cobaia provou ser o modelo animal de escolha. Finalmente, L. pneumophila foi recuperado de cobaias infectadas para verificar se havia estabelecido uma infecção.

Isolamento inicial do agente causador

Por meio de uma série de experimentos, o Dr. McDade e sua equipe descobriram, a partir de amostras clínicas, em janeiro de 1977, as evidências da existência e patogênese da bactéria que causa a doença dos legionários. O primeiro passo foi remover amostras de pulmão de um legionário falecido. Essas células foram trituradas, injetadas em ovos de galinha e incubadas. Após o período de incubação, os ovos foram quebrados e os sacos vitelinos foram extraídos e injetados nas patas das cobaias. Esses animais desenvolveram os sintomas típicos da doença dos legionários. McDade então coletou amostras de sangue de sobreviventes da doença, presumindo que contivessem anticorpos contra o agente causador. Ele então misturou as amostras com os isolados do saco vitelino, e eles reagiram, confirmando que o agente no saco vitelino era o mesmo agente causador da doença nas 33 pessoas.

McDade explicou que sua equipe ficou perplexa durante meses com várias características incomuns da bactéria: A bactéria não cresceu em condições normais. Os cientistas tentaram cultivar a bactéria a partir de amostras de sangue e tecido dos Legionários em uma solução cheia de fluido de mídia padrão usado para cultivar outras variedades bacterianas. No entanto, nada cresceu. Essa falta de crescimento levou a equipe a pensar que o agente era um vírus ou “cepa de Andrômeda” nunca visto antes. Só depois que as amostras não tratadas com antibióticos foram injetadas nos ovos é que as evidências de atividade biológica foram determinadas.

Outro atraso foi causado pelo uso de ratos em experimentos. Só depois que a equipe mudou para as cobaias é que seus esforços foram produtivos. Embora os ratos sejam frequentemente usados ​​como modelos animais, descobriu-se que a Legionella se replica principalmente dentro dos macrófagos. Macrófagos de camundongos são muito ineficientes na ingestão dessa bactéria, então eles nunca foram infectados por amostras dos Legionários. Em contraste, as cobaias eram suscetíveis a Legionella e foi infectado.

O próximo passo para McDade foi determinar por que essa bactéria era tão difícil de cultivar. Eles logo descobriram que o Legionella a bactéria tem necessidades fisiológicas. Os meios de cultura padrão não promovem o crescimento porque requerem altos níveis do aminoácido cisteína, suplementos de ferro inorgânico, baixas concentrações de sódio, carvão ativado e temperaturas elevadas. Dr. Fliermans foi o primeiro a reconhecer que os lipídios de Legionella eram muito semelhantes às bactérias termofílicas que ele descobriu nas áreas termais do Parque Nacional de Yellowstone. Além disso, a bactéria tende a viver em um ambiente escuro, rico em nutrientes, como um biofilme (espuma) associado a espécies de algas selecionadas. Essas condições contribuíram para a dificuldade de visualização do organismo em seu ambiente por meio de microscopia padrão e outras técnicas.

McDade pediu a Fliermans que ajudasse a completar os postulados de Koch para a doença dos legionários. Desde 1969, Fliermans tem conduzido pesquisas sobre microrganismos associados a habitats térmicos naturais como os de Yellowstone e habitats feitos pelo homem provenientes de fluxos térmicos próximos a instalações elétricas e nucleares. Os microrganismos associados a esses habitats eram frequentemente mesofílicos e termofílicos em sua resposta fisiológica, em que sua temperatura ótima de crescimento estava entre 30 ° e 90 ° C (86 ° e 194 ° F). A segunda característica incomum para esses termófilos era o grande número de ácidos graxos de cadeia ramificada que eles continham, assim como os isolados clínicos de Legionella. De posse dessas informações, Fliermans começou a procurar em habitats aquáticos, naturais e artificiais, tanto ambientais quanto térmicos, a presença de Legionella. O trabalho seminal de Fliermans demonstrou que Legionella pode ser isolado de habitats naturais não associados a um surto da doença. Essas descobertas abriram uma nova área de pensamento, experimentação e compreensão. Para Fliermans, a questão agora era: como e onde Legionella se encaixam no ambiente ecológico?

