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Qual é a diretriz para escolher um alvo molecular para identificar hospedeiros vertebrados em farinhas de sangue de artrópodes?

Qual é a diretriz para escolher um alvo molecular para identificar hospedeiros vertebrados em farinhas de sangue de artrópodes?


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Existem alguns alvos moleculares para identificar hospedeiros vertebrados de farinhas de sangue de artrópodes, incluindo o gene Cyt b e o gene COI. Quais são os padrões ou características que devo ter em mente para escolher um alvo molecular para identificar o sangue do hospedeiro de mosquitos? Gostaria muito de receber sua ajuda.


Eu pesquisei sobre o assunto e perguntei a especialistas e a melhor aproximação para saber que o hospedeiro vertebrado de sangue de artrópodes tem como alvo genes mitocondriais porque você pode obter dados de sequência limpos devido ao fato de que apenas um alelo está presente em vez de dois.

Dentro do genoma mitocondrial, você deve selecionar um gene que foi amplamente sequenciado para a maioria das espécies de vertebrados que provavelmente detectará em sua região; do contrário, você terá muitas identidades desconhecidas entre seus farelos de sangue. Na verdade, existem apenas duas opções que correspondem a esses critérios: o gene da citocromo oxidase I (COI), que tem sido usado pelo projeto Database of Life; e citocromo b, para o qual as sequências estão amplamente disponíveis (ou seja, para muitas espécies de vertebrados) no GenBank. Se obtiver um resultado negativo para um, você pode tentar o outro. As sequências de iniciadores estão amplamente disponíveis na literatura.

Em conclusão, você deve ser alvo de genes COI e Cytb para garantir a identificação do hospedeiro e evitar uma correspondência não identificada no projeto Database of Life ou GenBank.

Apresento um exemplo de papel para revisar a metodologia: Preferência de hospedeiro do Arbovirus Vector Culex erraticus (Diptera: Culicidae) no Lago Sonso, Departamento do Vale do Cauca, Colômbia


Refeições de sangue com código de barras: novos conjuntos de primers específicos para vertebrados para atribuir identidades taxonômicas ao DNA hospedeiro de refeições de sangue de mosquitos

A dinâmica de transmissão de patógenos vetorados por mosquitos é, em parte, mediada pelos padrões de alimentação do mosquito pelo hospedeiro. Esses padrões são elucidados por meio da análise de farinha de sangue, uma coleção de técnicas serológicas e moleculares que determinam as identidades taxonômicas dos animais hospedeiros dos quais as refeições de sangue são derivadas. As análises modernas de farinha de sangue baseiam-se na reação em cadeia da polimerase (PCR), sequenciamento de DNA e comparações bioinformáticas de sequências de DNA de farinha de sangue para bancos de dados de referência. Idealmente, os primers usados ​​em PCRs de análise de farinha de sangue amplificam modelos de uma gama taxonomicamente diversa de vertebrados, produzem um amplicon curto e evitam a co-amplificação de modelos não-alvo. Poucos conjuntos de primer que atendem a esses requisitos estão disponíveis para o citocromo c subunidade I de oxidase (COI), o marcador de identificação de espécies com maior cobertura taxonômica em bancos de dados de referência. Aqui, apresentamos novos conjuntos de primers projetados para amplificar fragmentos da região de código de barras de DNA do vertebrado. COI gene, evitando co-amplificação de modelos de mosquito, sem multiplexado ou nested PCR. Os primers foram validados usando modelos de DNA de vertebrados hospedeiros de amostras de sangue de mosquitos de origem conhecida, representando todas as classes de vertebrados terrestres, e amostras de sangue de mosquitos coletadas em campo de origem desconhecida. Descobrimos que os primers eram geralmente eficazes na amplificação de hospedeiros vertebrados, mas não modelos de DNA de mosquito. Aplicado à amostra de amostras de sangue de mosquitos desconhecidos, & gt 98% (60/61) das amostras de sangue foram identificadas de forma confiável, demonstrando a viabilidade de identificar hospedeiros de mosquitos com os novos primers. Esses primers são benéficos porque podem ser usados ​​para amplificar COI modelos de uma ampla gama de hospedeiros vertebrados usando PCR padrão, agilizando assim o processo de identificação dos hospedeiros de mosquitos, e podem ser aplicados ao sequenciamento de DNA de próxima geração e abordagens de metabarcoding.


Artigo ORIGINAL RESEARCH

Luis M. Hern & # x000E1ndez-Triana 1 & # x0002A, Javier A. Garza-Hern & # x000E1ndez 2, Aldo I. Ortega Morales 3, Sean W. J. Prosser 4, Paul D. N. Hebert 4, Nadya I. Nikolova 4, Elsa Barrero 1, Erick de J. de Luna-Santillana 5, Vicente H. Gonz & # x000E1lez-Alvarez 6, Ram & # x000F3n Mendez-L & # x000F3pez 3, Rahuel J. Chan-Chable 3, Anthony R. Fooks 1 e Mario A. Rodr & # x000EDguez-P & # x000E9rez 5 & # x02020
  • 1 Agência de Saúde Vegetal e Animal, Departamento de Virologia, Grupo de Pesquisa de Zoonoses de Raiva e Vida Selvagem, Addlestone, Reino Unido
  • 2 Instituto de Ciencias Biom & # x000E9dicas, Universidad Aut & # x000F3noma de Ciudad Ju & # x000E1rez, Chihuahua, México
  • 3 Departamento de Parasitolog & # x000EDa, Universidad Aut & # x000F3noma Agraria Antonio Narro, Unidad Laguna, Perif & # x000E9rico Ra & # x000FAl L & # x000F3pez S & # x000E1nchez y Carretera a Santa Fe, Torre & # x000F3n, México
  • 4 Center for Biodiversity Genomics, University of Guelph, Guelph, ON, Canadá
  • 5 Instituto Polit & # x000E9cnico Nacional, Centro de Biotecnolog & # x000EDa Gen & # x000F3mica, Reynosa, México
  • 6 Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Aut & # x000F3noma de Guerrero, Chilpancingo, México

