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Citometria de fluxo para aprender sobre o ciclo celular

Citometria de fluxo para aprender sobre o ciclo celular


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Estou postando meus dados de citometria de fluxo aqui novamente porque sei que há muitas pessoas dispostas a me ajudar e posso aprender muito com vocês.

Neste laboratório de cultura de células, usamos o linfoblasto Cell U-937. E queremos aprender como podemos analisar o ciclo celular usando citometria de fluxo.

Alguém poderia me ajudar a explicar como ler o resultado da citometria de fluxo relacionado com o ciclo celular? Ficarei muito feliz em aprender com vocês.

Desde já, obrigado!


A base da análise de dados de citometria de fluxo em relação ao ciclo celular é o fato de que a síntese de DNA ocorre na fase S e, portanto, as células antes da fase S (G0 / G1) têm metade da quantidade de DNA em comparação com as células após a fase S ( G2). [A fase M dura muito para ter alguma relevância para este tipo de análise]. Os sinais que têm menos DNA do que as células da fase G0 / G1 são artefatos ou células apoptóticas com DNA fraturado (são rotulados como sub G1).

Para medir a quantidade de DNA por célula, utiliza-se o corante PI (iodeto de propídio), que se liga quantitativamente ao DNA. Portanto, a distribuição do sinal PI pode ser considerada como uma distribuição dos diferentes estágios do ciclo celular.

Este artigo da Wikipedia também explica a análise em mais detalhes e fornece referências adicionais.


Deep Learning for Imaging Flow Cytometry: Cell Cycle Analysis of Jurkat Cells

A citometria de fluxo de imagem combina a sensibilidade à fluorescência e os recursos de alto rendimento da citometria de fluxo com a imagem de célula única e, portanto, fornece dados de alto volume bem combinados com os pontos fortes do aprendizado profundo. Apresentamos DeepFlow, um fluxo de trabalho de análise de dados para citometria de fluxo de imagem que combina redes neurais convolucionais profundas com redução de dimensão não linear. O DeepFlow usa recursos aprendidos da rede neural para visualizar, organizar e interpretar biologicamente os dados de uma única célula. Dissecar o ciclo celular como fonte de variabilidade célula a célula é crucial para a biologia quantitativa de uma única célula. Demonstramos o DeepFlow para um grande conjunto de dados de células Jurkat em ciclo celular. Primeiro, reconstruímos a progressão contínua das células ao longo do ciclo celular a partir de dados de imagem brutos. Isso mostra que o DeepFlow pode aprender uma medida de distância contínua entre fenótipos categóricos. Em segundo lugar, somos capazes de detectar e separar uma subpopulação de células mortas, embora o conjunto de dados tenha sido limpo usando abordagens estabelecidas. DeepFlow detecta essa subpopulação morfologicamente anormal de maneira não supervisionada. Terceiro, na classificação livre de rótulos das fases do ciclo celular, alcançamos uma redução de 6 vezes na taxa de erro em comparação com uma abordagem recente baseada no aumento de uma série de recursos de imagem. Em contraste com os métodos anteriores, as previsões do DeepFlow são rápidas o suficiente para considerar a integração com o processo de medição de citometria de fluxo de imagem.

Resumo do Autor Apresentamos DeepFlow, um fluxo de trabalho de análise de dados baseado em aprendizado profundo otimizado para os requisitos de citometria de fluxo de imagem. Nós o usamos para analisar um grande conjunto de dados de um certo tipo de células T humanas (células Jurkat), que passam pelo ciclo celular. O DeepFlow permite reconstruir a progressão contínua do ciclo celular dessas células e separa as células mortas das vivas. Mostramos como os recursos aprendidos da rede neural podem ser visualizados e interpretados biologicamente. Quando usado para classificar o estágio do ciclo celular, o DeepFlow tem um desempenho significativamente melhor do que as abordagens anteriores.


Capítulo 5 Análise do ciclo celular de apoptose usando citometria de fluxo

Usando citometria de fluxo para analisar populações de células assíncronas e sincronizadas, este capítulo descreve uma série de características da apoptose induzida por drogas em células em cultura: (1) a apoptose pode ocorrer em qualquer fase do ciclo celular (2) um determinado agente pode induzir a apoptose em mais de uma fase do ciclo celular (3) há uma relação temporal clara entre a "parada" do ciclo celular induzida por diferentes agentes e o início da apoptose (4) a proteólise de proteínas intracelulares específicas representa um evento precoce de apoptose (5) a mitose aberrante precede a apoptose sob uma variedade de condições, incluindo a exposição a inibidores da síntese de DNA (6) células com sub-G, conteúdo de DNA nem sempre células apoptóticas (7) conteúdo de DNA pode ser um índice não confiável da posição do ciclo celular e (8) em todas as condições, a “estase” do ciclo celular precede a apoptose induzida por drogas. O capítulo descreve exemplos específicos de aplicações de métodos de citometria de fluxo padrão para a análise de apoptose induzida por drogas em células HeLa S3.