Embora muitos nos Centros de Controle de Doenças ficaram intrigados quanto à origem do Legionella, os dados epidemiológicos levam Fliermans a se concentrar em nichos aquáticos como habitats naturais da bactéria. Essa hipótese surgiu do exame do fato de que as apresentações clínicas iniciais demonstravam uma sazonalidade da infecção. Esse padrão cíclico era muito semelhante ao observado para o crescimento de bactérias aquáticas. As teorias sobre a causa das doenças variaram de intoxicação por níquel carbonil e pneumonia viral a uma conspiração farmacêutica contra veteranos americanos. No CDC, muitos levantaram a hipótese de que Legionella pode ter sido geneticamente modificado como uma “linhagem de Andrômeda” pelos soviéticos ou como alguma outra conspiração comunista. Afinal, afetou principalmente os veteranos. Lendo sua Bíblia um dia, o Dr. Fliermans observou Eclesiastes 1: 9: “O que foi, é o que será, e o que será feito, será o que será feito; e não há coisa nova debaixo do sol . ” O Dr. Fliermans acreditava que isso era verdade e logo alterou a forma como seu laboratório procurava o organismo, já que a bactéria provavelmente não era nova sob o sol. Depois de orar, planejar e explorar, o Dr. Fliermans encontrou a bactéria em águas termais (inicialmente isoladas a 45 ° C [113ºF] no Laboratório de Savannah River) descarregada de um reator nuclear e, posteriormente, de fontes termais naturais tanto no Leste quanto no Oeste dos Estados Unidos Estados. Uma vez isolado do meio ambiente, a próxima tarefa era cultivá-lo. No início, cresceu apenas em cobaias. Os postulados de Koch foram inicialmente cumpridos na cobaia da filha do Dr. Fliermans no verão de 1977 com amostras retiradas de torres de resfriamento. Ele foi capaz de desenvolver e implantar um teste de anticorpos fluorescentes para detectar Legionella.

Esta micrografia eletrônica mostra uma ameba, Hartmannella vermiformis (inferior esquerdo), uma vez que captura um Legionella pneumophila bactéria (canto superior direito) com um pseudópode estendido

Legionella agora era facilmente identificado in situ, in vivo e in vitro. Conhecer a base molecular e ecológica de uma patogênese ajuda a desenvolver novas maneiras de prevenir e curar doenças. Por um lado, pode-se prever as condições sob as quais os patógenos tendem a se desenvolver, se espalhar e causar doenças. Com técnicas aprimoradas e ferramentas moleculares, os anticorpos fluorescentes auxiliam no diagnóstico. Uma história de detetive médico semelhante também é verdadeira para a descoberta e o diagnóstico do agente causador da doença de Lyme. (Ver Corpo por Design, 2002, p. 145, para obter detalhes.) Ser um médico Sherlock Holmes ajuda a sintetizar a diversidade dos fatos em uma unidade.


Definição de Cultura Síncrona

A cultura síncrona se refere ao processo de crescimento da população microbiana, onde células individuais mostram Sincronia com as outras células no mesmo meio de cultura, crescendo no mesma fase de crescimento para o tempo de geração determinado.

A principal característica do crescimento síncrono é que todas as células microbianas são fisiologicamente idênticas, crescendo no mesmo ciclo de divisão e no mesmo tempo de geração. Portanto, podemos dizer que toda a população microbiana permanece uniforme em relação ao crescimento e divisão celular.

Propósito

  • Ao usar a cultura síncrona, podemos ter uma ideia da colheita de células inteiras no estágio particular de seu ciclo de vida e suas inter-relações.
  • A medição do crescimento microbiano em cultura synchronos é mais acessibilidade do que as outras técnicas de cultura de crescimento, como os resultados feitos em tal cultura de massa são análogos às medições feitas em uma única célula bacteriana.
  • Na cultura sincrônica, podemos elucidar o comportamento de crescimento das células bacterianas no mesmo estágio de crescimento.

Pontos chave

  1. Toda a população microbiana tende a mostrar sincronia, alterando as condições físicas e os constituintes químicos dos meios de cultura.
  2. É uma espécie de sistema de cultivo aberto.
  3. Em cultura síncrona, as células microbianas são fisiologicamente semelhante.
  4. Todas as células microbianas em cultura síncrona crescem no mesmo tempo de geração e no mesmo ciclo de divisão.

A Eficiência da Cultura Síncrona

As células bacterianas apresentam crescimento assíncrono no meio de cultura aleatório. No entanto, as células microbianas apresentam sincronia por meio dos métodos de seleção e indução. Podemos determinar a eficiência do crescimento síncrono comparando os dois parâmetros a seguir:

Vamos ver o padrão de crescimento das células traçando um gráfico entre o tempo de duplicação vs um número logarítmico de células e o tempo vs os índices mitóticos correspondentes para um crescimento síncrono e aleatório, respectivamente.