Existem & # x0007E240 espécies de Culicidae no México, das quais alguns são vetores de vírus transmitidos por artrópodes, como o vírus Zika, o vírus da dengue, o vírus chikungunya e o vírus do Nilo Ocidental. Assim, a identificação das preferências de alimentação do mosquito é fundamental para a compreensão das interações do vetor & # x02013host & # x02013-patógeno que, por sua vez, podem auxiliar no controle de surtos de doenças. Normalmente, DNA e RNA são extraídos separadamente para animal (insetos e hospedeiros de refeição de sangue) e identificação viral, mas este estudo demonstra que vários organismos podem ser analisados ​​a partir de um único extrato de RNA. Pela primeira vez, o DNA residual presente em extratos de RNA padrão foi analisado por código de barras de DNA em conjunto com Sanger e sequenciamento de última geração (NGS) para identificar as espécies de mosquitos e a fonte de suas refeições em fêmeas alimentadas com sangue capturadas em sete silvestres. comunidades no estado de Chiapas, México. Embora a identificação molecular do mosquito envolvesse métodos de código de barras padrão, a sensibilidade da identificação da refeição de sangue foi maximizada pelo emprego de primers curtos com NGS. No total, foram coletados 1.634 espécimes pertencentes a 14 gêneros, 25 subgêneros e 61 morfoespécies de mosquitos. Destas, quatro espécies foram novos registros para o México (Aedes guatemala, Ae. insolitus, Limatus asulleptus, Trichoprosopon pallidiventer), e nove foram novos recordes para o Estado de Chiapas. Sequências de código de barras de DNA para & # x0003E300 bp do gene COI foram obtidas de 291 espécimes, enquanto sequências de 130 bp foram recuperadas de outros 179 espécimes. Altos valores de divergência intraespecífica (& # x0003E2%) sugerindo complexos de espécies crípticas foram observados em nove táxons: Anopheles eiseni (5.39%), Um. pseudopunctipennis (2.79%), Ae. podographicus (4.05%), Culex Eastor (4.88%), Cx. errático (2.28%), Toxorhynchites haemorrhoidalis (4.30%), Tr. palidiventro (4.95%), Wyeomyia adelpha / Wy. Guatemala (7,30%), e Wy. pseudopecten (4,04%). O estudo aumentou o número de espécies conhecidas de mosquitos de 128 espécies para 138 espécies para o estado de Chiapas e 239 para o México como um todo. A análise da refeição de sangue mostrou que Aedes angustivittatus alimentado com patos e galinhas, enquanto Psorophora albipes alimentado em humanos. Culex quinquefasciatus alimentado com diversos hospedeiros, incluindo frango, humano, peru e grackle mexicano. Nenhum ARN de arbovírus foi detectado pela transcriptase reversa e # x02013 reação em cadeia da polimerase nas amostras pesquisadas. Este estudo demonstrou, pela primeira vez, que o DNA residual presente em extratos de farinha de sangue de RNA pode ser usado para identificar vetores hospedeiros, destacando o importante papel das abordagens moleculares na identificação do vetor e revelando as interações do hospedeiro & # x02013vetor & # x02013patógeno.


Técnicas mais antigas

Eletroforese de proteínas

Eletroforese de proteínas, particularmente combinada com coloração para atividade enzimática, já foi amplamente usada em estudos de sistemática de invertebrados e genética de populações, mas agora foi amplamente substituída por técnicas de DNA que podem fornecer uma fonte muito mais rica de informações. O uso de eletroforese para analisar o conteúdo do intestino de predadores artrópodes foi revisado em Murray et al. (1989) e Solomon et al. (1996). A abordagem mais comumente usada tem sido analisar extratos de predadores homogeneizados (ou apenas seus intestinos) em géis de poliacrilamida e coloração para atividade enzimática, especialmente esterases (por exemplo, Schelvis & Siepel 1988 Walrant & Loreau 1995). Os padrões de bandas são comparados com os das presas-alvo. As principais desvantagens dessa abordagem são a escassez de bandas diagnósticas específicas da espécie ou simplesmente a impossibilidade de separar os complexos padrões de bandas criados quando um único intestino de predador contém os restos de várias presas diferentes (Walrant & Loreau 1995). A eletroforese é mais eficaz quando os predadores se alimentam de um intervalo restrito de presas (por exemplo, Giller 1986 Lister et al. 1987 Dicke & de Jong 1988 Solomon et al. 1996) e ainda é usado ocasionalmente hoje (Corey et al. 1998 Paill 2000 Traugott 2001). A eletroforese em várias formas tem sido utilizada principalmente para analisar dietas de artrópodes como Coleoptera, Hemiptera e Acarina predadores. Também foi aplicado na pesquisa de vertebrados para estudar, por exemplo, as dietas de aves marinhas (Walter & O’Neill 1986 Freeman & Smith 1998).