  • Princípios aprofundados de citometria de fluxo
  • Avaliação da qualidade e validação do instrumento
  • Princípios e diretrizes para projeto experimental, especialmente para citometria de fluxo multicolorida
  • Coloração de tecidos com antígenos de superfície celular
  • Perfis de coloração do ciclo celular em células fixas e vivas
  • Avaliação da proliferação e divisão celular
  • A beleza e os encargos das proteínas de fluorescência em citometria de fluxo
  • Multi-sessões detalhadas sobre a análise de dados de citômetros de fluxo em cooperação com FlowJo
  • Se solicitado, exploração de dados de citometria de fluxo paramétricos muito altos destacando importantes questões de projeto experimental e análise com dados reais de laboratórios colaboradores.

Nosso objetivo com este curso é ensinar o básico desta tecnologia com uma grande ênfase no trabalho prático com os instrumentos. Nada é melhor do que aprender fazendo. Temos um grande conjunto de instrutores experientes nessa tecnologia, ministrando palestras e acompanhando você no laboratório fazendo o fluxo por conta própria. Teremos o suporte do FlowJo entregando o básico e alguns recursos avançados em várias sessões. Este curso aprofundado de cinco dias impulsionará seus conhecimentos e habilidades, preparando-o para quaisquer projetos de fluxo à frente em seu caminho de pesquisa.


Tendo dominado os fundamentos da citometria de fluxo, o treinamento em técnicas avançadas, como projeto experimental, é importante. Por exemplo, mudar de um painel de quatro a seis cores para um painel de dez a doze requer consideração e planejamento extras. Cursos que cobrem tópicos como controles, compensação e desenho experimental são bons para expandir a base de conhecimento dos citometristas.

Indo além de um experimento de fenotipagem, há uma série de técnicas específicas que o treinamento avançado pode ser útil. A análise do ciclo celular de DNA, por exemplo, requer experiência específica em como corrigir e corar células de maneira adequada, bem como em como realizar a análise. A proliferação e a análise cinética são duas outras técnicas especializadas que ajudam a estudar os detalhes.

Onde essa educação pode ser encontrada? Comece com a instalação central local e aprenda qual treinamento eles oferecem. Também pergunte sobre quais outros recursos eles recomendariam. Webinars para fornecedores e palestras no local podem fornecer oportunidades adicionais. Os fornecedores também oferecem treinamento específico para instrumentos. Sociedades de citometria, como ISAC, iCCS, ESCCA e outras, costumam ter cursos que podem fornecer oportunidades educacionais adicionais. Obviamente, a Expert Cytometry pode oferecer treinamento em grupo ou individual também. Assine nosso boletim informativo para saber mais.

Tim Bushnell é PhD em Biologia pelo Rensselaer Polytechnic Institute. Ele é cofundador da - e mente didática por trás - da ExCyte, a empresa líder mundial em treinamento de citometria de fluxo, cuja organização possui uma verdadeira biblioteca de recursos de laboratório sobre sequenciamento, microscopia e tópicos relacionados nas ciências da vida.


Medindo Respostas Biológicas com Microscopia Automatizada

Simon Stubbs, Nick Thomas, em Methods in Enzymology, 2006

Projeto e construção de sensores de ciclo celular dinâmico

A aplicação de proteínas fluorescentes à análise do ciclo celular permitiu avanços significativos na compreensão do tempo de eventos moleculares que controlam o ciclo celular. Enquanto a proteína fluorescente verde (GFP) se funde com proteínas-chave de controle do ciclo celular (Arnaud et al., 1998 Huang e Raff, 1999 Raff et al., 2002 Weingartner et al., 2001 Zeng et al., 2000) e outras proteínas (Kanda et al., 1998 Reits et al., 1997 Tatebe et al., 2001) forneceram insights muito significativos sobre a mecânica molecular do ciclo celular, a expressão de fusões de proteínas do ciclo celular que retêm enzimas ou atividade estrutural têm o potencial de perturbar o ciclo celular e, portanto, não são adequados como sensores do ciclo celular (Clute e Pinheiros , 1999).