Seleção de microorganismos

Para a seleção de microrganismos e para mantê-los em sincronia, foram utilizadas duas abordagens baseadas nos métodos de seleção mecânica e por indução.

Seleção por Método Mecânico

Refere-se a um separação física método, no qual a seleção da população síncrona é realizada de acordo com a era e Tamanho.

Para executar este método, você precisa filtrar as células microbianas para separar as células pequenas e jovens que são metabolicamente ativas. Um filtro retém células grandes que estão prontas para se dividir.

Desta forma, as células grandes são coletadas do filtro para obter um crescimento síncrono por uma técnica padrão conhecida como “Técnica Helmstetter Cumming”.

Neste método, você precisa passar toda a população de células por um filtro cujo tamanho de partícula é pequeno, o suficiente para capturar as bactérias. Este método faz uso de filtro de membrana de nitrato de celulose.

Em seguida, inverta o papel de filtro e passe o meio nutriente fresco sobre ele. Ao fazer isso, as bactérias vagamente associadas serão eliminadas pelo filtro. As bactérias de grande porte permanecerão no papel de filtro e tendem a se dividir.

Em seguida, colete a amostra deste fluxo, que contém todos os recém-formados e células que se dividem sincronizadamente. O método tem uma limitação de que o tamanho da população é petite.

Hoje em dia, a centrifugação por gradiente de densidade também é usada no lugar da filtração, para selecionar células microbianas de mesmo tamanho e densidade e que podem se dividir no mesmo estágio de seu ciclo de vida.

Selection by Induction Method

The another method, i.e. shock treatment can also maintain cell synchrony and it includes temperature variation, starvation, light exposure, lethal doses of radiation etc.

All these factors can maintain synchrony in the cell population for several generations. Let us discuss some of the factors that can induce synchrony in the cell culture.

Temperature variation: It is the most common factor that induces the cell maturation to the same point of fission.

We could observe the change in culture medium by growing the microbial culture under 37 degrees Celsius and later subjecting the culture medium to 20 degrees Celsius for about 30 minutes.

During this interval, the cells go through maturação to undergo cell division. At 20 degrees Celsius temperature, no bacteria will undergo fission.

But, if you transfer the culture at a temperature of 37 degrees Celsius, all the cells start dividing synchronously. Therefore, the repeated temperature variation can maintain synchrony for a few generations.

Alternations in the media composition: Other than shock treatment, the synchrony can also be induced by changing the media composition of the culture medium.

The microorganisms grown in the culture medium deficient or containing the essential growth factor may either promote or inhibit the cell division, which eventually withheld the fission.

Let us suppose, the bacterial cells are grown in a culture medium that lacks thymine (an essential element). As a result, the process of fission halts for some time. However, the bacterial cells will divide once you transfer the cells to a complete nutrient medium.

De forma similar, colchicine is a growth factor inhibiting the cell division in culture medium for a certain period. But the effect can be reversed once you transfer the cells to the culture medium free of colchicine.

Conclusão

Therefore, we can conclude that the synchronous culture are of two kinds, namely induction and selection synchrony. o induction synchrony induces the bacterial cell population to undergo fission synchronously via physical or chemical treatment.

Oppositely, the selection synchrony selects cells at a particular stage of the cycle, and later the fractions of bacterial cells grow through their natural cycle.


Why are bacterial cultures necessary? - Biologia

In many distinct areas of microbiology, the ability to identify microorganisms has important application. For example, in food microbiology it is important to be able to accurately identify food spoilage contaminants. In microbial ecology, the identification of microorganisms helps us characterize biodiversity. In the field of medical microbiology, a branch of microbiology that investigates pathogenic microorganisms, the primary focus is to isolate, identify, and study microorganisms responsible for infectious disease.

Many microorganisms are permanent residents, or normal flora, of the human body. Bacteria that are normal flora are important symbionts of the human body, most of which cause no ill effects and some, which are actually beneficial to human health. Only a small percentage, less than 10%, of all known bacteria are pathogenic, or able to cause disease in a susceptible host. In order to identify an unknown in the clinical laboratory, a sample must be collected from the patient. This could be a sample of urine, feces, saliva, or a swab of the throat or skin. Because the clinical samples will most likely contain many microorganisms, both normal flora and pathogens, it is important to isolate the pathogen in a cultura pura using various types of selective and differential media. Following isolation, one of the first steps in identifying a bacterial isolate is the Coloração de Gram, which allows for the determination of the Gram reaction, morphology, and arrangement of the organism. Although this information provides a few good clues, it does not allow us to determine the species or even genus of the organism with certainty. Thus, microbiologists use characteristic biochemicalAtividades to more specifically identify bacterial species. A Few Biochemical/Physiological Properties Used for identification of bacteria include: nutrient utilization (carbohydrate utilization, amino acid degradation, lipid degradation), resistance to inhibitory substances (high salt, antibiotics, etc.), enzyme production (catalase, coagulase, hemolysins, etc.) and motility.