Imunoensaios usando anti-soros policlonais

Os anti-soros policlonais têm sido amplamente usados ​​para analisar o conteúdo intestinal de predadores invertebrados por mais de 50 anos e o assunto (técnicas e aplicações, vantagens e desvantagens) foi amplamente coberto por várias revisões anteriores, principalmente em relação à predação por artrópodes terrestres (Boreham & Ohiagu 1978 Sunderland 1988 Greenstone 1996 Symondson & Hemingway 1997 Symondson 2002 Sunderland et al. no prelo). Hoyt et al. (2000) revisam o uso de anti-soros policlonais para estudar teias alimentares em ecossistemas marinhos e descrevem o uso de testes de pricipitina e Western blotting para estudar a predação por camarões em copépodes harpacticoides.

Resumidamente, as técnicas envolvem o aumento de anticorpos pela injeção de proteínas de presas alvo em um mamífero (geralmente um coelho). Após duas ou três dessas injeções, os anticorpos são colhidos do soro sanguíneo. Os anticorpos incluirão um grande número de especificidades diferentes que se ligarão a epítopos (locais de ligação) nos antígenos injetados. Essa mistura de anticorpos é então usada em uma variedade de formatos de ensaio diferentes para testar se os antígenos estão presentes no intestino de predadores coletados em campo e, portanto, se o consumo da presa-alvo ocorreu.

Os anticorpos e as amostras de teste foram reunidos de várias maneiras engenhosas (revisado em Boreham & Ohiagu 1978). Na maioria dos ensaios anteriores, os anticorpos e o antígeno foram autorizados a se difundir passivamente um em direção ao outro através de um fluido ou gel (testes de precipitina), ou reunidos mais rapidamente em um campo elétrico (imunoeletroosmoforese). Um precipitado branco indicou uma reação positiva, onde os anticorpos bivalentes formam matrizes com seus antígenos específicos. Essa abordagem tem sido usada extensivamente para analisar as dietas de uma ampla gama de predadores artrópodes (revisado por Greenstone 1996). Embora a maioria dos estudos tenha analisado a variedade de predadores que se alimentam de uma presa-alvo, em alguns, uma variedade de anti-soros foi desenvolvida para examinar mais amplamente a escolha de presas em, por exemplo, bosques (Dennison & Hodkinson 1983) e marinhos (Feller et al. Mayfield 1985 et al. 2000) ecossistemas. Uma elaboração do teste de precipitina, imunoeletroforese de foguete, permite a análise separada de diferentes antígenos dentro de uma amostra, combinando testes de eletroforese e precipitina. Este teste foi usado de forma eficaz, por exemplo, para analisar o conteúdo do intestino de cefalópodes para os restos de vários crustáceos (Boyle et al. 1986) e focas e golfinhos para os restos de salmonídeos (Pierce et al. 1990b). Curiosamente, a mesma abordagem foi considerada eficaz quando usada de forma não invasiva para analisar as fezes de focas em busca de restos de peixes em particular (Pierce et al. 1990a 1990b). Claramente, as focas pelo menos não desnaturam os antígenos proteicos completamente durante a digestão e talvez seja surpreendente que essa abordagem não tenha sido mais amplamente adotada para estudos de dietas de outros vertebrados (no entanto, consulte as técnicas de DNA abaixo).

As técnicas de precipitação ainda são ocasionalmente usadas em estudos de predação (por exemplo, Hoyt et al. 2000), apesar da disponibilidade de abordagens muito mais sensíveis, particularmente os ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISA). O ELISA ganha grande sensibilidade ao anexar uma enzima, direta ou indiretamente, aos anticorpos em um anti-soro. Os ensaios geralmente ocorrem em placas de microtitulação de 96 poços em que uma reação positiva é indicada pela presença da enzima, transformando um substrato de um produto incolor para um colorido na presença do antígeno específico. Os formatos e protocolos de ensaio e exemplos do uso de ELISA em estudos de predação são amplamente revisados ​​em Sunderland (1988), Greenstone (1996), Symondson & Hemingway (1997), Symondson (2002) e Sunderland et al. (no prelo). Usado pela primeira vez em estudos de predação por Miller (1981) e Ragsdale et al. (1981), anti-soros policlonais mais ELISA têm sido usados ​​para estudar as dietas de uma ampla gama de predadores invertebrados. Na maioria dos casos, os estudos analisaram novamente a variedade de predadores que se alimentam de uma espécie de presa alvo, como os pulgões (Crook & Sunderland 1984 Chiverton 1987 Sunderland et al. 1987), insetos mirídeos (McIver & Tempelis 1993) e larvas de Lepidoptera (Kapuge et al. 1987 DuDevoir & Reeves 1990). Em alguns casos, avaliações quantitativas foram feitas de predação por predadores-chave em diferentes condições ou em diferentes épocas do ano em relação ao consumo de presas (ELISA quantitativo) e densidade populacional de presas (por exemplo, Symondson et al. 1996). Métodos para estimar a predação no campo a partir de dados de ELISA (e outros sistemas de imunoensaio) foram revisados ​​por Sopp et al. (1992) e Mills (1997).

Dietas de vertebrados também foram estudadas ocasionalmente usando ELISA, incluindo a análise do conteúdo das colheitas de pinguins (Walter et al. 1986). O ELISA também tem sido usado para estudar as interações predador-presa entre invertebrados em ecossistemas marinhos: Theilacher et al. (1993) estudaram a predação por crustáceos nos estágios iniciais de anchovas (usando dot-ELISA - veja abaixo) Venter et al. (1999) investigaram a exploração do zooplâncton por lulas paralarvas e Mayfield et al. (2000) desenvolveram anti-soros para estudar a dieta de lagostas.