Para fornecer sensores stealth não perturbadores do ciclo celular, desenvolvemos construções (Fig. 1) com base na fusão de EGFP a domínios isolados de proteínas de controle e resposta do ciclo celular bem caracterizadas. O primeiro desses sensores relata a transição G1 / S e o segundo relata a transição G2 / M.

Figura 1 . Marcadores de fase do ciclo celular de EGFP. A expressão constitutiva do sensor G1 / S (A) é alcançada por meio de um promotor de ubiquitina C (UbC) que conduz a produção de uma proteína de fusão entre EGFP e a região C-terminal da DNA helicase B humana contendo uma fosforilação e domínio de localização subcelular (PSLD) . A proteína de fusão fluorescente localiza-se no núcleo nas células G1 (B) e sofre translocação para o citoplasma à medida que as células progridem através da fase S e em G2. A expressão do sensor G2 / M (C) é controlada pelo promotor da ciclina B1 (CCNB1), que inicia a produção da proteína de fusão ciclina B1-EGFP na fase S tardia. Conforme as células progridem através da fase S tardia para G2, a fluorescência aumenta no citoplasma (D) até que a fosforilação da sequência de retenção citoplasmática (CRS) cause a translocação do sensor para o núcleo na prófase. Na anáfase, o sensor é degradado rapidamente, mediado pela caixa de destruição da ciclina B1 (D-box), produzindo duas células-filhas não fluorescentes após a mitose.

O marcador de fase do ciclo celular G1 / S (Fig. 1A e B) é derivado do homólogo humano da helicase B (HELB), uma proteína essencial para a transição G1 / S (Taneja et al., 2002). Foi demonstrado que HELB está localizado em focos nucleares induzidos por danos ao DNA (Gu et al., 2004), onde a proteína opera durante G1 para processar danos ao DNA endógeno antes da transição G1 / S. Consistente com a ação proposta de HELB, a proteína reside no núcleo durante G1, mas é predominantemente citoplasmática nas células da fase S e G2. A residência citoplasmática e nuclear coordenada do ciclo celular é controlada por um domínio de controle de localização subcelular dependente de fosforilação C-terminal de 131 aminoácidos (PSLD) contendo uma sequência de localização nuclear que retém a proteína no núcleo em G1. No final da fase G1, os resíduos de serina dentro do PSLD tornam-se fosforilados pelo aumento dos níveis de ciclina E / Cdk2 ativa, resultando no desmascaramento de uma sequência de exportação nuclear levando à exportação de proteínas para o citoplasma. O marcador de fase do ciclo celular G1 / S é uma fusão do domínio PSLD de HELB com EGFP, com expressão sob o controle do promotor da ubiquitina C humana. O sensor exibe alterações de localização subcelular que imitam aquelas de HELB (Figs. 1B e 2B), mas não interfere com a progressão do ciclo celular, uma vez que a proteína de fusão não possui os domínios enzimáticos e estruturais da proteína original.

Figura 2 . Marcadores de fase do ciclo celular de EGFP. (A) Imagens de lapso de tempo foram adquiridas no IN Cell Analyzer 3000 de células U-2 OS expressando de forma estável os sensores G2 / M (superior) e G1 / S (inferior) EGFP, e células típicas em transição dos principais períodos de relatório para cada linha celular são mostrados. Na série G2 / M a célula central no primeiro quadro (com setas) está em G2 e transições via prófase (EGFP no núcleo) através de mitose e citocinese com destruição do sensor produzindo duas células filhas (com setas) no quadro final com mínimo Fluorescência EGFP. Na série G1 / S, a célula central no primeiro quadro (com setas) está em M e se divide para produzir duas células-filhas com núcleos fluorescentes brilhantes (segundo quadro com setas), que transitam através de S e em G2 com um movimento associado do Sensor EGFP do núcleo ao citoplasma. (B) As células de imagens de lapso de tempo foram analisadas quanto à intensidade de EGFP e distribuição subcelular. Traços típicos para células expressando sensor G1 / S (razão nuclear / citoplasmática de EGFP) e G2 / M (intensidade de EGFP), cada traço começa na mitose, rastreia a saída do sensor através do ciclo celular em uma única célula filha e termina na mitose.