This series of lab exercises will introduce many of the physiological characteristics/biochemical activities of bacteria commonly encountered in a clinical microbiology laboratory. Knowledge of these key characteristics will enable the identification of unknown bacterial isolates. It is important to thoroughly understand the basis for each biochemical test and know the key physiological characteristics of the bacterial genera and species presented in these labs.

Observação: Labs 15-17 will utilize a number of different media and tests that are described in the ATLAS and on the course web page (Summary of Biochemical Tests). Please use these as references for all of these labs and for the investigation of unknowns in Labs 18-21.


Supporting information

S1 Fig. Impaired metabolism leads to an increase in antibiotics survival.

(UMA) E. coli MG1655 WT, ΔaceA, and Δicd strains were grown 2 hours to 2.5 hours in LB at 37°C to exponential phase and challenged with ciprofloxacin (1 μg/mL). Survival has been assessed by culture plating and CFU counting. Data are the average results from 3 independent experiments performed with 3 biological replicates (n = 8 or 9). Error bars represent standard deviations. (B) Distribution of the iATPSnFr 1.0 488ex/405ex ratio per single cell measured by microscopy in exponential cultures of MG1655, ΔaceA, and Δicd strains grown in LB at 37°C. Thick lanes represent the median, and secondary lanes the quartiles. Significance was determined using Kruskal–Wallis and Dunn’s multiple comparison tests. Observations were performed with a confocal microscope. (C) Bulk ATP levels were measured in MG1655, ΔaceA, and Δicd strains grown in LB 37°C with firefly luciferase assay and normalized with OD600. Data are the average results from 3 independent experiments performed with 3 biological replicates (n = 9). Error bars represent standard deviations. Significance was determined using one-way ANOVA and Tukey’s multiple comparison tests. The underlying data for this figure can be found in S1 Data.

S2 Fig. Growth of the fluorescent reporter strains.

MG1655 Krebs cycle KO strains and W3110D Krebs cycle mVenus fusion strains were grown in LB (A), in MOPS minimum medium with 0.4% sodium pyruvate (B), or 0.4% sodium acetate (C) as sole carbon source at 37°C. (D) MG1655-SB1 strains expressing or not iATPSnFr 1.0 were grown in LB at 37°C. In (A), (B), (C), and (D), each lane represents a biological replicate coming from experiments performed 3 times (n > 6). The underlying data for this figure can be found in S1 Data.

S3 Fig. Fluorescence analysis of the mVenus fusions.

Representative histogram of fluorescence of the mVenus fusions before (A) and after (B) ciprofloxacin treatment of W3110D: black lane, aceA-mVenus: red-lane, icd-mVenus: blue lane, gltA-mVenus: green lane, sucA-mVenus: orange lane. For each of those fusions, (C), (D), (E), (F), respectively, show the histogram of fluorescence before (black lane) and after (red lane) ciprofloxacin treatment for each fusion (left panel), and the post-sorting purity analysis of the Dim (light grey), Middle (grey), and Bright (dark grey) sorted fractions (right panel). The number of events represented in the y axis is normalized for each graph. The underlying data for this figure can be found in S1 Data.

S4 Fig. Reporting ATP in exponential and stationary phase cultures at the single-cell level.

(A) Representative images of exponential (upper panel) and stationary (lower panel) phase cultures of MG1655_iATPSnFr 1.0 cultured in LB at 37°C. The fluorescent signals 405ex and 488ex are false colored in magenta and green, respectively. In the ratiometric 488ex/405ex panel, orange/yellow cells correspond to cells with higher ATP, and blue cells with lower ATP. Scale bar, 5 μm. White arrow shows the presence of a low 488ex/405ex ratio cell within exponential culture. Observations were performed with a confocal microscope. (B) Distribution of the iATPSnFr 1.0 488ex/405ex ratio in exponential and stationary phase cultures. Thick lanes represent the median, and secondary lanes the quartiles. Significance was determined using two-tailed unpaired Mann–Whitney você teste. Data are representative of experiments made twice giving similar results. (C) Bulk ATP levels were measured in MG1655 strain grown in the same conditions as in (A) with firefly luciferase assay and normalized with OD600. Data are the average results from 2 independent experiments performed with 3 biological replicates (n = 6). Error bars represent standard deviations. Significance was determined by using two-tailed unpaired Student t teste. The underlying data for this figure can be found in S1 Data.