A propensão de anticorpos policlonais para reagir de forma cruzada (por exemplo, Mayfield et al. 2000) às vezes pode ser reduzido ou eliminado por absorção e precipitação (Symondson & Liddell 1993a) ou purificação por afinidade em uma coluna (Schoof et al. 1986), removendo efetivamente quaisquer anticorpos que se ligam a proteínas de uma espécie não-alvo. Aumentar anti-soros contra proteínas únicas, purificadas e específicas de presas pode melhorar a especificidade de um anti-soro, mas na prática ainda pode levar a problemas de reatividade cruzada (por exemplo, Blackwell et al. 1994). Um grande problema com os anti-soros policlonais é a ausência de reprodutibilidade: não há dois anti-soros com as mesmas propriedades, mesmo se criados no mesmo mamífero individual.


Introdução

A família Culicidae é clinicamente importante devido ao grande número de patógenos que algumas espécies transmitem a animais e humanos, e também é um condutor de inúmeras doenças infecciosas emergentes em todo o mundo (1, 2). O conhecimento das preferências de alimentação de sangue de uma espécie de mosquito fornece informações importantes sobre a dinâmica da transmissão do vírus, permitindo que as autoridades de saúde pública projetem e implementem estratégias eficientes para o controle do vetor (3). Patógenos vetores de mosquitos contribuem para a maior diversidade de doenças tropicais negligenciadas que impactam significativamente a saúde humana e animal (4). Existem 3.574 espécies de Culicidae reconhecidas em todo o mundo (5), portanto a correta identificação das espécies que atuam como vetores é fundamental para caracterizar as vias de transmissão do patógeno.

A seleção de hospedeiros e os estudos de preferência alimentar de mosquitos e outros artrópodes hematófagos, em combinação com a triagem de patógenos, desempenham um papel importante na compreensão da dinâmica das interações do vetor & # x02013 hospedeiro & # x02013patógeno (6 & # x0201316). Uma vez que as preferências alimentares são conhecidas e as espécies hospedeiras com risco de transmissão de patógenos transmitidos por artrópodes são identificadas, os mecanismos de transmissão da doença podem ser elucidados (17 & # x0201319). A caracterização sistemática da genética de aves e mamíferos hospedeiros aumentou a especificidade dos estudos. Impulsionada pelo uso de técnicas moleculares, a análise genética substituiu amplamente os métodos sorológicos para identificação de refeição de sangue (9). Vários marcadores genéticos foram usados ​​para este propósito, incluindo marcadores mitocondriais (por exemplo, cytB, COI) e nucleares (por exemplo, ITS2) (20, 21).

Embora a análise genética tenha substituído amplamente os métodos sorológicos, os estudos de preferência do hospedeiro enfrentam desafios. Em primeiro lugar, a identificação precisa de vetores de artrópodes é complicada pela similaridade morfológica das espécies, pela diminuição da perícia taxonômica e pela presença de complexos de espécies (22 & # x0201325). Em segundo lugar, a capacidade de recuperar uma sequência para o hospedeiro é afetada pelo grau de digestão da refeição de sangue dentro do mosquito, bem como pelo método de preservação após a captura (15, 16, 26). Terceiro, a presença potencial de patógenos na alimentação de sangue aumenta os problemas de biossegurança. Para superar a primeira barreira, a análise da região do código de barras do mtDNA COI (27, 28) agora é amplamente usada para identificações de mosquitos em todo o mundo (29 & # x0201334). Para mitigar o segundo desafio, os pesquisadores agora empregam sequenciamento de alto rendimento em combinação com coquetéis de primer específicos para vertebrados (35, 36). Em terceiro lugar, o uso de cartões FTA e sua análise em instalações com alta contenção, operando sob rígidas regulamentações de biossegurança, diminuíram as preocupações com a biossegurança. Coletivamente, esses avanços agora permitem aos pesquisadores ampliar sua compreensão das interações do hospedeiro & # x02013vetor & # x02013patógeno.

No México, 234 espécies de mosquitos foram registradas (37). Como alguns (Aedes aegypti. Ae. albopictus, Culex quinquefasciatus) são espécies-chave de vetores, o México está experimentando uma circulação contínua de arbovírus, como chikungunya (CHIKV), dengue (DENV), Zika (ZIKV) e Nilo Ocidental (WNV) (38). Os cenários silváticos em Chiapas, como a selva Lancadon, representam grande parte das florestas tropicais do México (39). Embora seja uma das regiões de maior biodiversidade da América Central, enfrenta uma destruição iminente devido às atividades humanas (40). Há pouca informação sobre a diversidade de mosquitos ou arbovírus circulando na selva de Lancadon ou em outras reservas no México, com exceção de um estudo anterior (41). Além disso, apenas alguns estudos epidemiológicos investigaram a identificação de refeição de sangue em mosquitos mexicanos. Por exemplo, (42) estudou a preferência alimentar do hospedeiro de Cx. quinquefasciatus em Monterrey, enquanto (3), (43) e (44) examinaram cidades na Península de Yucat & # x000e1n, ou (45) dentro de uma floresta montana. Neste estudo, uma abordagem integrada incluindo a identificação de mosquitos usando morfologia e código de barras de DNA, identificação de refeição de sangue usando sequenciamento de alto rendimento e triagem de arbovírus usando transcriptase reversa & # x02013 reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) foi usada para caracterizar a fauna de mosquitos e desvendar o hospedeiro & # x02013vetor & # x02013 interações de patógenos em comunidades silvestres no estado de Chiapas. Além disso, este estudo emprega um novo método de identificação de DNA hospedeiro de vertebrados a partir de traços residuais em extratos de RNA de artrópodes.