O marcador de fase do ciclo celular G2 / M (Fig. 1C e D) utiliza elementos funcionais da ciclina B1. A expressão e destruição da ciclina B1 (Pines, 1999) são rigidamente reguladas e atuam como uma chave de controle do ciclo celular principal que pode ser aplicada para projetar um sensor adequado para acompanhar a transição da fase S através do G2 para a mitose. O sensor (Thomas, 2003 Thomas e Goodyer, 2003) compreende uma fusão de aminoácidos 1-170 do terminal amino da ciclina B1 acoplado a EGFP, com expressão sob o controle do promotor da ciclina B1 (Hwang et al., 1995). O sensor é ligado na fase S tardia (Fig. 1D), desligado durante a mitose pela caixa de destruição (D-box) (Clute e Pines, 1999), e, no período intermediário, transloca-se do citoplasma para o núcleo na prófase, regulada pelo sinal de retenção citoplasmática (Hagting et al., 1999). A proteína de fusão é consequentemente expressa e degradada em conjunto com a ciclina B1 endógena. Como a proteína de fusão carece das sequências C-terminais usadas na interação ciclina B1-CDK, ela não interfere na progressão do ciclo celular, conforme relatado anteriormente para uma proteína de fusão ciclina B1-GFP completa (Takizawa e Morgan, 2000).

Para garantir a perturbação mínima do ciclo celular, as linhas de células U-2 OS estáveis ​​que expressam os sensores G1 / S e G2 / M foram derivadas por meio de triagem rigorosa de um grande número de clones e seleção de clones únicos que demonstram níveis mínimos de expressão de EGFP compatível com determinação do estado do ciclo celular por microscopia e análise de imagem.

A imagem de lapso de tempo (Fig. 2A) revela o comportamento dinâmico dos sensores EGFP ao longo do ciclo celular. Ambos os sensores exibem características multifásicas para intensidade e / ou localização de EGFP (Fig. 2B). O sensor G2 / M mostra uma queda dramática na intensidade após a mitose (0–0,5 h), mantém baixa fluorescência através de G1 (0,5–3 h) e um aumento lento na intensidade através da fase S (3–15 h) seguido por um aumento escalonado na expressão do sensor por meio de G2 (15–21 h). À medida que as células completam o ciclo celular, o sensor aumenta rapidamente de intensidade à medida que as células passam pela prófase (21–22 h), com a intensidade atingindo um máximo na mitose (23,5 h). A distribuição do sensor G1 / S varia de maneira oposta. Após a mitose (1,5 h), o sensor é quase totalmente restrito ao núcleo e durante G1 (1,5–5,5 h) é exportado para o citoplasma, resultando em distribuição igual do sensor entre o núcleo e o citoplasma. A exportação nuclear continua em uma taxa mais lenta até a conclusão da fase S (5,5–14 h), momento em que o sensor é predominantemente citoplasmático. A progressão por meio de G2 (14–23 h) é acompanhada por um aumento lento na intensidade citoplasmática conforme o sensor residual é eliminado do núcleo, seguido por um rápido aumento na proporção de distribuição nuclear / citoplasmática na mitose (24 h).


Принцип метода анализа клеточного цикла на проточном цитометре

Последовательность событий клеточного цикла можно описать следующим образом: Переходя из состояния покоя (G0 фаза), клетка начинает расти и готовится к репликации хромосом (фаза G1). Клеточный цикл продолжается синтезом ДНК (S фаза), после которого наступает подготовка к де2фени (делени). Клеточный цикл завершается митозом (фаза H), после которой, получившиеся в результате клетки либо выходят из клеточного цикла, либо начинают его заново. Фаза митоза в свою очередь состоит из профазы, метафазы, анафазы и телофазы. Базовый анализ клеточного цикла на проточном цитометре основан на измерении количества ДНК в клетке, чтобы детектировать клетки на разных стадиях клеточного цикла.

Фазы клеточного цикла. Метод проточной цитометрии измеряет количество ДНК в клетке, чтобы определить фазу клеточного цикла на уровне каждой клетки. Гистограмма показывает количество клеток на каждой фазе клеточного цикла, при этом цвет указазалет укатом цвет.

Полезные ссылки
  • Реагенты для научных исследований
    • Cell Cycle Kit
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      • Coquetel de Anticorpo de Ativação Mieloide IOTest
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              RUO: Somente para uso em pesquisa. Данная продукция предназначена только для научных исследований и не предназназначена.
              LUO: Apenas para uso em laboratório. Продукция предназначена только для лабораторного использования.
              Без регуляторного статуса: Немедицинские изделия и изделия, не требующие обязатуса. Данная продукция не предназначена для клинического применения.