S5 Fig. Kymographs of the different phenotypes observed.

The fluorescent panels represent the addition of iATPSnFr 1.0 405ex and 488ex intensities. Observations were performed with a time-lapse epifluorescence microscope.

S6 Fig. Kymographs of the persisters analyzed.

(A) Left panel: ATP value at the beginning of the experiment in persisters. Data represent the single-cell 488ex/405ex ratio values analyzed for each of the 16 persisters at the first time frame in Fig 3D histogram. The black horizontal dashed line represents the mean 488ex/405ex ratio of the normal cells (0.6303). Right panel: Kymographs of the 16 persisters analyzed in Fig 3C. The iATPSnFr 1.0 ratiometric 488ex/405ex panels represent ATP level. The color code has been scaled individually for each of the 16 kymographs. Persister number 2 harbors a slow growth pattern different than the others which don’t grow in presence of ampicillin. The white rectangles indicate the time frame where the first septal invagination of each persister is observed (time before first division). Observations were performed with a time-lapse epifluorescence microscope. (B) For each persister, time before first division is plotted over the iATPSnFr 1.0 488ex/405ex ratio at the first time frame of the time lapse (t = 1). Correlation was examined by Pearson’s correlation. The underlying data for this figure can be found in S1 Data.

S7 Fig. iATPSnFr 1.0 488ex/405ex ratio in the mother machine.

(A) Each data point represents the iATPSnFr 1.0 488ex/405ex ratio per single cell over time frames (frames interval is 30 minutes) for normal cells (in black) and persister cells (in red). (B) Distribution of the iATPSnFr 1.0 488ex/405ex ratio per single cell for normal cells (in black) and persister cells (in red) according to their position in the mother machine, at the first time frame of the time lapse (t = 1), and (C) immediately before the antibiotic is added (t = 5). Observations were performed with a time-lapse epifluorescence microscope. The underlying data for this figure can be found in S1 Data.

S8 Fig. Persisters, cell size, and ATP.

(A) Distribution of cell size area. (B) Distribution of the iATPSnFr 1.0 488ex/405ex ratio. A mother machine experiment using the same setup as in Fig 3 was performed. The light grey bars represent all non-persister cells (23,766 cells) at the first time frame, immediately after loading in the mother machine from a stationary phase culture. Dark grey corresponds to non-persister cells with sizes smaller than the average persister cells (5,596 cells). The 5 persisters found in this experiment are plotted in red. Observations were performed with a time-lapse epifluorescence microscope. The underlying data for this figure can be found in S1 Data.

S9 Fig. General schematic of the construction of in-frame chromosomal mVenus fusions.

Schematic of the construction of the translational mVenus fusions. Two-round PCRs were performed. The template used was the pKDN31 plasmid (a gift from Barry Wanner), and the polymerase used was the KOD. Final PCRs were precipitated with ethanol, dried up, then dissolved in H2O, before to be used to electrotransform W3110D/pKD46. Electrocompetent cells of W3110D/pKD46 were prepared according to the standard protocol for λ Red recombination with a higher concentration of L-arabinose (10 mM) [59,60]. The double selection was done using resistance to chloramphenicol (25 μg/mL) and sensitivity to ampicillin (100 μg/mL at 30°C), and clones were PCR checked using Left and Down primers (S3 Table). Finally, bar code sequencing was performed after amplification with Left and NYP244 primers (S3 Table).

S10 Fig. Evaluation of photobleaching and photoactivation effects for the iATPSnFr 1.0 sensor.

Stationary phase cells were concentrated and loaded in the device, and fresh EZRDM was flowed until cells are in balanced growth (from time frame 7 to the end of the experiment). Frames were taken 30 minutes apart. Changes in the 405ex and 488ex signals of the iATPSnFr 1.0 sensor (on the right y axis) and in the 488ex/405ex ratio (on the left y axis) were monitored over time. Data represented are the mean of the iATPSnFr 1.0 488ex, 405ex, and 488ex/405ex ratio per single cell over time frames (n = 2,670). Error bars represent standard errors. Observations were performed with a time-lapse epifluorescence microscope. The underlying data for this figure can be found in S1 Data.


Assista o vídeo: Urocultura - Como o Biomédico deve interpretar o crescimento bacteriano nas culturas de urina (Dezembro 2022).