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As habilidades de reconhecimento de parentesco, demonstradas pela primeira vez há 25 anos em girinos de sapo, agora parecem amplas. mais habilidades de reconhecimento de parentesco, demonstradas pela primeira vez há 25 anos em girinos de sapo, agora parecem ser comuns entre os anfíbios. Em alguns vertebrados, o reconhecimento de parentesco é baseado, pelo menos em parte, em genes do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) altamente polimórficos. Além de proteger os animais da resistência a doenças, os genes MHC regulam o comportamento social. Eles permitem que os parentes se reconheçam para que possam cooperar para o benefício mútuo. Essas duas funções aparentemente distintas dos genes do MHC podem estar totalmente relacionadas, porque os animais precisam procriar para otimizar o sistema imunológico de sua prole. A capacidade de discriminar o tipo MHC é, portanto, provável que facilite a discriminação de parentesco em girinos.

Testei as preferências de associação de girinos de sapo com garras africanas (Xenopus laevis) em um aparelho de escolha de laboratório. Como em outras espécies de anuros, descobri que girinos em estágios iniciais de desenvolvimento se associam preferencialmente com irmãos desconhecidos em vez de não familiares, mas que essa preferência se inverte durante o desenvolvimento. Os girinos que se aproximam da metamorfose demonstraram uma reversão em sua preferência: escolhem preferencialmente não parentes em vez de parentes. A mudança ontogenética nas preferências de escolaridade larval coincide com o início do desenvolvimento controlado do hormônio tireoidiano (HT) e pode ser um indicativo de diminuição dos benefícios de aptidão associados à escolaridade com parentes em estágios posteriores de desenvolvimento. Isso pode resultar de um aumento na competição intraespecífica, predação ou suscetibilidade a doenças de indivíduos prometamórficos. Alternativamente, os comportamentos de evitação de parentesco observados em estágios larvais posteriores podem refletir um comportamento dissociativo que facilita a evitação de consanguinidade na maturidade reprodutiva. Este é o primeiro estudo a encontrar uma mudança de uma preferência de associação por parentes para não parentes durante o desenvolvimento larval de anfíbio.

Usando técnicas de PCR específicas de alelo para girinos do tipo MHC, testei as preferências de associação entre irmãos com base em haplótipos MHC compartilhados. Usando apenas irmãos inteiros em testes experimentais, controlei a variação genética em outras partes do genoma que poderia influenciar as preferências de escolaridade. Descobri que os girinos X. laevis discriminam entre irmãos completos familiares com base nas diferenças nos genes MHC. Indivíduos de quatro famílias preferencialmente escolarizados com irmãos MHC idênticos àqueles com os quais eles não compartilhavam ou compartilhavam um haplótipo. Além disso, a força das preferências de escolaridade sortidas de MHC dos girinos se correlacionou significativamente com diferenças de aminoácidos na região de ligação de peptídeo (PBR) de ambos os loci MHC de classe I e II. Uma vez que os polimorfismos de MHC-PBR determinam o pool de peptídeos que podem servir como ligantes para moléculas de MHC, essas descobertas suportam a hipótese de que ligantes de peptídeos de MHC medeiam a discriminação de tipo de MHC. Como os sujeitos do teste estavam igualmente familiarizados com todos os grupos de estímulos, a discriminação dos girinos parece envolver um mecanismo de reconhecimento genético autorreferente, por meio do qual os indivíduos comparam seu próprio tipo de MHC com os de membros da mesma espécie.

Eu também descobri que diferenças genéticas não ligadas ao MHC contribuem para as preferências de associação de girinos em testes que contrastam MHC e parentesco. Os girinos não discriminaram entre não irmãos MHC-semelhantes e irmãos MHC-dissimilares e preferencialmente associados com não-irmãos MHC-dissimilares em vez de não-irmãos MHC-semelhantes. Embora o MHC possa não ser o único responsável pelas pistas geneticamente determinadas que direcionam as preferências de associação de girinos, certamente é importante para facilitar a discriminação entre membros da mesma espécie em girinos X. laevis. A discriminação baseada em MHC pode ser retida através da ontogenia e servir para manter os polimorfismos do MHC ao facilitar o acasalamento desassortativo.


Resultados

Amostras de campo.

Usando armadilhas luminosas do CDC, flebotomíneos fêmeas alimentados com sangue foram coletados de três diferentes focos CL conhecidos: Ma'ale Adumim (159), Kfar Adumim (70) e Tiberíades (32). Os mosquitos alimentados com sangue foram coletados em Arava (19), Tel-Aviv (18) e Jerusalém (13 Tabela 1). Ao todo, 261 flebotomíneos fêmeas de três Phlebotomus espécie (P. sergenti, Phlebotomus papatasi (Scopoli), e Phlebotomus syriacus Adler & amp Theodore) e 50 mosquitos fêmeas de dois Culex espécie (Cx. pipiens e Cx. perexiguus) foram analisados ​​durante 2006 e 2007 (Tabela 1).

Número de flebotomíneos e mosquitos testados, listados por espécie e localização

Número de flebotomíneos e mosquitos testados, listados por espécie e localização

Condição da Farinha de Sangue.