              Swiss Flow Escola de Citometria

              Propomos cursos online e presenciais.
              Adaptamos a nossa oferta às suas necessidades: fique à vontade para fazer sugestões!

              Curso introdutório e de atualização em citometria de fluxo

              Princípios de funcionamento de citômetro de fluxo, configuração e calibração, compensação, fluorescência e fluorocromos, métodos pré-analíticos, imunodetecção, análise de dados, estratégias para análise de amostras de sangue periférico, aplicações em imunologia.

              Curso on-line introdutório e de atualização em citometria de fluxo

              Reuniões interativas em pequenos grupos (cerca de 10 participantes) com partes teóricas seguidas de exercícios práticos e análises de prontuários. Tópicos: princípios básicos de citometria de fluxo, coloração multicolor simples, compensações, estratégias de passagem, análise de dados, aplicações mais comuns de citometria de fluxo em hematologia e imunologia.

              Curso : ONL_INTRO-17
              Duração : 6 sessões de 1,5 horas, duas vezes por semana
              Língua : Inglês
              Público-alvo : Qualquer pessoa que trabalhe na área biomédica sem nenhum conhecimento prévio de citometria de fluxo, usuários que não possuam os fundamentos da citometria de fluxo.
              Pré-requisitos : Conhecimentos básicos em biologia ou medicina.
              Objetivos dos cursos :
              Sessões:
              1. Introdução à citometria de fluxo - o que está por trás do gráfico de pontos.
              2. Princípios de funcionamento de um citômetro de fluxo: fluídica, óptica, eletrônica.
              3. Fluorocromos - como escolher o melhor para sua aplicação.
              4. Imunodetecção - anticorpos, coloração, imunofenotipagem.
              5. Estratégias de passagem - como analisar dados de citometria de fluxo.
              6. Configuração e compensação do instrumento.

              Os alunos aprenderão:
              • os princípios básicos da citometria de fluxo
              • como realizar experimentos simples de coloração multicolor com compensações adequadas.
              • como elaborar e aplicar várias estratégias de passagem para análise de dados.
              • as aplicações mais comuns de citometria de fluxo em hematologia e imunologia.

              Custos : Países em desenvolvimento: 300 CHF
              Alunos (Mestre, MD, PhD): 300 CHF
              Médicos, pesquisadores: 400 CHF
              Indústria Farmacêutica: 500 CHF

              Datas:
              Sessão I: 23 de novembro - 9 de dezembro de 2020, segundas e quartas-feiras. Datas exatas de cada sessão: 23.11, 25.11, 30.11, 02.12, 07.12, 09.12.

              Sessão II: 18 de janeiro - 4 de fevereiro de 2021, segundas e quintas-feiras. Datas exatas de cada sessão:
              18h01 e 21h01 às 13h - 14h30 (CET)
              25.01, 28.01, 01.02 e 04.02 às 8.30AM-10AM (CET)

              Aplicações avançadas de citometria de fluxo

              Design de painel multicolor, compensação e armadilhas de configuração, padronização e harmonização, testes funcionais (ciclo celular e análise de proliferação celular, estudo de apoptose), classificação de células.

              Aplicações avançadas ONLINE de citometria de fluxo

              Reuniões interativas em pequenos grupos (cerca de 10 participantes) com partes teóricas seguidas de exercícios práticos e análises de prontuários. Tópicos: compensação e configuração de armadilhas, painel multicolor, padronização, harmonização, ciclo celular, apoptose, análise de populações de células raras (incluindo células CAR-T).

              Curso : ONL_ADVANCED-18
              Duração : 6 sessões de 1,5 horas, duas vezes por semana, das 13h às 14h30 (CET)
              Língua : Inglês
              Público-alvo : Alunos de doutorado, pós-doutorandos, pesquisadores.
              Pré-requisitos : Estudos em biologia, biotecnologia, farmácia, imunologia, medicina ou disciplinas afins.
              Objetivos dos cursos :
              Sessões:
              1. Compensação e definição de armadilhas.
              2. Coloração multicolor.
              3. Padronização, CQ, harmonização.
              4. Análise do ciclo celular.
              5. Apoptose, proliferação celular.
              6. Análise de eventos raros, incluindo células CAR-T.