Os flebotomíneos foram rastreados quanto ao frescor e tamanho da farinha de sangue (Tabela 2). A triagem detectou uma proporção maior de refeições de sangue grandes e médias (67%) do que pequenas (27%) e muito pequenas (6%). A maioria dos farelos de sangue grandes e médios eram de cor vermelha, enquanto a maioria dos restos de sangue menores eram marrons (Tabela 2). O tamanho e a cor da farinha de sangue tiveram um efeito significativo combinado (F = 3,35 df = 3 P = 0,016) na detectabilidade de PCR. A detectabilidade não foi afetada pela cor dos farelos de sangue médio e grande. Detectabilidade de pequenas refeições vermelhas de sangue era semelhante à de grandes refeições de sangue, mas foi reduzida em pequenas refeições de sangue marrom. Reduções adicionais foram observadas em farinha de sangue marrom muito pequena. A significância dos efeitos separados foi F = 4,8 df = 1 e P = 0,029 para frescor e F = 6,08 df = 3 e P = 0,001 para o tamanho. A identificação de refeições de sangue não pôde ser realizada em 26 amostras devido à falha na amplificação da PCR e / ou baixa qualidade da sequência, mesmo após várias tentativas de amplificação (Fig. 1).

Correlação entre o tamanho da farinha de sangue do flebotomíneo e o frescor e análise de PCR bem-sucedida

Correlação entre o tamanho da farinha de sangue do flebotomíneo e o frescor e análise de PCR bem-sucedida

Amplificação por PCR de amostras selecionadas usando os primers 12S (A) e 12-16S (B).

Amplificação por PCR de amostras selecionadas usando os primers 12S (A) e 12-16S (B).

Identificação do host.

A validação do método foi realizada em DNA extraído de amostras de sangue de espécies conhecidas de vertebrados (hyrax, cachorro, gato, ovelha, perdiz e humano) e mosquitos de laboratório alimentados com humanos, codornizes, camundongos e hamsters. As amostras foram amplificadas e sequenciadas usando ambos os conjuntos de primers. Polimorfismo de DNA foi detectado entre todas as amostras estudadas para ambas as regiões gênicas (Supp Tabela 1 [online apenas]: A, 12S B, 12-16S). A validade foi testada em 50 amostras de sangue usando os dois conjuntos de primers. A identificação das espécies com base em ambos os conjuntos de primers foi obtida na maioria das amostras (37, 74%). Dez hematomas (20%) foram identificados apenas pelo par de primers 12S e dois (4%) foram identificados apenas pelo par de primers 12-16S. A identificação inconsistente de espécies usando dois conjuntos de primers foi observada para apenas uma amostra.

A identificação bem-sucedida do hospedeiro a partir de refeições de sangue foi alcançada em 285 (92%) de todas as amostras (Tabela 3): compreendendo flebotomíneos (P. sergenti [221, 94%], P. papatasi [15, 75%], e P. syriacus [5, 71%]) e mosquitos (Cx. perexiguus [15, 94%] e Cx. pipiens [29, 85%]). As farinhas de sangue identificadas foram de 22 espécies de vertebrados domésticos e selvagens, compreendendo 13 mamíferos e 9 aves. Similaridade com divergência de sequência & lt2% foi alcançada para 12 mamíferos (93%) e 4 (44%) hospedeiros aviários. Semelhanças mais baixas (90-96%) de sequências de alta qualidade permitiram a identificação até o nível de gênero no caso de Gazela (Mammalia: Cervidae) e ao nível de família no caso dos Phasmidae (Aves: Galliformes). Entre os Phasmidae, 18 amostras pertencentes a um grupo eram idênticas à perdiz local (Alectoris chukar), comum nas áreas de estudo. As outras 11 sequências de Phasmidae, ainda, não foram identificadas em nível de espécie. Um grupo adicional de 10 amostras semelhantes de aves com divergência de sequência de 6–8% das sequências do GenBank foram identificadas como pombos (Aves: Columbiformes: Columbidae). Uma sequência aviária com similaridade de & lt90% com as sequências GenBank mais próximas foi identificada para a classe Aves. A identificação das espécies via sequenciamento de DNA determinou que quase sempre havia um hospedeiro por refeição de sangue. Apenas alguns cromatogramas tiveram picos duplos, interpretados como representando origens de múltiplos hospedeiros. As sequências de misturas de DNA preparadas a partir de duas espécies conhecidas de vertebrados retornaram resultados inconsistentes do cromatograma. Assim, não fomos capazes de atribuir múltiplas origens do sangue a cromatogramas com picos duplos.

Identificação de DNA hospedeiro em flebotomíneos e mosquitos coletados em campo, determinada pela análise do gene 12S – 16S rRNA

Identificação de DNA hospedeiro em flebotomíneos e mosquitos coletados em campo, determinada pela análise do gene 12S – 16S rRNA

Vinte e um táxons hospedeiros diferentes foram identificados nas refeições de sangue extraídas de P. sergenti Fêmeas de flebotomíneos coletadas nos três focos CL (Tabela 3). A maioria (85%) era de 13 diferentes hospedeiros mamíferos. Três espécies de faisões nidificantes e terrestres constituíram 80% (27/34) das focas de origem aviária. Dos 221 farelos de sangue identificados, DNA de rock hyrax foi encontrado em 42% das mulheres e DNA de gato doméstico em 23%. A proporção desses dois hosts mais comuns foi diferente nos três locais de estudo (Tabela 4), refletindo a disponibilidade do host. O DNA de Hyrax foi encontrado em 84% das fêmeas coletadas em Tiberíades, em 47% das fêmeas de Kfar Adumim e em apenas 24% das fêmeas de Ma'ale Adumim. Cerca de um terço (36%) das fêmeas de Ma'ale Adumim continha DNA de gato doméstico, enquanto apenas algumas farinhas de gatos domésticos foram detectadas em flebotomíneos coletados em Tiberíades e em Kfar Adumim. Seis espécies hospedeiras foram identificadas em 15 refeições de sangue de P. papatasi e cinco espécies hospedeiras em 5 farinhas de sangue de P. syriacus. O sangue de rock hyrax, gato doméstico e cachorro doméstico foi encontrado em ambas as espécies. O DNA da gazela foi identificado em seis P. papatasi mulheres (Tabela 3). A maioria dos identificados Cx. pipiens refeições de sangue eram de mamíferos (26 de 29, 90%), enquanto uma alta proporção de Cx. perexiguus as refeições de sangue eram de origem aviária (10 de 15, 67% Tabela 3).

O número de vezes e frequência (%) em que as espécies hospedeiras foram identificadas em refeições de sangue de P. sergenti coletados em três locais diferentes

O número de vezes e frequência (%) em que as espécies hospedeiras foram identificadas em refeições de sangue de P. sergenti coletados em três locais diferentes

O DNA humano foi identificado em 13 amostras de sangue Cx. pipiens (4 de 29, 11%), P. papatasi (2 de 15, 13%), e P. sergenti (7 de 221, 3%).

Leishmania Detecção.

Todas as 261 amostras de flebotomíneos foram selecionadas para Leishmania DNA por PCR usando um conjunto de primer publicado anteriormente (El Tai et al. 2000). Leishmania DNA foi encontrado em três P. sergenti fêmeas de flebotomíneos (3 de 27 [11%]) de Tiberíades que continham sangue de hyrax e não foi detectado em nenhuma das fêmeas alimentadas com outros hospedeiros ou em outras espécies de flebotomíneos (Fig. 2).

Amplificação por PCR de Leishmania DNA de ingurgitado P. sergenti fêmeas coletadas em Tiberíades.

Amplificação por PCR de Leishmania DNA de ingurgitado P. sergenti fêmeas coletadas em Tiberíades.


Discussão

As moscas-pretas têm sido o foco de muitos estudos, uma vez que são fortes alimentadores de sangue e vetores competentes de agentes de doenças humanas e animais. No entanto, até o momento, eles não foram implicados na infecção e possível transmissão de D. immitis ou D. repens. Encontramos uma alta prevalência de S. turgaicum (s.l.) in the region, with blood meals primarily from humans and dogs, and with DNA of the microfilariae of both species in the specimens with empty abdomens which are unfed or fully gravid. Detection of filarial DNA in blackflies with empty abdomens indicates considerable age or survival which is epidemiologically thought-provoking indicating that the parasite is still present following the blood-digestion process and may evolve to its infective stage. The second point should be confirmed in future studies by confirming the vitality of the nematodes or the developmental stages of the microfilariae in the epidemiologically important parts of the fly’s body.

Dirofilariasis is largely caused by two parasites, D. (Dirofilaria) immitis (Leidy, 1856) and D. (Nochtiella) repens (Railliet & Henry, 1911) (Spirurida: Onchocercidae), in humans and carnivores, with distinct clinical and epidemiological features. Dirofilaria immitis is responsible for severe cardiopulmonary dirofilariasis, whereas D. repens causes non-pathogenic subcutaneous dirofilariasis in canids and felids. De acordo, D. immitis e D. repens are globally regarded as human pulmonary and hypodermic/ophthalmic dirofilariasis, respectively [28, 29]. Herein we detected both nematodes in the study areas however, their clinical manifestations need to be determined in detail in the future.

Successful development of the Dirofilaria species depends on an intermediate mosquito species and a vertebrate as a definitive host [30]. Many species of culicid mosquitoes in the genera Aedes, Anopheles, Armigeres, Coquillettidia, Culex, Culiseta, Mansonia e Psorophora allow the development of both D. immitis e D. repens [31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55] which may transmit carrying worms to available vertebrates. Dirofilaria immitis, can parasitize many canines and felines in tropical, subtropical, and temperate regions worldwide [56]. However, filarial infections of dog, cat, fox, wolf, coyote, and least weasel by D. repens have been documented only in Old World countries [56]. Humans are not appropriate hosts for Dirofilaria spp. however, among mammalian hosts, dogs are the most important reservoir host for human infection of both species of Dirofilaria [57].

Human and animal dirofilariasis has been documented in 11 of the 31 provinces of Iran. In two main foci of the country (southern regions of the Aras River: East Azerbaijan and Ardebil Provinces), the highest frequencies of dirofilariasis caused by D. immitis were 36.8% in dogs, 57.1% in jackals, 50% in foxes, 50% in wolves, and 0.8% in cats, and by D. repens, 60.8% in dogs and 10% in jackals [48, 58]. Fourteen cases of human subcutaneous, ocular, testicular, and pulmonary dirofilariasis have been reported in the country [58]. The infective third-stage larvae of D. immitis e Setaria labiatopapillosa (Alessandrini) (Spirurida: Onchocercidae) were, respectively, reported in Cx. theileri e An. maculipennis [48].