              Os participantes aprenderão:
              • para projetar painel multicolor.
              • padronizar e harmonizar citômetros de fluxo.
              • para estudar o ciclo celular e a apoptose.
              • como evitar compensação e definir armadilhas.
              • como analisar populações de células raras, incluindo células CAR-T.

              Custos : Países em desenvolvimento: 300 CHF
              Alunos (MD, PhD): 300 CHF
              Médicos, pesquisadores: 400 CHF
              Indústria Farmacêutica: 500 CHF

              Datas:
              26 de janeiro - 12 de fevereiro de 2021, terças e sextas-feiras.
              Datas exatas de cada sessão: 26.01, 29.01, 02.02, 05.02, 09.02, 12.02.
              Horário: 13h - 14h30 (CET)

              Citometria de fluxo para hematologistas e imunologistas

              Projeto de painel multicolor, harmonização e padronização de diferentes citômetros de fluxo, análise avançada de dados, hematopoiese e análise de células-tronco, populações de células imaturas e maduras, aplicações específicas em hematologia, estudos de caso detalhados.

              Diagnóstico de linfoma e detecção de MRD por citometria de fluxo

              Diferenciação normal de linfócitos B e T, fisiopatologia de linfomas, diagnóstico diferencial de linfomas de células B e T (classificação OMS 2016), princípios, estatísticas e aplicações práticas de detecção de MRD, análise de MRD em CLL e mieloma múltiplo, estudos de caso detalhados.

              Curso ONLINE de Linfoma e MRD

              Reuniões interativas em pequenos grupos (cerca de 10 participantes) com partes teóricas seguidas de exercícios práticos e análises de prontuários. Tópicos: diferenciação normal de linfócitos B e T, fisiopatologia de linfomas, diagnóstico diferencial de linfomas de células B e T (classificação OMS 2016), princípios, estatísticas e aplicações práticas de detecção de MRD, análise de MRD em CLL e mieloma múltiplo, estudos de caso detalhados .

              Curso : ONL_LYMPHOMA-16
              Duração : 6 sessões de 1,5 horas, duas vezes por semana, das 13h às 14h30 (CET)
              Língua : Inglês
              Público-alvo : Pesquisadores com interesse em linfomas, hematologistas, imunologistas.
              Pré-requisitos : Knowledge of basic principles of flow cytometry, background in hematology and/or cell biology.
              Courses objectives :
              Sessions – the application of the flow cytometry to study:
              1. Normal B cell maturation and B cell populations.
              2. B cell lymphomas.
              3. Normal T cell maturation and T cell populations.
              4. T and NK cell lymphomas.
              5. Plasma cells – normal and malignant.
              6. MRD detection in lymphomas.

              The participants will learn the basics of following topics:
              • how to elaborate and apply gating strategies for lymphocyte analysis.
              • how to use cytometry for the detection of normal B and T cells in lymphoid organs, peripheral blood and bone marrow.
              • how to diagnose B and T cell lymphomas using cytometry.
              • how to perform MRD detection for lymphomas.

              Custos : Developing Countries: 300 CHF
              Students (MD, PhD): 300 CHF
              Physicians, Researchers: 400 CHF
              Industry, Pharma: 500 CHF

              Datas:
              8th February – 4th March 2021, Mondays and Thursdays.
              Exact dates of each session: 8.02, 11.02, 15.02, 18.02, 01.03, 04.03.
              Time: 1PM-2.30PM (CET)

              Leukemia diagnosis and MRD detection by flow cytometry

              Normal hematopoiesis and its analysis by flow cytometry, analysis of stem cell population, differential diagnosis of acute leukemias using morphology and cytometry (WHO 2016 classification), data analysis, principles, statistics and practical applications of MRD detection analysis of MRD in acute leukemias, detailed case studies.

              ONLINE Leukemia and MRD course

              Interactive meetings in small groups (around 10 participants) with theoretical parts followed by practical exercises and analyses of patient files. Topics: normal hematopoiesis and its analysis by flow cytometry, differential diagnosis of acute leukemias using flow cytometry, data analysis, principles, statistics and practical applications of MRD detection analysis of MRD in acute leukemias, detailed case studies.

              Curso : ONL_LEUKEMIA-15
              Duration : 6 sessions of 1.5 hours, twice a week, 1PM-2.30PM (CET)
              Língua : Inglês
              Target Audience : Researchers with an interest in acute leukemias, hematologists, immunologists.
              Prerequisites : Knowledge of basic principles of flow cytometry, background in hematology and/or cell biology.
              Courses objectives : Sessions – the application of the flow cytometry to study:
              1. Normal hematopoiesis, stem cell compartment.
              2. B- and T-ALL (Acute Lymphoblastic Leukemia).
              3. AML (Acute Myeloid Leukemia).
              4. MDS (Myelodysplastic Syndrome).
              5. MRD (Minimal Residual Disease) – theory.
              6. MRD in ALL and AML.

              The participants will learn the basics of following topics:
              • how to use cytometry for the detailed analysis of normal hematopoiesis in peripheral blood and bone marrow samples.
              • how to diagnose acute leukemia (AML and ALL) as well as MDS using cytometry.
              • how to perform MRD detection in acute leukemia.

              Custos : Developing Countries: 300 CHF
              Students (MD, PhD): 300 CHF
              Physicians, Researchers: 400 CHF
              Industry, Pharma: 500 CHF

              Datas:
              3rd December 2020 – 19th January 2021, Tuesdays and Thursdays.
              Exact dates of each session: 03.12, 8.12, 10.12, 12.01, 14.01, 19.01.
              Time: 1PM-2.30PM (CET)

              Introduction to modern computational cytometry techniques

              The aim of this workshop is to introduce the participants to modern computational cytometry techniques. A mixture of theoretical and practical courses will show the participants how to set up a pipeline using the R programming language, including key steps such as data preprocessing and transformation, automated identification of cell populations with the FlowSOM algorithm and differential analysis of sample groups. No previous knowledge of R is assumed.


              Programm Curso : COMPUTING-11
              Duration : 2 days
              Língua : Inglês
              Target Audience : Cytometrists with experience in multicolor flow cytometry data analysis
              Prerequisites : Good working knowledge of data analysis with standard cytometry softwares (eg.: Kaluza, FlowJo, Infinicyt)
              Courses objectives : Introduction to modern computational cytometry techniques
              Setting up a pipeline using the R programming language, including key steps such as data preprocessing and transformation
              Automated identification of cell populations with the FlowSOM algorithm and differential analysis of sample groups.
              Custos : Public sector: 400 CHF
              Industry, pharma: 600 CHF
              Costs apply to registrations up to 2 weeks prior to course start later registrations will be more expensive.

              Autumn School of Cell Analysis in Immunology

              General review on applications of immunology analysis by flow cytometry, B-cells lymphopoiesis, development and pathology T cell phenotypes and subsets Assays for the assessment of T cell activation, proliferation, and function (Antigen specific response) Innate Lymphoid Cells Myeloid lineage, myelopoiesis and normal maturation pathways Phagocytosis, monitoring granulocyte reactivity and ROS production Flow cytometric analysis of human monocytes and dendritic cells Immunopathology and Sepsis, Immunoparalysis Hypersensitivity and Basophil degranulation tests Primary immunodeficiencies Multicolor panel design QC and standardisation Mass cytometry High-dimensional data analysis

              Curso : SPRING_SCHOOL-20
              Duration : 5 days, 40 hours of lectures and practicals
              Língua : Inglês
              Target Audience : Immunologists, Researchers, Clinical Biologists, PhD students, Lab assistants, R&D pharma
              Prerequisites : Knowledge of the basic principles of flow cytometry, strong background in immunology and/or cell biology or: Introductory course of flow cytometry
              Courses objectives : The students will learn:
              • to design and perform multicolor staining experiments
              • to analyse in depth specific cell populations of the innate and adaptive immune system
              • to perform current functional cytometric tests in immunology

              Custos : Developing Countries: 500 CHF
              Students (MD, PhD): 800 CHF
              Physicians, Researchers: 1200 CHF
              Industry, Pharma: 1500 CHF
              Costs apply to registrations up to 2 weeks prior to course start later registrations will be more expensive

              Certificate of Advanced Studies (CAS) in 2020/21

              Unique in Switzerland, this CAS allows the participants to acquire the necessary expertise in flow cytometry for the use of this technique in all diagnostic applications in hematology, immunology and oncology, as well as for research purposes in cellular biology, pharmacology, and microbiology. The course is composed of three modules with theoretical and practical lessons, followed by a written treatise and a written exam. Participants will obtain a “Certificate of Advanced Studies in Flow Cytometry”, issued by the University of Geneva.