Even if the presence of DNA of these parasites in the blackflies is suggestive, further studies are needed to demonstrate that blackflies are true vectors of D. immitis/D. repens. Simulium turgaicum (s.l.) was the most widespread blackfly in all ecotypes studied of the ten villages of Khoda-Afarin County. o Dirofilaria spp. infection rate in S. turgaicum (s.l.) (0.625%) was significantly lower compared to those observed in culicid mosquitoes (0.85–10%) [29]. These flies frequently feed on humans and dogs and potentially could pick up Dirofilaria spp. The possibility of blackflies as vectors of the Dirofilaria in this study is reinforced by studies showing that D. ursi Yamaguti, 1941 is transmitted by blackflies to black bears in North America and Japan [59, 60]. Likewise, in support of the vectorial activities of simuliids in Iran, a nodular eye lesion of human onchocerciasis caused by O. lupi and the involvement of blackflies in its transmission has been reported from center of the country [61].

Complex interactions between intrinsic and extrinsic factors influence vector competence. Intrinsic factors, such as genetics and physiology, as well as behavioral traits, may govern an insect’s ability to acquire, support development, and transmit pathogenic agents. Extrinsic factors include the populations of the host reservoir and their activity patterns, climatic conditions, genetic variability in infectivity of pathogens, and even gut microorganisms [62,63,64,65,66,67]. Although blackflies are recognized as one of the most important medical and veterinary groups of arthropods due to their vector competence, there is a little information on their biology and ecology in Iran. This study is the first step for issuing public health policies and blackfly control campaigns in Iran, as well as those interested in studying the factors affecting vector eligibility.

Development of filarial nematodes to the third larval stage in the intermediate insect vector is essential for successful transmission to the definitive host. Microfilaria such as D. ursi develops to the third larval stage in the Malpighian tubules of the corresponding vector [68]. However, vector incrimination of blackflies relies on the presence of L3 worms in the head capsules of the female insects [68]. Future studies should be conducted to locate microfilariae in the Malpighian tubules and head capsules of the females of S. turgaicum (s.l.)

The literature shows that D. immitis e D. repens can infect many species of mammals varying in both quantity and quality [29]. Dissimilarity in susceptibility to parasites is common in multi‐host, multi‐parasite collections, and can have profound significance for ecology and evolution in these systems [69, 70]. This may lead to heterogeneous and asymmetric transmission among and between host species [71,72,73,74]. The results of the present study show that insects other than Culicidae mosquitoes may be involved in establishing a cycle of dirofilariasis in the region. Since both D. immitis e D. repens can infect many species of mammals and can be transmitted by various vector species of mosquitoes and blackflies, they exhibit poor host specificity in terms of definitive and intermediate hosts [75]. These findings challenge our ability to recognize, forecast, and handle dirofilariasis dynamics in the region.

The results of this study revealed that S. turgaicum (s.l.) has diverse host preferences and feeds on humans, dogs, bovids and birds. A majority (69%) of the specimens fed on humans and/or dogs. This may be related to host availability in the region and could have important epidemiological consequences. Dogs are the main reservoir of Dirofilaria spp., and if a blackfly prefers to feed on humans and dogs, then the probability of becoming infected and then transmitting the parasite to a human will be increased. However, to incriminate S. turgaicum (s.l.) as an actual vector of D. immitis e D. repens, more information on the biological and ecological factors that influence the transmission of these parasites in the studied region should be provided. These are included, but not limited to, parous rates, daily and seasonal fluctuations of biting activities (especially of parous females), preference for human body parts, longevity, flight range, and gonotrophic cycle [76].


We appreciate permission from Texas Parks and Wildlife Division and Government Canyon State Natural Area for providing access to the campgrounds and caves to facilitate this study. We would also like to acknowledge the students of VIBS/ENTO 426/626 that participated in field work.

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Keywords: soft ticks, Argasidae, Ornithodoros turicata, blood meal, host identification

Citation: Busselman RE, Olson MF, Martinez V, Davila E, Briggs C, Eldridge DS, Higgins B, Bass B, Cropper TL, Casey TM, Edwards T, Teel PD, Hamer SA and Hamer GL (2021) Host Bloodmeal Identification in Cave-Dwelling Ornithodoros turicata Dugès (Ixodida: Argasidae), Texas, USA. Front. Vet. Sci. 8:639400. doi: 10.3389/fvets.2021.639400

Received: 08 December 2020 Accepted: 20 January 2021
Published: 15 February 2021.

Markéta Nováková, Masaryk University, Czechia
Deon Bakkes, Agricultural Research Council of South Africa, South Africa

Copyright © 2021 Busselman, Olson, Martinez, Davila, Briggs, Eldridge, Higgins, Bass, Cropper, Casey, Edwards, Teel, Hamer and Hamer. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (CC BY). The use, distribution or reproduction in other forums is permitted, provided the original author(s) and the copyright owner(s) are credited and that the original publication in this journal is cited, in accordance with accepted academic practice. No use, distribution or reproduction is permitted which does not comply with these terms.


JCP: participated in the conception and design of the study, carried out the sample collection, DNA extraction PCR analysis and drafted the manuscript. LS: participated in the conception and design, helped optimize the extraction and PCR analysis and helped to draft the manuscript. DL: carried out the PCR-based detection assay. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.

The authors gratefully acknowledge the financial support from Fulbright Fellowship (JCP), NSF DUE-0436330 (LS), and UVM Honor's College (DL) program. We also thank Lila Specker, Erin Michaud, Bior K. Bior and James Wood for technical assistance.


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