              Flow cytometry for biomedical analystsHigher Professional Examination, Module Hematology

              Higher Swiss Professional Examination

              MRD detection by flow cytometry

              Principles and statistics of MRD detection analysis of MRD in CLL, multiple myeloma and acute leukemias detailed case studies analysis of paucicellular samples.

              Excellence workshop in PNH and MDS diagnosis

              Flow cytometry practice (set-up, calibration and compensation), pre-analytical methods and quality control, PNH clinics and pathophysiology, detection of PNH clones in red and white blood cells, high sensitivity testing, clinical data analysis, case studies, MDS analysis by cytometry.


              Introdução

              The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a popular model system, amenable to classic and molecular genetic analysis as well as biochemical and physiological studies [1]. The cell-cycle progression of fission yeast can be measured by flow cytometry, which is a powerful method to analyse many aspects of cell-cycle regulation for most organisms. However, because of two special features analysis of fission yeast cell growth by flow cytometry is not straightforward: First, under standard laboratory conditions the cytokinesis of fission yeast cells occurs at the end of S phase and for that reason cells in G1 and S phase are binuclear (Fig. 1). Cells in G1 phase contain two nuclei, each with a single, complete genome (termed 1C DNA) and these cells contain the same total amount of DNA (2C) as cells in G2 phase, which harbor their DNA in a single nucleus. Therefore, the discrimination of G1 cells from G2 cells is not straightforward by simple measurements of the cellular DNA content in a flow cytometer. Second, the fission yeast cells tend to form multimers by sticking together, thereby perturbing flow cytometric analyses of single-cell behaviour and of cell-cycle kinetics. Here we show how these problems can be solved. The methods presented are technically simple and available to most flow cytometry users. We also give examples of useful applications of the novel methods.

              The circle indicates the relative positions and durations of the different cell-cycle phases. The bodies outside the circle indicate the morphology of cells at the different phases and the numbers in parentheses show the subpopulations that they belong to (see Figure 2). The nuclei are indicated by dark spots.


              Bromodeoxyuridine (BrdU) and ethynyldeoxyuridine (EdU) assays measure the incorporation of BrdU or EdU into newly synthesized DNA during DNA replication. Unlike BrdU, which is detected using antibodies, EdU can be easily directly labeled, either with a fluorescent dye or biotin for colorimetric or fluorometric detection via streptavidin-HRP. Edu staining is consistent with further antibody staining, unlike the harsher BrdU protocol.

              DNA-staining dyes are commonly used in flow cytometry to measure the DNA content in cell populations and assay for cell cycle state. Propidium iodide is the mostly commonly used dye.

              Dye dilution assays

              The dyes in dye dilution assays are retained within cells over multiple generations. Daughter cells receive half of the dye of parent cells and assays are analyzed on a flow cytometer. Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) is the longest established dye.

              CFSE assay ab113853: Ex/Em 492/517 nm. Cytotoxic at higher concentrations. Flow cytometer.

              CytoLabel Blue ab176726: Ex/Em 403/454 nm. Flow cytometer, microscope.

              CytoLabel Green ab176735: Ex/Em 511/525 nm. Flow cytometer, microscope.

              CytoLabel Red ab176736: Ex/Em 628/643 nm. Flow cytometer, microscope.

              CytoLabel Orange ab176737: Ex/Em 542/556 nm. Flow cytometer, microscope.

              Protein markers

              For the analysis of cell proliferation within tissue samples, or sometimes within cell culture, it is common to use antibodies to stain for the presence of Ki67, PCNA, or MCM-2.

              Clonogenicity assays

              Although little used at high throughput, the classical method of assaying cell proliferation is to use a clonogenic/clonogenicity assay. In this assay, cells are plated out at a low density and then the number of colonies formed is counted.

              Senescence assays

              The most common marker of senescent cells is the overexpression and accumulation of the endogenous lysosomal beta-galactosidase (SA-beta-gal). Beta-gal activity is detected using a colorimetric or fluorometric substrate.

              Learn more with our:

              Cell viability assay guide
              Measure the rate of continuing cellular activities, such as metabolism.

              Cytotoxicity assay guide
              Test for cell membrane damage, either by measuring the leakage of cellular enzymes or staining with membrane-impermeable dyes.

              Apoptosis assay / cell death analysis guide
              Measure the markers present in different types of cell death.


              Assista o vídeo: Curso de Inverno Online 2020 - Citometria de Fluxo - Luis Felipe - Ep 24 (Dezembro 2022).